柳榮 ，王佳慧 ，楊霞 ，高艷奎 ，劉苗 ，梁永林 ，朱向東

1.甘肅中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730000； 2.寧夏醫(yī)科大學中醫(yī)學院，寧夏 銀川 750000

糖尿病是常見的代謝紊亂性疾病之一，以血糖升高為主要特征[1]。糖尿病可導致多種并發(fā)癥，如視網(wǎng)膜病變、周圍神經(jīng)病變、糖尿病腎病、糖尿病足等，給患者造成極大的身體和精神損傷，嚴重影響生活質(zhì)量[2]。超過90%糖尿病患者為2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM），其特征是胰島β細胞分泌胰島素減少、胰島素抵抗和代償性胰島素分泌不足[1]。除葡萄糖可調(diào)控胰島素分泌外，許多激素如胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）可以通過胰島β細胞上的G蛋白偶聯(lián)受體影響下游環(huán)磷腺苷（cAMP）/蛋白激酶A（PKA）/cAMP效應元件結合蛋白（CREB）通路，調(diào)節(jié)胰腺功能[3]。

糖尿病屬中醫(yī)學“消渴”范疇，其中肥胖型T2DM屬“脾癉”范疇?！捌D”多由過食肥甘厚味，損傷脾胃，積熱內(nèi)蘊所致，其病機為中滿內(nèi)熱[4]。葛根芩連湯出自《傷寒論》，由葛根、黃芩、黃連、甘草組成，具有解表清里功效，主治濕熱下痢?，F(xiàn)代醫(yī)家使用葛根芩連湯治療肥胖型T2DM效果明顯[4-5]。研究表明，葛根芩連湯可調(diào)節(jié)T2DM糖脂代謝、恢復胰島β細胞功能、改善胰島素抵抗、調(diào)節(jié)腸道菌群等[6-8]。加味葛根芩連湯是在原方基礎上加干姜而成，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，加味葛根芩連湯可通過降低T2DM模型大鼠盲腸組織膽鹽水解酶水平、增加血液?；?β-鼠膽酸含量調(diào)控法尼醇X受體，影響糖尿病肝糖異生[9]。但其是否通過調(diào)控G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體5（TGR5）刺激cAMP/PKA/CREB信號通路，進而調(diào)控GLP-1分泌，影響胰腺功能，尚不清楚?；诖耍緦嶒灮赑KA/CREB/GLP-1信號通路觀察加味葛根芩連湯對肥胖型T2DM模型小鼠胰腺損傷的影響，探討其治療T2DM的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

清潔級7周齡雄性db/db小鼠50只、雄性m/m小鼠10只，常州卡文斯實驗動物有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（蘇）2016-0010。常規(guī)飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學實驗動物中心SPF級屏障實驗室，12 h/12 h明暗交替，溫度21～25 ℃，濕度50%～60%，自由飲水攝食。本實驗經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學動物實驗倫理委員會批準（2020-274）。

1.2 藥物及制備

加味葛根芩連湯（葛根24 g，黃芩9 g，黃連9 g，炙甘草6 g，干姜1.5 g），飲片購自蘭州惠仁堂大藥房，由甘肅中醫(yī)藥大學中藥鑒定中心鑒定為正品。將飲片加入蒸餾水浸泡30 min，先煎葛根30 min，再加入其余藥物共煎30 min，重復1次，合并濾液，制成含原藥材2 g/mL藥液。鹽酸二甲雙胍，上海九鼎化學科技有限公司，批號YKCFZOB，100 g/瓶，將鹽酸二甲雙胍溶于蒸餾水，制成2 g/mL溶液。

1.3 主要試劑與儀器

兔免疫組化試劑盒，中國中杉金橋公司，貨號SP-9001；小鼠免疫組化試劑盒，中國中杉金橋公司，貨號SP-9002；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，日本TaKaRa公司，貨號RR047A；熒光定量試劑盒，日本TaKaRa公司，貨號RR820A；TGR5、PKA、p-PKAThr197、p-CREBSer133、CREB、前蛋白轉(zhuǎn)化酶1/3（PC1/3）、神經(jīng)源性分化因子1（NeuroD1）抗體，英國Abcam公司，貨號分別為ab72608、ab216572、ab59218、ab32096、ab32515、ab220363、ab205300；GLP-1抗體，美國ImmunoWay公司，貨號YM6182。

