雍蘇南，房赤，任衛(wèi)瓊，劉林，蔣麗，喻珮，劉建和

湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007

高血壓是我國患病人數(shù)最多的慢性非傳染性疾病之一，我國現(xiàn)有高血壓患者2.445億[1]，其常引起心、腦、腎等多器官功能破壞，是導(dǎo)致居民死亡的重要危險因素。血管內(nèi)皮作為血管平滑肌和血液的重要機械屏障，可分泌多種血管收縮因子和舒張因子，以維持血管生理功能和正常血壓[2]。線粒體是保證內(nèi)皮細(xì)胞正常功能最基本的細(xì)胞器之一，線粒體自噬失衡時，內(nèi)皮細(xì)胞活性氧（ROS）產(chǎn)生增加，炎癥加重，導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙，從而引發(fā)血管舒縮功能異常、血管重塑，導(dǎo)致血壓升高[3]。天麻芎苓止眩片為湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，基于高血壓病“虛、瘀、風(fēng)”病機，以平肝熄風(fēng)、健脾逐瘀為治法創(chuàng)制，臨床使用多年，能明顯降低原發(fā)性高血壓肝火亢盛、痰熱內(nèi)蘊證患者血壓，改善臨床癥狀，降低中醫(yī)證候積分[4]。動物實驗顯示，天麻芎苓止眩片可維持血管炎癥穩(wěn)態(tài)，保護內(nèi)皮功能[5]?；诖?，本研究觀察天麻芎苓止眩片對自發(fā)性高血壓大鼠線粒體自噬的影響，進一步探討其治療高血壓病的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雄性自發(fā)性高血壓大鼠30只，體質(zhì)量210～235 g；SPF級雄性正常血壓大鼠（Wistar-Kyoto）10只，體質(zhì)量212～238 g，均由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司上海分公司提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（滬）2017-0011。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實驗動物中心標(biāo)準(zhǔn)動物房，使用許可證號SYXK（湘）2015-0003。本研究經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)（ZYFY20200518-02）。

1.2 藥物及制備

天麻芎苓止眩片（天麻15 g，鉤藤15 g，川芎10 g，野菊花12 g，茯苓15 g，法半夏6 g，牡蠣6 g，地龍15 g，羅布麻18 g，酸棗仁9 g，香附10 g，丹參15 g，甘草6 g），由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室提供，批號20210812，0.46 g/片，用超純水配制成0.1 g/mL溶液?？ㄍ衅绽?，中美上海施貴寶有限公司，批號20210823，12.5 mg/片，用超純水配制成0.76 mg/mL溶液。

1.3 主要試劑與儀器

大鼠ROS、丙二醛（MDA）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）ELISA試劑盒（武漢賽培，批號分別為SP13358、SP30131、SP13470、SP12914、SP12673），PTEN誘導(dǎo)假定激酶1（PINK1）、E3泛素連接酶（Parkin）、Beclin1一抗（美國Proteintech公司，貨號分別為23274-1-AP、14060-1-AP、11306-1-AP），GAPDH抗體（武漢貝茵萊，貨號PAB36269），Trizol試劑（美國Invitrogen公司，貨號15596018），反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RTqPCR mix（美國Promega公司，貨號分別為A3500、A6001）。

智能無創(chuàng)血壓計（北京軟隆科技有限公司，型號BP2010），全自動酶標(biāo)分析儀（北京普朗新技術(shù)有限公司，型號DNM-9602），生物組織石蠟包埋機（孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司，型號YB-8LF），透射電鏡（日立公司，型號HT7700），圖像采集系統(tǒng)（日本Olympus，型號BX50），電泳儀（北京六一儀器廠，型號DYY-6C），全自動化學(xué)發(fā)光分析儀（上海天能科技有限公司，型號Tanon-5200），定量PCR儀（美國Bio-Rad公司，型號CFX Connect）。

