文│孫冬青（江蘇省睢寧縣姚集鎮(zhèn)綜合服務(wù)中心）

江蘇睢寧縣有養(yǎng)兔傳統(tǒng)，家兔養(yǎng)殖規(guī)模龐大。目前，影響?zhàn)B兔業(yè)發(fā)展的首要因素是疾病問題，如流行性腹脹腹瀉、傳染性鼻炎、球蟲病及兔瘟等，給養(yǎng)殖場戶造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失，且家兔疾病往往由多種病原體引起，臨床診斷難度較大，防治較為困難。

魏氏梭菌（Clostridium welchii）是一種兔腸道中常在的條件性病原菌。正常條件下，魏氏梭菌會與宿主處于一種動態(tài)平衡狀態(tài)，但當(dāng)家兔抵抗力下降或飼養(yǎng)環(huán)境改變時該菌會大量繁殖，打破平衡狀態(tài)，并產(chǎn)生α毒素，導(dǎo)致家兔急性腹瀉、迅速死亡。兔病毒性出血癥（Rabbits viral haemorrhagic disease，RHD）又被稱為兔瘟，是由兔出血癥病毒（Rabbits haemorrhagic disease viral，RHDV）引起的一種家兔烈性傳染病，可導(dǎo)致家兔實(shí)質(zhì)性器官出血、壞死，發(fā)病快，死亡率高。

由于這2種家兔傳染性疾病均可導(dǎo)致家兔大量死亡，在發(fā)病后若不及時治療會給兔場造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。2023年初，江蘇睢寧某兔場出現(xiàn)1月齡仔兔腹瀉、大量死亡的現(xiàn)象，通過對病死兔進(jìn)行臨床問診、球蟲檢測、病理剖檢、致病菌分離、革蘭氏染色鏡檢及PCR凝膠電泳分子生物學(xué)鑒定，確診為魏氏梭菌病和兔瘟的混合感染，為臨床治療魏氏梭菌與兔瘟的混合感染提供科學(xué)參考。

一、材料與方法

1.樣品來源。江蘇睢寧某兔場1月齡病兔8只，發(fā)病兔臨床癥狀以腹瀉、斷續(xù)死亡為主。

2.試驗(yàn)儀器與試劑。LB瓊脂培養(yǎng)基購自山東綠都生物科技有限公司。藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司。Trizol試劑，Premix TaqTM（E×TaqTMVersion 2.0 plus dye）購自北京聚合美生物科技有限公司。溴化乙啶溶液購自上海澤葉生物科技有限公司。DM2000 DNA Marker 購自寶生物工程（大連）有限公司。細(xì)菌基因組DNA小量提取試劑盒購自上海華舜生物技術(shù)有限公司。

主要儀器包括臺式冷凍高速離心機(jī)（美國貝克曼庫爾特有限公司）、普通PcR儀（濟(jì)南光耀醫(yī)療設(shè)備有限公司）、凝膠成像系統(tǒng)（德國耶拿分析儀器股份有限公司）、電泳儀（北京市六一儀器廠）。

3.細(xì)菌分離純化與形態(tài)學(xué)檢測。使用接種環(huán)將病兔組織劃線接種于LB瓊脂培養(yǎng)基上。在37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，觀察細(xì)菌形態(tài)，選取疑似致病菌落進(jìn)行革蘭氏染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)菌，鏡檢選取典型單一菌落再次進(jìn)行純化培養(yǎng)。

4.球蟲病檢測。采用飽和食鹽水漂浮法對病兔糞便進(jìn)行檢測，并在顯微鏡下使用麥克馬斯特計數(shù)板進(jìn)行計數(shù)，確定每克糞便卵囊數(shù)量（Oocysts per gram，OPG）。

5.引物設(shè)計與合成。選取NCBI上發(fā)布的魏氏梭菌、RHDV和RHDV2的基因序列，引物序列見表1，由上海生工生物工程有限公司合成。預(yù)擴(kuò)增目的片段的大小分別為324、591和829bp。

表1 引物序列信息

6.PCR鑒定。

（1）細(xì)菌DNA的提取。細(xì)菌DNA的提取按照試劑盒說明書的具體步驟進(jìn)行操作。

（2）病毒RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄。取100毫克病兔肝組織，通過Trizol法提取組織中的RNA，按照兩步法RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒的步驟進(jìn)行操作，將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

（3）細(xì)菌DNA的PCR鑒定。使用25微升的反應(yīng)體系，Premix Taq酶加入12.5微升、無酶水加入9.5微升、上、下游引物各加入1微升，細(xì)菌DNA加入1微升。PCR反應(yīng)條件：94℃變性4分鐘后進(jìn)行循環(huán)；94℃30秒，54℃30秒，72℃1分鐘，共30個循環(huán)；72℃延伸10分鐘。