血糖儀（德國羅氏公司，型號Accu-Chek?Performa），糖化血紅蛋白儀（中國三諾生物傳感股份有限公司，型號A1CNow+），高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司，型號5424R），切片機（德國LEICA公司，型號2016），免疫組化分析系統(tǒng)（中國泰盟軟件有限公司，型號BI2000），多功能酶標儀（中國美谷分子儀器有限公司，型號SpectraMax?i3x），PCR儀（加拿大楓嶺國際有限公司，型號FTC-8000P）。

1.4 分組及給藥

db/db小鼠適應性飼養(yǎng)1周后，將2日隨機血糖≥16.7 mmol/L的小鼠采用隨機數(shù)字表法分為模型組、二甲雙胍組和加味葛根芩連湯高、中、低劑量組，每組10只。另取10只m/m小鼠作為空白組。加味葛根芩連湯高、中、低劑量組分別予加味葛根芩連湯藥液31.9、19.1、6.4 g/kg灌胃（根據(jù)小鼠體質(zhì)量調(diào)整灌胃體積），二甲雙胍組予鹽酸二甲雙胍溶液0.2 g/kg灌胃，空白組和模型組灌胃等體積蒸餾水，每日1次，連續(xù)12周。

1.5 糖代謝相關指標檢測

給藥結束后，小鼠禁食不禁水8 h以上，使用血糖儀檢測小鼠空腹血糖（FBG）。次日使用糖化血紅蛋白儀檢測小鼠糖化血紅蛋白（HbA1c）含量。小鼠禁食不禁水12 h，進行口服葡萄糖耐量試驗：予小鼠50%葡萄糖溶液1 g/kg灌胃，0、15、30、60、90、120 min后尾尖采血檢測血糖。

1.6 取材

口服葡萄糖耐量試驗后，小鼠禁食不禁水24 h，摘眼球取血，4 ℃、3500 r/min離心10 min，分離血清。麻醉后剖腹，迅速分離胰腺組織，一部分置于4%多聚甲醛中固定，用于免疫組化及免疫熒光染色，另一部分經(jīng)生理鹽水沖洗后凍存，用于RT-qPCR檢測。

1.7 TUNEL染色

取出固定的胰腺組織，石蠟包埋并切片，脫蠟，滴加Proteinase K工作液孵育30 min，PBS洗滌，1×平衡緩沖液37 ℃孵育1 h，PBS洗滌，室溫避光PI染色，PBS洗滌，熒光顯微鏡下觀察胰腺組織細胞凋亡情況，計算細胞凋亡率（凋亡細胞數(shù)÷總細胞數(shù)×100%）。

1.8 RT-qPCR檢測

Trizol法提取胰腺組織總RNA，檢測RNA純度及濃度，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR反應體系：TB GreenPremix Ex TaqⅡ 10 μL、上下游引物各0.8 μL、cDNA 2 μL、RNase Free ddH2O 6.4 μL。反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設計合成。引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.9 免疫組化染色

胰腺組織石蠟切片脫蠟水化，熱抗原修復，加血清封閉1 h，甩干封閉液，滴加一抗（TGR51∶100、PKA 1∶200、p-PKAThr1971∶100、CREB 1∶500、p-CREBSer1331∶200、PC1/31∶500、GLP-11∶200），4 ℃孵育過夜，滴加生物素標記二抗孵育30 min，滴加鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復染，分化，脫水，透明，封片，顯微鏡下觀察，分析陽性表達的平均光密度。

1.10 免疫熒光染色

胰腺組織石蠟切片滴加枸櫞酸修復液進行抗原修復，PBS沖洗，0.2%Triton X-100透膜，PBS沖洗，滴加血清封閉1 h，PBS沖洗，分別滴加TGR5一抗（1∶50）、NeuroD1一抗（1∶200）、GLP-1一抗（1∶200），4 ℃孵育過夜，PBS沖洗，滴加熒光二抗，室溫避光孵育1 h，PBS沖洗，加入DAPI避光孵育15 min，PBS沖洗，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察TGR5/GLP-1、NeuroD1/GLP-1共表達，分析陽性表達的熒光強度。