1.4 分組及給藥

采用分層隨機法將30只自發(fā)性高血壓大鼠分為模型組、西藥組和中藥組，每組10只，將10只Wistar-Kyoto大鼠作為正常組。中藥組以1.0 g/kg灌胃天麻芎苓止眩片溶液，西藥組以7.6 mg/kg灌胃卡托普利溶液，正常組和模型組予蒸餾水灌胃，體積10 mL/kg，每日1次，連續(xù)6周。

1.5 指標(biāo)檢測

1.5.1 收縮壓測量

分別于給藥前及給藥各周第7日9:00—11:00采用智能無創(chuàng)血壓計測量大鼠平靜狀態(tài)下尾動脈收縮壓，保證相同實驗條件，每只大鼠連續(xù)測量3次，取平均值。

1.5.2 血清氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測

干預(yù)結(jié)束后24 h，3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，開腹，取下腔靜脈血，3500 r/min離心15 min，收集血清，按照ELISA試劑盒說明書檢測血清ROS、MDA、CAT、SOD、GSH含量。

1.5.3 胸主動脈形態(tài)觀察

取血后分離大鼠胸主動脈，置于10%福爾馬林溶液中固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，制成厚度5 μm切片，于45 ℃恒溫箱中烘干，脫蠟復(fù)水，經(jīng)HE染色、透明、封片后，顯微鏡下觀察胸主動脈組織形態(tài)。

1.5.4 透射電鏡觀察

切取大鼠胸主動脈組織，置于2.5%戊二醛預(yù)固定，1%鋨酸后固定，丙酮、環(huán)氧樹脂脫水，聚合包埋箱聚合后，制成60 nm超薄切片，經(jīng)醋酸鈾、枸櫞酸鉛避光染色，透射電鏡觀察線粒體結(jié)構(gòu)及自噬體數(shù)目。

1.5.5 免疫組化染色

石蠟切片70 ℃烤片2 h，經(jīng)脫蠟、水洗后，高溫高壓法進行組織修復(fù)，3%過氧化氫溶液去除過氧化物酶，滴加PINK1、Parkin、Beclin1一抗（均為1∶100），4 ℃孵育24 h，PBS洗滌后，滴加二抗，37 ℃孵育20 min，DAB顯色5 min，蘇木素復(fù)染，脫水、透明后，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察，以棕黃色顆粒為陽性表達(dá)，Adobe Photoshop圖像分析軟件計算陽性表達(dá)的積分光密度（IOD）。

1.5.6 Western blot檢測

胸主動脈組織加入RIPA裂解液提取總蛋白，4 ℃、12000×g離心10 min，收集上清液，BCA法測定蛋白濃度，凝膠電泳后，200 mA轉(zhuǎn)膜（PVDF膜）1 h，使用5%脫脂牛奶（0.5%TBST配制）封閉1 h，加入PINK1、Parkin、Beclin1一抗（均為1∶1000）、GAPDH一抗（1∶5000），4 ℃孵育過夜，加入二抗（1∶3000），室溫孵育30 min，洗膜，ECL顯影，以GAPDH為內(nèi)參，AlphaEase FC軟件分析目的蛋白相對灰度值。

1.5.7 RT-qPCR檢測

胸主動脈組織加入Trizol試劑，4 ℃勻漿20 s，加入氯仿200 μL，搖勻，室溫靜置2 min，4 ℃、12000 ×g離心10 min，取上清液，加入等體積異丙醇，靜置、離心后，加入75%乙醇1 mL漂洗沉淀，離心2次，加入DNase/RNase-Free Water 40 μL溶解RNA，按試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR條件：95 ℃、3 min，95 ℃、3 s，56 ℃、10 s，72 ℃、25 s，共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS24.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以±s表示，多組間比較服從正態(tài)分布且方差齊用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；不符合正態(tài)分布或方差不齊采用秩和檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 天麻芎苓止眩片對自發(fā)性高血壓大鼠收縮壓的影響

