成彥麗，周國(guó)林，楊竟然，袁本園，徐晨，王雪娟

1.安徽科技學(xué)院建筑學(xué)院，安徽 蚌埠 233000 2.安徽水利生態(tài)環(huán)境建設(shè)有限公司，安徽 蚌埠 233000

流蘇樹(Chionanthusretusus)又名炭栗樹、四月雪、晚皮樹、鐵黃荊、糯米花、茶葉樹等，為木樨科流蘇樹屬的一種落葉喬木或灌木，是我國(guó)特有的二級(jí)保護(hù)植物[1-2]。成年流蘇樹樹形高大、枝葉茂盛，花朵像雪一樣潔白，花形較為纖細(xì)，盛開時(shí)像天上的云朵一般，清香四溢，具有良好的觀賞效果，在園林綠化中可作行道樹、點(diǎn)綴或群植等[3]。流蘇樹喜光、耐蔭、耐旱、耐寒、耐瘠薄，喜濕潤(rùn)肥沃的河溝、沙壤土、碎石山地等，對(duì)土壤適應(yīng)性強(qiáng)。該植物是嫁接桂花的優(yōu)良砧木，嫁接后的桂花觀賞效果與生活力明顯優(yōu)于白蠟、女貞等其他砧木[4-5]。另外，流蘇樹還具有一定的其他經(jīng)濟(jì)價(jià)值，如它的嫩葉可以代茶作飲料，其香氣不亞于“龍井”；果實(shí)含油量大，可榨油供工業(yè)用[6]。

盡管流蘇樹用途廣泛，但其種子繁殖卻比較困難[2]。流蘇種子外殼較為堅(jiān)硬，果實(shí)成熟落地后，在秋季先長(zhǎng)出胚根，于第二年春天才能長(zhǎng)出胚芽，胚芽和胚根呈現(xiàn)不同步休眠。流蘇的種子為“二年種子”。因此流蘇種子發(fā)芽速度較慢[4-6]。流蘇種子在室內(nèi)常溫干燥貯藏和濕沙催芽過(guò)程中極易發(fā)生霉變現(xiàn)象。有學(xué)者認(rèn)為在大田條件下其發(fā)芽需要干燥略微潮濕環(huán)境，以保證種子不爛安全度過(guò)第二年夏天，如果水分控制不慎，流蘇種子極易發(fā)霉腐爛，導(dǎo)致發(fā)芽率很低甚至不發(fā)芽[6]。為此，筆者對(duì)流蘇種子含水量、吸水率及生活力等進(jìn)行了檢測(cè)；同時(shí)觀測(cè)了室溫干燥貯藏和室溫濕沙層積赤霉素處理濕沙催芽種子的霉變環(huán)境條件，了解霉變對(duì)種子生活力和萌發(fā)力的影響，并對(duì)導(dǎo)致其霉變的菌種進(jìn)行初步研究，以期為流蘇種子的科學(xué)貯藏和正常萌發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

流蘇種子于2021年1月購(gòu)于大博種業(yè)；赤霉素購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；高錳酸鉀購(gòu)于上海新瑞精細(xì)化工有限公司；2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司；乙醇(無(wú)水乙醇)購(gòu)于滬試國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；濕沙要求沙子手握成團(tuán)，無(wú)水流出，手松開后沙團(tuán)有裂縫，一碰即散。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子質(zhì)量檢測(cè)

檢測(cè)種子凈度、千粒重、含水量、生活力、吸水率，采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法測(cè)定種子活力[7]。

1.2.2 種子形態(tài)測(cè)定

隨機(jī)取50粒流蘇種子，用游標(biāo)卡尺分別測(cè)量種子縱和寬，計(jì)算平均數(shù)與極值。

1.2.3 發(fā)霉現(xiàn)象觀察

①室溫貯藏種子霉變現(xiàn)象：4月上旬，室內(nèi)常溫貯藏種子出現(xiàn)霉變現(xiàn)象。②室溫濕沙層積赤霉素處理濕沙催芽過(guò)程中的霉變現(xiàn)象：2020年1月取流蘇種子若干，用25 ℃的自來(lái)水浸泡48 h后，將濕沙與種子以3∶1的比例混合，在室溫條件下層積；3月上旬取出層積種子，用0、100、200、300、400、500、600 mg/L的赤霉素進(jìn)行處理，然后繼續(xù)置于濕沙中室溫催芽。自3月底起，不同處理的流蘇種子無(wú)發(fā)芽跡象且開始出現(xiàn)霉變。