1.11 統(tǒng)計學方法

采用SPSS24.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料符合正態(tài)分布以±s表示，組間比較采用方差分析，方差齊用LSD檢驗，方差不齊用Tamhane's T2檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 加味葛根芩連湯對模型小鼠糖代謝的影響

與空白組比較，模型組小鼠FBG、HbA1c含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，二甲雙胍組和葛根芩連湯高、中劑量組小鼠FBG、HbA1c含量顯著降低（P＜0.01，P＜0.05）。見表2。

表2 各組小鼠FBG、HbA1c含量比較（±s）

表2 各組小鼠FBG、HbA1c含量比較（±s）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

組別空白組模型組二甲雙胍組加味葛根芩連湯高劑量組加味葛根芩連湯中劑量組加味葛根芩連湯低劑量組HbA1c/%4.30±0.1812.63±0.40**6.88±0.75▲▲9.07±0.55▲▲9.82±0.41▲▲10.98±1.18▲▲只數(shù)劑量/（g/kg）6666660.231.919.16.4 FBG/（mmol/L）6.18±1.3732.00±0.59**28.35±1.67▲▲27.77±1.96▲▲30.12±1.23▲30.95±0.71

各組小鼠灌胃葡萄糖溶液后，血糖于15～30 min達到最高值。整個過程中，與空白組比較，模型組小鼠血糖顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，灌胃60、120 min后二甲雙胍組和加味葛根芩連湯高、中劑量組小鼠血糖顯著降低（P＜0.01，P＜0.05），且隨加味葛根芩連湯劑量增加，血糖有降低趨勢。見表3。

表3 各組小鼠口服葡萄糖耐量試驗各時點血糖比較（±s，mmol/L）

表3 各組小鼠口服葡萄糖耐量試驗各時點血糖比較（±s，mmol/L）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

組別空白組模型組二甲雙胍組加味葛根芩連湯高劑量組加味葛根芩連湯中劑量組加味葛根芩連湯低劑量組120 min 4.93±0.2729.75±1.28**21.35±2.72▲▲22.32±3.71▲▲25.50±3.62▲▲29.15±0.55只數(shù)劑量/（g/kg）6666660.231.919.16.40 min 3.62±0.6316.12±2.56**15.63±2.0515.72±2.7116.42±2.1315.50±1.6815 min 9.62±1.6529.97±1.19**26.32±4.49▲31.93±0.7931.25±1.6729.75±2.2230 min 8.98±2.3732.27±0.62**30.90±2.0732.25±0.4132.50±0.4332.32±0.6060 min 7.00±0.8631.07±0.48**27.67±2.06▲▲28.25±2.58▲▲29.27±1.10▲30.13±0.67

2.2 加味葛根芩連湯對模型小鼠胰腺組織細胞凋亡的影響

與空白組比較，模型組小鼠胰腺組織細胞凋亡率顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠胰腺組織細胞凋亡率顯著降低（P＜0.01）。見圖1、表4。

圖1 各組小鼠胰腺組織細胞凋亡情況（TUNEL染色，×200）

表4 各組小鼠胰腺組織細胞凋亡率比較（±s，%）

表4 各組小鼠胰腺組織細胞凋亡率比較（±s，%）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，▲▲P＜0.01

凋亡率2.00±0.347.70±0.38**3.32±0.44▲▲3.76±0.32▲▲4.50±0.01▲▲5.08±0.19▲▲組別空白組模型組二甲雙胍組加味葛根芩連湯高劑量組加味葛根芩連湯中劑量組加味葛根芩連湯低劑量組只數(shù)劑量/（g/kg）6666660.231.919.16.4

2.3 加味葛根芩連湯對模型小鼠胰腺組織G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體5、蛋白激酶A、環(huán)磷腺苷效應元件結合蛋白、激素原轉(zhuǎn)化酶1/3、胰高血糖素樣肽-1 mRNA表達的影響

與空白組比較，模型組小鼠胰腺組織TGR5、PKA、CREB、PC1/3、GLP-1 mRNA表達顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，除加味葛根芩連湯低劑量組TGR5 mRNA外，各給藥組小鼠胰腺組織TGR5、PKA、CREB、PC1/3、GLP-1 mRNA表達顯著升高（P＜0.01，P＜0.05）。見表5。