（4）病毒cDNA的PCR鑒定。使用6.3的反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，51.1℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共35個循環(huán)；72℃延伸10分鐘。

7.藥敏試驗(yàn)。按照WHO推薦的瓊脂紙片擴(kuò)散法（K-B）對分離菌純化后進(jìn)行試驗(yàn)操作和結(jié)果判斷?？股丶埰☉c大霉素、青霉素、新霉素、頭孢氨芐、桿菌肽、恩諾沙星、卡那霉素、丁胺卡那、多黏菌素B、四環(huán)素、復(fù)方新諾明、阿奇霉素、環(huán)丙沙星、磺胺異噁唑、多西環(huán)素。

二、試驗(yàn)結(jié)果

1.病理剖檢。臨床剖檢發(fā)現(xiàn)，病兔肛門周圍和后肢內(nèi)側(cè)被毛沾染灰褐色糞便，有腥臭味（圖1A）。胃膨脹，胃內(nèi)充滿未完全消化的飼料和乳汁，胃黏膜有大小不等的黑色斑點(diǎn)（圖1B）。脾呈紫黑色（圖1C），肝腫大，有散在的出血斑。心臟表面血管擴(kuò)張，呈樹枝狀（圖1D）。小腸內(nèi)充滿氣體，腸壁薄而透明（圖1E）。大腸內(nèi)充滿氣體，腸漿膜及黏膜有彌漫性充血和出血斑，盲腸部分螺旋瓣內(nèi)和結(jié)腸出現(xiàn)飼料板結(jié)現(xiàn)象（圖1F）。

圖1 病死兔剖檢

2.形態(tài)及培養(yǎng)特征觀察。由圖2可知，經(jīng)細(xì)菌分離培養(yǎng)，從送檢兔脾、肝、肺、氣管、腎、盲腸等組織內(nèi)分離得到4株病原菌，革蘭氏染色發(fā)現(xiàn)該菌為革蘭氏陽性桿菌，兩端鈍圓，有芽孢，菌體單個存在或鏈狀排列。

圖2 分離菌的形態(tài)、培養(yǎng)特性和革蘭氏染色觀察

3.球蟲病檢測結(jié)果。采集的兔糞樣品中均未查出球蟲，排除球蟲導(dǎo)致的腹瀉。

4.PCR檢測。取分離得到的DNA，應(yīng)用PCR方法進(jìn)行檢測，并用2%的瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳。通過PCR擴(kuò)增，在324bp位置出現(xiàn)魏氏梭菌特異性條帶（圖3）、在591bp位置出現(xiàn)RHDV特異性條帶，未檢測出RHDV2特異性條帶（圖4）。

圖3 細(xì)菌DNA凝膠電泳圖

圖4 病毒cDNA凝膠電泳圖

5.藥敏試驗(yàn)。由表2可知，魏氏梭菌對四環(huán)素、多西環(huán)素、環(huán)丙沙星、慶大霉素、卡那霉素、新霉素、多粘菌素B、頭孢氨芐、復(fù)方新諾明9種藥物敏感，對青霉素、桿菌肽、阿奇霉素、磺胺異噁唑4種藥物有較強(qiáng)耐藥性。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

三、討論

我國是世界上養(yǎng)兔最多的國家，近年來，隨著兔產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，兔養(yǎng)殖業(yè)的規(guī)?；?、集約化、現(xiàn)代化程度迅速提高，但家兔疫病防控面臨著新的困難和挑戰(zhàn)。家兔疾病往往由多種病原體引起，臨床診斷難度較大，防治較為困難。兔魏氏梭菌病又稱兔產(chǎn)氣莢膜梭菌病，是由A型產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的一種兔消化道傳染病，具有較高的發(fā)病率和死亡率，無季節(jié)特異性和年齡特異性，所有年齡段的兔子在全年均可發(fā)病，但在冬春季節(jié)發(fā)病率較高，是威脅養(yǎng)兔業(yè)的重要傳染病之一。魏氏梭菌為革蘭氏陽性桿菌，是一種條件性致病菌，正常條件下在兔腸道中也有分布，與宿主處于一種動態(tài)平衡的狀態(tài)，但當(dāng)外界改變時會引起宿主消化道內(nèi)菌群紊亂從而導(dǎo)致發(fā)病，且常與其他致病性微生物混合感染，增加了診治難度。

