魏建仝，鄒永剛，李揚(yáng)，王勇平

（1.河西學(xué)院附屬張掖人民醫(yī)院骨科，甘肅張掖 734000；2.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院骨科，甘肅蘭州 730000；3.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院骨科，甘肅蘭州 730000）

骨肉瘤（osteosarcoma,OS）是兒童和成人最常見的惡性骨腫瘤，惡性程度高并易轉(zhuǎn)移，由于晚期OS患者對部分化療藥物的耐藥性，給臨床治療帶來了更大的挑戰(zhàn)［1，2［］。特別是出現(xiàn)合并轉(zhuǎn)移的OS 至今仍是治療難點(diǎn)［3］。長鏈非編碼RNA （long non-coding RNA,lncRNA）幾乎參與細(xì)胞中所有的生理活動(dòng)，其已成為疾病診斷、治療和預(yù)后的潛在新標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，在OS 發(fā)生和發(fā)展中具有重要作用［4～6］。研究發(fā)現(xiàn)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生鐵死亡在一定程度上可降低腫瘤治療中的耐藥性［7～10］，目前OS 鐵死亡相關(guān)lncRNA與免疫浸潤在OS 中的作用有待研究。因此，本文從lncRNA 調(diào)控鐵死亡角度出發(fā)，以期為OS 的診斷與治療提供潛在靶點(diǎn)，同時(shí)也為研究鐵死亡相關(guān)lncRNA 在OS 中的作用機(jī)制提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

從數(shù)據(jù)庫（Therapeutically Applicable Research to Generate Effective Treatments,TARGET) （https://ocg.cancer.gov/programs/target）下載高通量測序數(shù)據(jù)及對應(yīng)的臨床數(shù)據(jù)，共93 例測序數(shù)據(jù)(包括lncRNA、mRNA 和miRNA 測序數(shù)據(jù))及相關(guān)臨床數(shù)據(jù)。從FerrDb 數(shù)據(jù)庫（http://www.datjar.com: 40013/bt2104/download/）中獲得255 個(gè)鐵死亡驅(qū)動(dòng)基因（Ferroptosis-related genes,FRGs）。從CIBERSORTx 在線網(wǎng)站（https://cibersortx.stanford.edu/）獲取OS 中22 種免疫細(xì)胞浸潤數(shù)據(jù)。

1.2 鐵死亡相關(guān)lncRNA 預(yù)后特征的建立及驗(yàn)證

運(yùn)用R 軟件（版本：4.0.2）過濾低豐度基因并整理對應(yīng)的臨床信息后獲得85 例測序數(shù)據(jù)，提取lncRNA 和FRGs，以斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)（P≤0.001，cor＞0.3）篩選與FRGs 顯著相關(guān)的lncRNA，并對其進(jìn)行單因素Cox 分析。隨后，采用R 軟件中“glmnet”包以lambda 最小時(shí)的系數(shù)進(jìn)行l(wèi)asso 回歸分析以及多因素Cox 回歸分析［11，12］。最后，計(jì)算每個(gè)OS患者的風(fēng)險(xiǎn)評分，根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評分將OS 患者分為高、低風(fēng)險(xiǎn)組，通過R 軟件中“timeROC”、“rms”程序包構(gòu)建1、3、5 年受試者工作特征曲線、列線圖和校準(zhǔn)曲線［13］。

1.3 基因富集分析

采用R 軟件中“l(fā)imma”程序包對高、低風(fēng)險(xiǎn)組的差異表達(dá)基因進(jìn)行鑒定，篩選標(biāo)準(zhǔn)為|logFC|＞1 且P.Value＜0.05，logFC＞1 的差異基因被認(rèn)為是上調(diào)基因，logFC＜-1 的差異基因被認(rèn)為是下調(diào)基因。為了進(jìn)一步揭示對高、低風(fēng)險(xiǎn)組的差異表達(dá)基因的重要功能和生物學(xué)途徑，作者對其進(jìn)行了基因本體論（GO）功能和京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。GO 是一種常用的基因注釋和功能基因組學(xué)分析方法，包括細(xì)胞成分（cellular component,CC）、生物學(xué)過程（biological process,BP）和分子功能（molecular function,MF）［14］。KEGG（http://www.genome.jp/）是一個(gè)廣泛使用的數(shù)據(jù)庫，存儲了大量關(guān)于基因組信息與生物途徑、化學(xué)物質(zhì)、疾病和藥物的數(shù)據(jù)［15］。利用R 軟件中的“clusterProfiler”“org.Hs.eg.db”“ggplot2”程序包對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO 和KEGG 通路富集分析及可視化，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 構(gòu)建OS 鐵死亡相關(guān)的lncRNA ceRNA 網(wǎng)絡(luò)及驗(yàn)證