表5 各組小鼠胰腺組織TGR5、PKA、CREB、PC1/3、GLP-1 mRNA表達比較（±s）

表5 各組小鼠胰腺組織TGR5、PKA、CREB、PC1/3、GLP-1 mRNA表達比較（±s）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

組別空白組模型組二甲雙胍組加味葛根芩連湯高劑量組加味葛根芩連湯中劑量組加味葛根芩連湯低劑量組GLP-11.00±0.060.09±0.02**0.74±0.04▲▲0.46±0.03▲▲0.03±0.05▲▲0.19±0.02▲▲只數(shù)劑量/（g/kg）6666660.231.919.16.4 TGR51.00±0.040.10±0.01**0.67±0.04▲▲0.44±0.02▲▲0.20±0.02▲▲0.13±0.02 PKA 1.00±0.030.06±0.01**0.67±0.03▲▲0.41±0.02▲▲0.25±0.02▲▲0.10±0.01▲CREB 1.00±0.020.05±0.01**0.59±0.02▲▲0.37±0.03▲▲0.25±0.02▲▲0.10±0.01▲PC1/31.00±0.030.10±0.01**0.89±0.04▲▲0.59±0.03▲▲0.34±0.03▲▲0.17±0.02▲▲

2.4 加味葛根芩連湯對模型小鼠胰腺組織G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體5、蛋白激酶A、環(huán)磷腺苷效應元件結合蛋白、激素原轉(zhuǎn)化酶1/3、胰高血糖素樣肽-1蛋白表達的影響

與空白組比較，模型組小鼠胰腺組織TGR5、PKA、p-PKA、CREB、p-CREB、PC1/3、GLP-1蛋白表達顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，除加味葛根芩連湯中劑量組p-PKA及加味葛根芩連湯低劑量組PKA、p-PKA、CREB、p-CREB蛋白外，各給藥組小鼠胰腺組織TGR5、PKA、p-PKA、CREB、p-CREB、PC1/3、GLP-1蛋白表達均顯著升高（P＜0.01，P＜0.05）。見圖2、表6。

圖2 各組小鼠胰腺組織TGR5、PKA、p-PKA、CREB、p-CREB、PC1/3、GLP-1陽性表達（免疫組化染色，×200）

表6 各組小鼠胰腺組織TGR5、PKA、CREB、PC1/3、GLP-1蛋白表達比較（±s，平均光密度）

表6 各組小鼠胰腺組織TGR5、PKA、CREB、PC1/3、GLP-1蛋白表達比較（±s，平均光密度）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

組別空白組模型組二甲雙胍組加味葛根芩連湯高劑量組加味葛根芩連湯中劑量組加味葛根芩連湯低劑量組GLP-11.00±0.110.20±0.04**0.91±0.09▲▲0.78±0.06▲▲0.51±0.07▲▲0.34±0.05▲只數(shù)666666 TGR51.00±0.040.14±0.02**0.88±0.04▲▲0.87±0.04▲▲0.65±0.04▲▲0.48±0.03▲▲PKA 1.00±0.090.23±0.03**0.98±0.05▲▲0.89±0.06▲▲0.51±0.05▲▲0.26±0.02 p-PKA 1.00±0.070.28±0.05**0.85±0.08▲▲0.62±0.06▲▲0.38±0.050.31±0.03 CREB 1.00±0.130.23±0.04**0.91±0.14▲▲0.85±0.13▲▲0.54±0.08▲▲0.32±0.05 p-CREB 1.00±0.100.19±0.02**0.69±0.05▲▲0.57±0.09▲▲0.37±0.03▲▲0.22±0.03 PC1/31.00±0.050.25±0.04**0.92±0.06▲▲0.93±0.06▲▲0.54±0.04▲▲0.39±0.04▲▲

2.5 加味葛根芩連湯對模型小鼠胰腺組織TGR5/GLP-1、NeuroD1/GLP-1共表達的影響

TGR5、NeuroD1陽性表達呈紅色熒光，GLP-1陽性表達呈綠色熒光，TGR5/GLP-1、NeuroD1/GLP-1共定位呈黃色熒光。與空白組比較，模型組小鼠胰腺組織TGR5/GLP-1、NeuroD1/GLP-1共表達顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，二甲雙胍組和加味葛根芩連湯高、中劑量組小鼠胰腺組織TGR5/GLP-1、NeuroD1/GLP-1共表達顯著升高（P＜0.01），加味葛根芩連湯低劑量組NeuroD1/GLP-1表達顯著升高（P＜0.01）。見表7、圖3、圖4。