與同一時點正常組比較，模型組大鼠收縮壓顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與同一時點模型組比較，西藥組給藥第1周收縮壓開始下降，中藥組給藥第3周收縮壓開始下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且中藥組收縮壓高于西藥組（P＜0.05），給藥第5、6周，中藥組與西藥組收縮壓差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠不同時點收縮壓比較（±s，mm Hg）

表2 各組大鼠不同時點收縮壓比較（±s，mm Hg）

注：1 mm Hg=0.133 kPa；與同一時點正常組比較，*P＜0.05；與同一時點模型組比較，#P＜0.05；與同一時點西藥組比較，▲P＜0.05

組別正常組模型組西藥組中藥組給藥第6周117.39±10.21206.19±15.25*131.84±14.08#134.58± 8.53#只數(shù)1010 1010給藥前118.11± 8.03185.77±27.45*176.38±11.87179.70±12.20給藥第1周118.39±12.26189.82±18.33*160.55±10.81#177.98± 9.58▲給藥第2周115.52± 6.43183.00±16.30*145.20± 8.72#172.92± 9.50▲給藥第3周120.19±11.24187.82±20.42*140.13± 9.31#162.46±17.82#▲給藥第4周117.80± 5.45195.03±24.76*136.66± 8.92#150.52±10.85#▲給藥第5周114.49± 4.83200.25±28.49*135.62±14.30#138.55±13.33#

2.2 天麻芎苓止眩片對自發(fā)性高血壓大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清ROS、MDA含量顯著升高，CAT、SOD、GSH含量顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，西藥組和中藥組大鼠血清ROS、MDA含量顯著降低，CAT、SOD、GSH含量顯著升高（P＜0.05）；中藥組與西藥組CAT、SOD、GSH差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠血清ROS、MDA、CAT、SOD、GSH含量比較（±s）

表3 各組大鼠血清ROS、MDA、CAT、SOD、GSH含量比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與西藥組比較，▲P＜0.05

GSH/（nmol/L）131± 6.2176.71±10.37*103.49±11.32#116.86± 7.65#▲組別正常組模型組西藥組中藥組只數(shù)1010 1010 ROS/（U/mL）39.47±15.6574.67±10.29*53.53±11.93#50.64±13.54#MDA/（nmol/mL）3.92±0.429.82±0.31*6.37±0.49#6.76±0.51#CAT/（U/mL）12.35±0.576.21±0.36*9.12±0.43#8.87±0.53#▲SOD/（U/mg）142.65±8.6586.27±7.41*126.46±8.32#116.45±9.79#▲

2.3 天麻芎苓止眩片對自發(fā)性高血壓大鼠胸主動脈組織形態(tài)的影響

正常組胸主動脈組織血管平滑肌細(xì)胞排列規(guī)則，內(nèi)膜較完整，管壁未見增厚；與正常組比較，模型組胸主動脈組織平滑肌細(xì)胞增生肥大、排列欠規(guī)則，內(nèi)膜粗糙、缺損，管壁增厚；與模型組比較，西藥組和中藥組胸主動脈組織平滑肌細(xì)胞增生減少、排列較規(guī)則，管壁厚度接近正常。見圖1。

圖1 各組大鼠胸主動脈組織形態(tài)（HE染色， ×400）

2.4 天麻芎苓止眩片對自發(fā)性高血壓大鼠胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)及自噬體數(shù)目的影響

正常組胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)較完整，線粒體嵴明顯，無空泡；模型組胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞線粒體明顯腫脹，內(nèi)部嵴結(jié)構(gòu)破壞或消失，可見大量包裹自噬溶酶體的自噬泡及少量自噬體；與模型組比較，西藥組胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞可見少量正常線粒體，自噬泡減少，中藥組胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞線粒體損傷明顯改善，可見少量包裹自噬溶酶體的自噬泡。見圖2。