對最終篩選得到的lncRNA、miRNA 以及FRGs基因進(jìn)行斯皮爾曼相關(guān)性分析（P≤0.001,cor＞0.5），構(gòu)建OS ceRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證構(gòu)建的鐵死亡相關(guān)的LncRNA ceRNA 網(wǎng)絡(luò)，通過RNA 互作百科全書（The Encyclopedia of RNA Interactomes,ENCORI） 網(wǎng)站（https://starbase.sysu.edu.cn/index.php）驗(yàn)證microRNA 和lncRNA 驗(yàn)證結(jié)合位點(diǎn)序列。

1.5 OS 與免疫微環(huán)境

ESTIMATE 是一種基于基因表達(dá)數(shù)據(jù)預(yù)測腫瘤純度和TME 中浸潤基質(zhì)細(xì)胞/免疫細(xì)胞的工具，該算法基于單樣本基因集富集分析（ssGSEA），生成3 個(gè)評分，分別是基質(zhì)細(xì)胞評分、免疫細(xì)胞評分和ESTIMATE 評分［16］。將OS 基因表達(dá)數(shù)據(jù)集上傳到CIBERSORT 網(wǎng)站門戶網(wǎng)站（http://cibersort.stanford.edu/），該算法基于1 000 種排列下的默認(rèn)signature矩陣。在CIBERSORT（Perm=1 000）中，將基因表達(dá)基質(zhì)轉(zhuǎn)化為免疫細(xì)胞基質(zhì)，基因過濾標(biāo)準(zhǔn)為（P＜0.05），然后對22 個(gè)免疫細(xì)胞組分的基質(zhì)進(jìn)行可視化。

2 結(jié) 果

2.1 鐵死亡相關(guān)lncRNA 預(yù)后特征的建立及驗(yàn)證

從TARGETOS 數(shù)據(jù)集中提取到7 658 個(gè)lncRNA和175 個(gè)FRGs，根據(jù)斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)（P≤0.001,cor＞0.3）得到了1 158 個(gè)與鐵死亡顯著相關(guān)的lncRNA。通過單因素Cox 分析確定了85 個(gè)OS 預(yù)后有關(guān)的lncRNA。考慮到得到的基因較多，作者通過lasso 回歸分析聯(lián)合多因素Cox 分析進(jìn)一步篩選關(guān)鍵基因，最后得到8 個(gè)關(guān)鍵lncRNA（表1）隨后作者計(jì)算每個(gè)OS 患者的風(fēng)險(xiǎn)評分并為高、低風(fēng)險(xiǎn)組。生存分析表明，低風(fēng)險(xiǎn)組45 例患者的總生存期顯著優(yōu)于40 例高風(fēng)險(xiǎn)組患者（P＜0.001）。通過時(shí)間依賴性ROC 分析評估預(yù)后模型的預(yù)測效率，其中，1、3、5年的ROC 曲線下面積分別為81.6、88.3 和91.4（圖1）。

表1 骨肉瘤鐵死亡相關(guān)的獨(dú)立預(yù)后lncRNA 多因素Cox 分析

圖1 ROC 曲線分析顯示風(fēng)險(xiǎn)評分在預(yù)測OS 患者的生存時(shí)間中的準(zhǔn)確性，藍(lán)色線代表預(yù)測1 年生存，紅色線代表預(yù)測3 年生存，綠色線代表預(yù)測5 年生存。

2.2 構(gòu)建列線圖

基于臨床因素，包括性別、年齡和風(fēng)險(xiǎn)評分構(gòu)建預(yù)測OS 患者的5 年生存率列線圖（圖2a）。根據(jù)每個(gè)項(xiàng)目的實(shí)際情況進(jìn)行評分，患者可以獲得預(yù)測其5年內(nèi)生存率的總分。綠線、藍(lán)線和紅線表示1、3 和5 年列線圖校準(zhǔn)曲線（圖2b）。C 指數(shù)為0.846。

圖2 基于臨床因素，包括性別、年齡和風(fēng)險(xiǎn)評分構(gòu)建預(yù)測骨肉瘤5 年生存列線圖。2a: 預(yù)測1、3、5 年生存的概率；2b: 列線圖校準(zhǔn)曲線。