1.2.4 發(fā)霉環(huán)境條件分析

流蘇種子發(fā)霉現(xiàn)象主要出現(xiàn)在4月上旬，在中國(guó)天氣網(wǎng)(http：//www.weather.com.cn/)上搜尋4月1日至4月15日試驗(yàn)地的最高氣溫、最低氣溫、相對(duì)濕度以及降雨時(shí)間。用日最高、最低溫平均法計(jì)算日均溫；用某一段時(shí)間內(nèi)逐日平均氣溫≥10 ℃持續(xù)期間日平均氣溫的總和，即活動(dòng)溫度總和來(lái)計(jì)算積溫。

1.2.5 致霉菌種類鑒定

取室內(nèi)常溫干燥貯藏和室溫濕沙層積赤霉素處理濕沙催芽的霉變種子為樣品提取感染致霉菌的DNA，進(jìn)行ITS擴(kuò)增。經(jīng)過(guò)樣本檢測(cè)、PCR、純化、建庫(kù)、測(cè)序等環(huán)節(jié)，測(cè)序得到原始數(shù)據(jù)(Raw Data)。對(duì)Raw Data進(jìn)行拼接、過(guò)濾，得到有效數(shù)據(jù)(Clean Data)，進(jìn)一步降噪，得到ASVs序列?；贏SVs序列在數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)分析，得到溫室內(nèi)常溫干燥貯藏和室溫濕沙層積赤霉素處理濕沙催芽種子的致霉菌種類和豐度，并分析這些致霉菌的Alpha多樣性。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子生活力分析

該批種子的千粒重為200.90 g，凈度約為93.90%，含水量約為13.35%。通過(guò)TTC染色法觀察種胚染色情況，發(fā)現(xiàn)未發(fā)霉的流蘇種子種胚被染成紅色，即具有成活力的種子45粒，不顯色的無(wú)生活力的種子5粒，正常流蘇種子生活力較高達(dá)到81.82%。室內(nèi)常溫干燥貯藏條件下發(fā)生霉變的流蘇種子具有生活力的種子22粒，無(wú)生活力的種子28粒，發(fā)霉流蘇生種子活力不高，僅有44.00%。

2.2 種子形態(tài)分析

采用游標(biāo)卡尺測(cè)量50粒流蘇種子的縱和寬，可知流蘇種子的縱約為11.70 mm，寬約為4.04 mm。其中縱的最大值達(dá)15.35 mm，寬的最大值達(dá)到4.97 mm；縱的最小值為7.71 mm，寬的最小值為3.10 mm。

2.3 種子吸水率分析

流蘇種子種皮的透水性如圖1所示，流蘇種子去殼與不去殼的透水性不同，但最終吸水率差別不大。浸泡12 h時(shí)去殼與不去殼種子吸水率都接近32.00%，在浸泡12 h前，不去殼種子的含水量高于去殼種子；在浸泡12 h后相反，去殼種子含水量高于不去殼種子。由圖1可知，去殼后的種子吸水速率增長(zhǎng)較大，并且持續(xù)上升，在96 h時(shí)達(dá)到吸水率最高值84.11%。96 h時(shí)不去殼種子吸水率為72.30%。隨著浸泡時(shí)間的增加，發(fā)現(xiàn)流蘇出現(xiàn)了霉變現(xiàn)象。試驗(yàn)結(jié)果表明，流蘇種子去殼和不去殼的對(duì)其吸水率影響不大。