2.5 天麻芎苓止眩片對自發(fā)性高血壓大鼠胸主動脈組織PTEN誘導(dǎo)假定激酶1、E3泛素連接酶、Beclin1蛋白表達(dá)的影響

免疫組化染色顯示，正常組胸主動脈組織未見明顯棕黃色染色；與正常組比較，模型組胸主動脈組織PINK1、Parkin、Beclin1蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，西藥組和中藥組胸主動脈組織PINK1、Parkin、Beclin1蛋白表達(dá)均顯著降低（P＜0.05），中藥組與西藥組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3、表4。

圖3 各組大鼠主動脈組織PINK1、Parkin、Beclin1陽性表達(dá)（免疫組化染色，×400）

表4 各組大鼠胸主動脈組織PINK1、Parkin、Beclin1蛋白表達(dá)比較（±s，IOD）

表4 各組大鼠胸主動脈組織PINK1、Parkin、Beclin1蛋白表達(dá)比較（±s，IOD）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

組別正常組模型組西藥組中藥組Beclin128.81± 3.65126.19±26.72*78.54± 7.63#92.56±15.39#只數(shù)1010 1010 PINK1204.36± 25.63601.86±108.54*346.59± 53.19#317.18± 41.11#Parkin 73.37± 16.88528.01±119.21*129.10± 41.64#119.87± 19.21#

Western blot結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組胸主動脈組織PINK1、Parkin、Beclin1蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，西藥組和中藥組胸主動脈組織PINK1、Parkin、Beclin1蛋白表達(dá)均顯著降低（P＜0.05），中藥組與西藥組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖4、表5。

圖4 各組大鼠胸主動脈組織PINK1、Parkin、Beclin1蛋白免疫印跡

表5 各組大鼠胸主動脈組織PINK1、Parkin、Beclin1蛋白表達(dá)比較（±s，相對灰度值）

表5 各組大鼠胸主動脈組織PINK1、Parkin、Beclin1蛋白表達(dá)比較（±s，相對灰度值）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

Beclin11.01±0.104.01±0.15*2.03±0.13#2.86±0.10#組別正常組模型組西藥組中藥組只數(shù)1010 1010 PINK11.03±0.083.54±0.72*2.42±0.52#2.18±0.41#Parkin 0.96±0.064.16±0.69*2.76±0.53#2.13±0.46#

2.6 天麻芎苓止眩片對自發(fā)性高血壓大鼠胸主動脈組織PTEN誘導(dǎo)假定激酶1、E3泛素連接酶、Beclin1 mRNA表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組胸主動脈組織PINK1、Parkin、Beclin1 mRNA表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，西藥組和中藥組胸主動脈組織PINK1、Parkin、Beclin1 mRNA表達(dá)顯著降低（P＜0.05），中藥組與西藥組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表6。

表6 各組大鼠胸主動脈組織PINK1、Parkin、Beclin1 mRNA表達(dá)比較（±s）

表6 各組大鼠胸主動脈組織PINK1、Parkin、Beclin1 mRNA表達(dá)比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

Beclin11.17±0.092.19±0.64*1.71±0.32#1.35±0.09#組別正常組模型組西藥組中藥組只數(shù)1010 1010 PINK11.02±0.256.40±1.08*2.71±0.94#2.22±0.41#Parkin 1.00±0.107.42±1.08*2.26±0.42#1.96±0.38#