圖3 各組小鼠胰腺組織TGR5、GLP-1陽性表達（免疫熒光染色，×200）

圖4 各組小鼠胰腺組織NeuroD1、GLP-1陽性表達（免疫熒光染色，×200）

表7 各組小鼠胰腺組織TGR5/GLP-1、NeuroD1/GLP-1共表達比較（±s，平均熒光強度）

表7 各組小鼠胰腺組織TGR5/GLP-1、NeuroD1/GLP-1共表達比較（±s，平均熒光強度）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，▲▲P＜0.01

組別空白組模型組二甲雙胍組加味葛根芩連湯高劑量組加味葛根芩連湯中劑量組加味葛根芩連湯低劑量組NeuroD1/GLP-11.00±0.060.18±0.02**0.95±0.06▲▲0.61±0.07▲▲0.51±0.04▲▲0.38±0.05▲▲只數(shù)666666 TGR5/GLP-11.00±0.080.22±0.03**0.78±0.07▲▲0.71±0.12▲▲0.60±0.07▲▲0.34±0.05

3 討論

目前，現(xiàn)代醫(yī)學主要采用二甲雙胍、噻唑烷二酮類、α葡萄糖苷酶抑制劑、胰島素等治療T2DM，雖能控制癥狀，但不良反應較多[10]。中醫(yī)藥在防治T2DM及其并發(fā)癥方面優(yōu)勢明顯。中醫(yī)學認為，糖尿病早期以胰島素抵抗為主，多為實證；中期開始出現(xiàn)胰島細胞損傷合并胰島素抵抗，多為虛實夾雜；末期變化為胰島細胞衰竭，多為虛證[4]。肥胖型T2DM屬于早、中期。研究發(fā)現(xiàn)，葛根芩連湯治療T2DM及其并發(fā)癥效果明顯[11-12]。葛根芩連湯主治表邪未解、邪陷陽明、里熱蒸肺迫腸、傷津耗液之證。方中葛根可除陽明內(nèi)熱，升津潤燥；黃芩、黃連可清肺、胃腸及腎之濕熱，黃連苦燥傷津，與葛根配伍可制其燥性[13]；甘草養(yǎng)脾胃、生津液，和中調(diào)味。全方共奏清熱燥濕、生津潤燥之功，切中“脾癉”中滿內(nèi)熱、燥熱傷津病機。臨床應用葛根芩連湯治療T2DM時，為避免黃連、黃芩苦寒傷及脾胃，常佐干姜制其苦寒之性[14-15]。藥理研究表明，葛根中葛根素具有降血糖、改善胰島素抵抗、保護胰島、抑制炎癥、減輕氧化應激和晚期糖基化終末產(chǎn)物生成作用[16]；黃連主要成分小檗堿可改善胰島素抵抗、促進胰島素及GLP-1分泌、抑制肝臟糖異生、減少腸道對糖的攝取吸收、抑制氧化應激及炎性反應、調(diào)控腸道菌群等[17]；黃芩苷和黃芩素是黃芩的活性成分，具有保肝、抗氧化、調(diào)節(jié)血脂異常、抗脂肪生成、抗炎和抗糖尿病作用，被認為是治療肥胖、胰島素抵抗和炎癥性疾病的潛在抗氧化劑和抗炎劑[18]；葛根中大豆苷可調(diào)節(jié)糖脂代謝，通過T2DM巨噬細胞TNF-α/JNK信號通路降低炎癥反應[19]；甘草中異甘草素可通過沉默信息調(diào)節(jié)因子1依賴性機制減輕糖尿病腎損傷炎癥和氧化應激反應[20]。以上研究為葛根芩連湯治療T2DM糖脂代謝紊亂、胰島素抵抗、炎癥反應等提供實驗依據(jù)。