2.3 高低風(fēng)險(xiǎn)組差異分析和富集分析

根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評分定義高低風(fēng)險(xiǎn)組，閾值設(shè)置為|log-FC|＞1 且P＜0.05 的為表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，得到223 個(gè)上調(diào)基因和214 個(gè)下調(diào)基因。為進(jìn)一步分析風(fēng)險(xiǎn)評分在OS 中的主要功能機(jī)制，對差異基因進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析。GO 分析結(jié)果表明，CC 主要包括細(xì)胞外基質(zhì)組織、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織、成骨、細(xì)胞-基質(zhì)粘附、受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用；BP 主要包括細(xì)胞-基底連接、黏著斑、含膠原蛋白的細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞接觸前緣、游離核糖體；MF 主要包括氧化還原酶活性，作用于供體CH-NH2 基團(tuán)，氧作為受體（圖3a）。KEGG 主要涉及的通路為單純皰疹病毒1型感染、新型冠病毒感染、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)、軸突引導(dǎo)和癌癥中的蛋白聚糖（圖3b）。

圖3 基于風(fēng)險(xiǎn)評分分組差異分析基因富集分析。3a: 差異基因GO 分析；3b: 差異基因KEGG 分析。球的大小代表富集的基因個(gè)數(shù)，顏色代表P 值。

2.4 構(gòu)建OS 鐵死亡相關(guān)的lncRNA ceRNA 網(wǎng)絡(luò)及驗(yàn)證

作者以P≤0.001 且相關(guān)性系數(shù)＞0.5 構(gòu)建了OS lncRNA ceRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其中包括4 個(gè)lncRNA、13個(gè)miRNA 和8 個(gè)鐵死亡相關(guān)的mRNA（圖4）。隨后在ENCORI 在線網(wǎng)站檢索lncRNA 與miRNA 結(jié)合位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)lncRNA PVT1 與miRNA（hsa-miR-106a-5p,hsa-miR-17-5p,hsa-miR-20a-5p）有確定結(jié)合靶點(diǎn)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，lncRNA PVT1 基因與OS 免疫有關(guān)（R=-0.27,P=0.014），并與患者生存可能有關(guān)（P=0.005）。

圖4 骨肉瘤鐵死亡相關(guān)LncRNA ceRNA 網(wǎng)絡(luò)，包括鐵死亡相關(guān)的lncRNA、miRNA 和FRGs。

2.5 OS 與免疫分析

為進(jìn)一步探討風(fēng)險(xiǎn)評分與免疫狀態(tài)之間的關(guān)系，采用ssGSEA 計(jì)算免疫細(xì)胞浸潤評分。作者發(fā)現(xiàn)高風(fēng)險(xiǎn)組基質(zhì)評分（T-test,P=0.00026） 和ESTIMATE（T-test,P=0.0051）免疫評分更低（圖5a），表明風(fēng)險(xiǎn)評分可能與OS 免疫有關(guān)。因此，作者通過CIBERSORT 分析了OS22 種免疫細(xì)胞浸潤水平，發(fā)現(xiàn)OS 主要為巨噬細(xì)胞浸潤較高，隨后進(jìn)一步分析風(fēng)險(xiǎn)評分與腫瘤微環(huán)境之間的關(guān)系，結(jié)果表明高風(fēng)險(xiǎn)組M0 型巨噬細(xì)胞免疫浸潤深度較高（圖5b）。對關(guān)鍵的免疫檢查點(diǎn)基因分析發(fā)現(xiàn)，高風(fēng)險(xiǎn)組PDCD1LG2和CD27 表達(dá)量低于低風(fēng)險(xiǎn)組（T-test,P＜0.05），表明風(fēng)險(xiǎn)評分可能與關(guān)鍵免疫檢查點(diǎn)基因的表達(dá)水平有關(guān)。

3 討 論

LncRNA 是一類長度超過200 個(gè)核苷酸的ncRNA，與人類疾病的發(fā)生發(fā)展密不可分［17，18］。lncRNA 在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控方面和mRNA 具有許多共同特征，其蛋白質(zhì)編碼潛力隨著研究發(fā)現(xiàn)正不斷升高［19，20］。而鐵死亡是一種由鐵依賴性脂質(zhì)過氧化驅(qū)動(dòng)的凋亡途徑，可調(diào)節(jié)多種癌癥的表觀遺傳程序和代謝表達(dá)［21，22］。越來越多的證據(jù)表明lncRNA 在鐵死亡調(diào)節(jié)中的發(fā)揮重要作用［23～25］。