3 討論

根據(jù)臨床癥狀，高血壓病屬中醫(yī)學(xué)“眩暈”“頭痛”等范疇。臨床研究發(fā)現(xiàn)，“虛、瘀、風(fēng)”的病機狀態(tài)貫穿高血壓病始終[6-7]，天麻芎苓止眩片對高血壓病有多成分、多靶點、多途徑的干預(yù)效果[4-5]。方中天麻味甘、性平，歸肝經(jīng)，可熄風(fēng)止痙、平抑肝陽、祛風(fēng)通絡(luò)；鉤藤、川芎清熱熄風(fēng)、活血行氣；茯苓、法半夏、野菊花健脾化痰、平肝清熱；地龍、香附、丹參疏肝理氣、祛瘀通絡(luò)；牡蠣、羅布麻、酸棗仁滋陰潛陽、養(yǎng)肝清熱；甘草調(diào)和諸藥。諸藥相伍，在平肝熄風(fēng)同時健運脾氣、清熱化痰、祛瘀通絡(luò)。前期研究表明，天麻芎苓止眩片可降低血清白細(xì)胞介素（IL）-1、IL-10含量，降低胸主動脈組織Atg8、LC3表達(dá)，調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶-2、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子2表達(dá)，從而恢復(fù)自噬穩(wěn)態(tài)、減輕內(nèi)皮損傷、逆轉(zhuǎn)血管重塑、降低血壓[5，8-9]。本研究觀察到，模型組大鼠胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)破壞，出現(xiàn)大量自噬泡和自噬體，血清ROS、MDA含量升高，CAT、SOD、GSH含量降低，說明高血壓狀態(tài)下線粒體自噬明顯。天麻芎苓止眩片干預(yù)后，模型大鼠血壓顯著降低，血清ROS、MDA含量降低，CAT、SOD、GSH含量升高，胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞線粒體損傷明顯改善，自噬泡和自噬體數(shù)目減少，表明天麻芎苓止眩片可減輕氧化應(yīng)激，調(diào)節(jié)線粒體過度自噬，保護內(nèi)皮功能。

內(nèi)皮損傷是高血壓病內(nèi)皮細(xì)胞被激活的典型特征[10]，包括血管通透性增加、氧化應(yīng)激水平升高、不同內(nèi)皮來源信使的釋放失衡，以及血栓前和促炎表型等，而內(nèi)皮細(xì)胞線粒體自噬失衡是內(nèi)皮損傷的關(guān)鍵機制之一[11-12]。PINK1/Parkin通路是研究線粒體自噬相關(guān)疾病的經(jīng)典通路[13-14]。生理狀態(tài)下，磷酸酶與張力蛋白同源物將PINK1誘導(dǎo)進入線粒體后降解。在健康線粒體中，由于轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)和蛋白水解的快速降解，PINK1維持在低水平。在受損線粒體中，線粒體膜去極化后損傷部分被暴露出來，PINK1在去極化的膜表面大量聚集并募集Parkin，PINK1在Ser65位點對Parkin進行磷酸化，活化的Parkin促使線粒體表面蛋白泛素化，持續(xù)聚集p62，最后經(jīng)p62-LC3進入自噬-溶酶體系統(tǒng)降解[15]。Beclin1是哺乳動物主要的自噬調(diào)節(jié)基因，在自噬初始階段，其通過與PI3KC3結(jié)合參與自噬體形成，從而起到關(guān)鍵作用[16]。線粒體過度自噬時，小鼠血管內(nèi)皮功能受損，導(dǎo)致主動脈收縮功能下降，Beclin1表達(dá)也明顯上升[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠胸主動脈組織PINK1、Parkin、Beclin1蛋白和mRNA表達(dá)顯著升高，經(jīng)天麻芎苓止眩片干預(yù)后，模型大鼠胸主動脈組織PINK1、Parkin、Beclin1蛋白和mRNA表達(dá)顯著降低，表明其可能通過調(diào)控PINK1/Parkin通路調(diào)節(jié)線粒體過度自噬，減輕氧化應(yīng)激損傷。

綜上，天麻芎苓止眩片可能通過調(diào)節(jié)PINK1/Parkin通路介導(dǎo)的線粒體自噬逆轉(zhuǎn)血管內(nèi)皮氧化應(yīng)激損傷，維持血管內(nèi)皮功能穩(wěn)態(tài)，從而發(fā)揮降壓作用。