胰島具有4種內(nèi)分泌細胞群（α、β、δ和PP細胞），其中胰島α細胞可分泌胰高血糖素，調(diào)控葡萄糖穩(wěn)態(tài)；胰島β細胞可通過葡萄糖等刺激分泌及儲存胰島素[21]，胰島素分泌異常是T2DM的主要標志。研究表明，T2DM患者胰島β細胞功能、質(zhì)量均降低，其中T2DM消瘦患者胰島β細胞質(zhì)量減少約41%，而肥胖患者胰島β細胞質(zhì)量減少約63%[22]?；謴凸δ苄砸葝uβ細胞質(zhì)量、改善胰島素分泌可治療T2DM。胰島α和β細胞均表達TGR5[23]，TGR5激活可增加胰島素分泌，進而影響下游cAMP/PKA途徑[24]，誘導GLP-1分泌，GLP-1以旁分泌的方式作用于相鄰β細胞以控制胰島素分泌[25]。當TGR5被抑制時，GLP-1分泌減少[26]。GLP-1是由腸道L細胞、胰島α細胞及中樞神經(jīng)系統(tǒng)分泌的一種長肽激素，可以調(diào)節(jié)葡萄糖穩(wěn)態(tài)、抑制胃排空、改善脂質(zhì)代謝，并可影響胰島β細胞增殖和分化，改善胰島β細胞質(zhì)量，刺激胰島素分泌[26]。在胰腺中，GLP-1主要通過G蛋白偶聯(lián)受體影響下游cAMP/PKA/CREB信號途徑[27]。TGR5可激活腺苷酸環(huán)化酶，刺激ATP轉(zhuǎn)化為cAMP，cAMP進一步激活PKA，從而關閉K+通道并激活Ca2+通道[23]，使下游CREB激活，CREB可增加cAMP含量，后者在胰島素分泌中有重要作用，可影響胰高血糖素原和PC1/3轉(zhuǎn)錄，刺激腸道L細胞產(chǎn)生GLP-1[28]。PC1/3對于腸道L細胞產(chǎn)生GLP-1和GLP-2是必不可少的，在胰島α細胞中也有PC1/3表達。

db/db小鼠為瘦素信號傳導受損所致的肥胖型T2DM模型，具有肥胖、糖脂代謝紊亂、胰島素分泌受損、膽汁酸代謝受損、胰島素抵抗、脂肪組織炎癥等特征，是T2DM疾病研究較理想的動物模型[29]。本研究選取T2DM模型db/db小鼠作為實驗對象，實驗結果顯示，與空白組比較，模型組小鼠FBG、HbA1c顯著升高，糖耐量顯著降低，表明模型小鼠存在糖代謝紊亂。進一步檢測發(fā)現(xiàn)，模型小鼠胰腺組織凋亡細胞明顯增多，TGR5、PKA、p-PKA、CREB、p-CREB、PC1/3、GLP-1蛋白及TGR5、PKA、CREB、PC1/3、GLP-1 mRNA表達顯著降低，TGR5/GLP-1共表達顯著降低，且二者表達具有一定關聯(lián)性，提示模型小鼠胰腺損傷后TGR5表達被抑制，進一步抑制PKA/CREB/GLP-1通路，影響胰島β細胞數(shù)量和功能，破壞葡萄糖穩(wěn)態(tài)。NeuroD1對胰腺發(fā)育至關重要，NeuroD1缺失可影響胰島α細胞和β細胞分化及胰島β細胞增殖，導致功能性胰島細胞數(shù)量減少、胰島結構紊亂[30]。本實驗中，與空白組比較，模型組小鼠胰腺組織NeuroD1/GLP-1共表達顯著降低，說明小鼠胰島細胞功能損傷。經(jīng)二甲雙胍及不同劑量加味葛根芩連湯干預后，各給藥組小鼠FBG、HbA1c降低，糖耐量升高，胰腺組織凋亡細胞顯著減少，提示加味葛根芩連湯能夠改善模型小鼠糖代謝紊亂，減輕胰腺組織損傷；各給藥組小鼠胰腺組織TGR5、PKA、p-PKA、CREB、p-CREB、PC1/3、GLP-1蛋白及TGR5、PKA、CREB、PC1/3、GLP-1 mRNA表達不同程度升高，TGR5/GLP-1、NeuroD1/GLP-1共表達升高，其中二甲雙胍組和加味葛根芩連湯高、中劑量組差異有統(tǒng)計學意義，表明加味葛根芩連湯可激活TGR5，進而激活PKA/CREB/GLP-1信號通路，恢復db/db小鼠胰島功能，改善胰腺損傷。