本研究從鐵死亡相關(guān)lncRNA 角度出發(fā)，構(gòu)建了OS 患者預(yù)后預(yù)測模型，在總生存率上高、低風(fēng)險(xiǎn)組間存在顯著差異，其中1、3 和5 年的OS 風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測模型的AUC 分別為0.82、0.89 和0.91，顯示出了較好的疾病預(yù)測效果，該模型由8 個(gè)鐵死亡相關(guān)的lncRNA 組成：GAS5,UNC5B-AS1,AC096564.1,SNHG6,PVT1,EDIL3-DT,LINC00565,AC009159.3。本研究隨后構(gòu)建了OS lncRNA ceRNA 網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)包含4 個(gè)lncRNA、13 個(gè)miRNA 和8 個(gè)FRGs。其中PVT1 是一種重要的致癌lncRNA，可下調(diào)Myc 基因表達(dá)和CD4+T 細(xì)胞的增殖［26，27］。Zhang 等［28］發(fā)現(xiàn)PVT1 在腎透明細(xì)胞癌組織中顯著上調(diào)，其高表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌患者預(yù)后不良有關(guān)，而HIF2α 特異性抑制劑可以抑制PVT1 的表達(dá)及其致癌功能，可用于抗癌治療。Amer 等［29］發(fā)現(xiàn)在多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，LINC00565 表達(dá)量隨著大腫瘤大?。ā? cm）而增加，有望成為多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者預(yù)后新型生物標(biāo)志物。此外，Hu 等［30］發(fā)現(xiàn)LINC00565 是伊維菌素抑制卵巢癌作用機(jī)制中關(guān)鍵的lncRNA 之一。GAS5 是近年來備受關(guān)注的關(guān)鍵基因，在控制腫瘤進(jìn)展及預(yù)后、侵襲轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮重要作用［31，32］。Fang 等［33］發(fā)現(xiàn)GAS5 通過海綿效應(yīng)下調(diào)miRNA-21的表達(dá)，刺激PTEN 的表達(dá)，可抑制腫瘤的增殖和代謝，并與化療敏感性有關(guān)。Ellinger 等［34］驗(yàn)證了透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌中包括lnc-ZNF180-2 和EDIL3-DT 在內(nèi)的具有潛在預(yù)后意義的6 種lncRNA。以上研究進(jìn)一步驗(yàn)證了本研究構(gòu)建的ceRNA 網(wǎng)絡(luò)的可靠性。

鐵死亡相關(guān)lncRNA 可參與調(diào)節(jié)腫瘤免疫相關(guān)基因（如PD-1,CTLA4,LAG3 和BTLA）的表達(dá)［35］。Tang 等［36］認(rèn)為免疫檢查點(diǎn)抑制劑與鐵死亡誘導(dǎo)劑聯(lián)合使用可能會協(xié)同減緩腫瘤進(jìn)展。本研究發(fā)現(xiàn)，風(fēng)險(xiǎn)評分與OS 免疫微環(huán)境有關(guān)，高風(fēng)險(xiǎn)組中M0 型巨噬細(xì)胞浸潤較高。既往研究發(fā)現(xiàn)，M0 浸潤高的患者預(yù)后較差并參與腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸，在晚期具有促癌作用［37，38］。本研究評估了高、低風(fēng)險(xiǎn)組免疫檢查點(diǎn)基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)PDCD1LG2 （PD-L2） 和CD27 在高風(fēng)險(xiǎn)組低表達(dá)。PD-L2 可與PD-L1 競爭結(jié)合PD-1，還可抑制CD28 介導(dǎo)的PI3K 磷酸化，削弱CD28 信號對免疫細(xì)胞的活化作用［39，40］。CD27 是TNF 受體超家族的成員，該受體是T 細(xì)胞免疫產(chǎn)生和長期維持所必需的，介導(dǎo)了NF-κB 和MAPK8/JNK信號通路的激活［41，42］。目前，探索免疫檢查點(diǎn)、化療和鐵死亡之間關(guān)系的研究有限，因此，值得進(jìn)一步研究OS 免疫調(diào)控過程中鐵死亡相關(guān)的關(guān)鍵的lncRNA。

綜上所述，本研究根據(jù)FRGs 相關(guān)lncRNA 表達(dá)矩陣構(gòu)建了OS 預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型和ceRNA 網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步整合OS 患者的臨床特征，構(gòu)建列線圖，并從鐵死亡相關(guān)lncRNA 角度分析對OS 免疫微環(huán)境的影響。本研究為未來OS 分子靶向治療的研究提供新的視角和方向。但尚需進(jìn)一步的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)來證實(shí)這些關(guān)鍵基因在人OS 中調(diào)控的具體功能及機(jī)制，以期為OS靶向藥物的研發(fā)和聯(lián)合治療提供新思路。