兔病毒性出血癥又稱兔瘟，是由兔出血癥病毒引起的一種烈性傳染病，以實(shí)質(zhì)性器官出血為主要特征，一年四季均可發(fā)病，發(fā)病急、傳播快，死亡率高。2010年，法國首次報道了RHDV毒株的新變種，并將其命名為RHDV2，2020年4月，我國四川省首次確診了RHDV2感染病例。隨后在河南和其他地方陸續(xù)出現(xiàn)相關(guān)報道，相較于經(jīng)典RHDV，RHDV2感染的宿主范圍更廣，有逐漸取代經(jīng)典RHDV的趨勢。近3年來，不論疫苗生產(chǎn)企業(yè)還是兔養(yǎng)殖戶的防控重點(diǎn)都聚焦在RHDV2感染，忽略了對經(jīng)典RHDV感染的免疫防控，導(dǎo)致部分地區(qū)RHDV感染出現(xiàn)反彈。RHDV感染家兔出現(xiàn)慢性化、非典型化的特點(diǎn)，臨床癥狀主要表現(xiàn)為精神沉郁，與其他疾病混合感染，漸進(jìn)性死亡。本次發(fā)病兔脾腫大呈藍(lán)紫色，肝明顯腫大有出血點(diǎn)，未見兔瘟的典型病理變化，臨床癥狀主要表現(xiàn)為腹瀉，剖檢顯示胃壁有多處潰瘍斑，小腸臌氣和盲腸內(nèi)飼料板結(jié)。病兔內(nèi)臟器官分離的細(xì)菌經(jīng)染色、鏡檢及PCR鑒定確定為魏氏梭菌感染，同時PCR檢測顯示，兔肝組織RHDV弱陽性。但RHDV主要感染青年兔和成年兔，一月齡幼兔為不易感兔群，此次試驗(yàn)檢測出RHDV弱陽性，可能與母兔RHDV疫苗免疫有關(guān)，或幼兔雖然感染RHDV，但由于年齡原因并未發(fā)病。幼兔在感染兔瘟后盡管未發(fā)病，但免疫系統(tǒng)會受到影響，使兔機(jī)體抵抗力下降，而魏氏梭菌是一種機(jī)會致病菌，會在家兔出現(xiàn)應(yīng)激或自身抵抗力下降時大量繁殖，產(chǎn)生毒素，導(dǎo)致家兔死亡。據(jù)此判斷，雖然檢測出RHDV弱陽性，但兔的死亡原因主要是由魏氏梭菌大量增殖感染引起。

目前，針對魏氏梭菌病的治療主要是依賴于抗菌藥物，但由于大規(guī)模使用抗生素，使不同地區(qū)的魏氏梭菌均具有了很強(qiáng)的耐藥性。根據(jù)李燕平等報道，兔源魏氏梭菌對四環(huán)素、泰樂菌素、磺胺嘧啶耐藥。研究發(fā)現(xiàn)，從湖南婁底地區(qū)部分兔場分離得到的12株致病性魏氏梭菌對環(huán)丙沙星、磺胺嘧啶、氟苯尼考、慶大霉素、大觀霉素、林可霉素、多粘菌素、強(qiáng)力霉素8種藥物耐藥。對山東分離出的魏氏梭菌進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，結(jié)果表明，菌株對慶大霉素、四環(huán)素、青霉素、氨芐西林、紅霉素和桿菌肽耐藥。在本試驗(yàn)中，分離得到的魏氏梭菌對青霉素、桿菌肽、阿奇霉素、磺胺異噁唑4種藥物有較強(qiáng)耐藥性，對四環(huán)素、多西環(huán)素、環(huán)丙沙星、慶大霉素、卡那霉素、新霉素、多粘菌素B、頭孢氨芐、復(fù)方新諾明9種藥物敏感，與上述報道結(jié)果有一定差異，這可能是由于不同地區(qū)抗生素的使用情況有差異，同時發(fā)病兔場魏氏梭菌的亞型不同。目前針對RHDV有成熟的疫苗，養(yǎng)殖戶定期進(jìn)行疫苗預(yù)防能很好防控該病。而針對RHDV2目前無國家批準(zhǔn)文號的疫苗，暫無特效藥物進(jìn)行治療，只能通過接種現(xiàn)有疫苗進(jìn)行提前預(yù)防，同時做好環(huán)境消毒和生物安全，盡可能地阻斷傳播途徑。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，該病兔分離的魏氏梭菌對四環(huán)素、多西環(huán)素、環(huán)丙沙星、慶大霉素、卡那霉素、多黏菌素B、新霉素、頭孢氨芐等多種藥物敏感。該兔場可選擇1～2種敏感藥物進(jìn)行預(yù)防和治療，并接種兔瘟疫苗。同時需要做到防控，對病死兔進(jìn)行無害化處理并進(jìn)行環(huán)境消毒。

當(dāng)兔場發(fā)生疾病后，需要及時進(jìn)行科學(xué)診斷，盡快確定治療方法?？茖W(xué)合理的實(shí)驗(yàn)室檢測在臨床診斷過程中十分重要，可以準(zhǔn)確診斷出病原菌的種類，農(nóng)戶可根據(jù)診斷結(jié)果準(zhǔn)確使用藥物對患病兔進(jìn)行有效治療，可以提高養(yǎng)殖場的經(jīng)濟(jì)效益，促進(jìn)養(yǎng)兔業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展。