圖1 流蘇種子吸水率Fig.1 The water absorption of C.retusus seeds

2.4 霉變現(xiàn)象觀察與分析

解剖室內(nèi)常溫干燥貯藏的霉變不去殼種子，發(fā)現(xiàn)種殼內(nèi)外均出現(xiàn)黑色致霉菌，種皮上附著黑色致霉菌較多且伴有少量白色絨毛狀致霉菌，4月上旬霉變率為60.00%。同時(shí)花盆里室溫濕沙層積赤霉素處理濕沙催芽的種子也出現(xiàn)種皮皺縮、發(fā)霉?jié)€的現(xiàn)象(見圖2)。通過(guò)查詢中國(guó)天氣網(wǎng)，發(fā)現(xiàn)種子發(fā)霉時(shí)間段里的最高氣溫為22 ℃，最低氣溫為7 ℃，日均溫為14.2 ℃，相對(duì)濕度為67%，降水時(shí)間為1 d，積溫為63.5 ℃。此條件下流蘇種子在常溫干燥貯藏和室溫濕沙層積赤霉素處理濕沙催芽試驗(yàn)過(guò)程中均極易發(fā)生霉變，在生產(chǎn)實(shí)踐中應(yīng)該注意溫度與濕度的控制，從而避免發(fā)霉。

(a)室溫干燥貯藏的流蘇種子 (b)室溫干燥貯藏的流蘇種子內(nèi)部霉變情況 (c)室溫濕沙層積赤霉素處理濕沙催芽的流蘇種子圖2 流蘇種子發(fā)霉現(xiàn)象Fig.2 The mildew phenomenon of C.retusus seeds

2.5 致霉菌多樣性分析

常溫干燥貯藏和室溫濕沙層積赤霉素處理濕沙催芽的流蘇種子測(cè)序覆蓋度(goods coverage)結(jié)果均較高(為1)。常溫干燥貯藏種子致霉菌群落樣品中共鑒定與拼接出99條ASV序列，其Shannon指數(shù)(樣品中的分類總數(shù)及其占比)和Simpson指數(shù)(群落內(nèi)物種分布的多樣性和均勻度)分別為3.04和0.8。室溫濕沙層積赤霉素處理濕沙催芽樣品中只有35條ASV序列，Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)分別為0.27、0.06。常溫干燥貯藏種子致霉菌群落多樣性高于室溫濕沙層積赤霉素處理濕沙催芽樣品，兩者重復(fù)的ASV序列有18條。

2.6 致霉菌種類鑒定結(jié)果與分析

室內(nèi)常溫干燥貯藏的霉變種子中共鑒出40種致霉菌。其中帚狀曲霉(Aspergilluspenicillioides)的豐度為33.93%，脂節(jié)擔(dān)菌(Wallemiasebi)的豐度為31.20%；踝節(jié)菌(Talaromycesatroroseus)、圓錐曲霉(Aspergillusconicus)、Aspergillusglabripes、Zygoascuspolysorbophila、喬治亞青霉(Penicilliumgeorgiense)、朱黃籃狀菌(Talaromycesminioluteus)的豐度則較低，分別為8.53%、1.10%、0.45%、0.42%、0.39%和0.22%。因此室內(nèi)常溫干燥貯藏種子中的致霉菌主要是帚狀曲霉和脂節(jié)擔(dān)菌踝節(jié)菌(見圖3)。

圖3 流蘇種子致霉菌的相對(duì)豐度Fig.3 The relative abundance of mildew fungus in C.retusus seeds

室溫濕沙層積赤霉素處理濕沙催芽發(fā)霉種子中共鑒定出13種致霉菌。其中茄病鐮刀菌(Fusariumsolani)的豐度最高，為97.30%。其他的真菌類型Pithyavulgaris、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、Fusicollaseptimanifiniscientiae、Tausoniapullulans、煙草赤星病菌(Alternariaalternata)、Fusariumlacertarum、帚狀曲霉、脂節(jié)擔(dān)菌的豐度分別為1.29%、0.34%、0.22%、0.10%、0.04%、0.03%、0.12%、0.12%，所占比例均極低。據(jù)此可知，濕沙催芽霉變種子上附著的致霉菌主要為茄病鐮刀菌(見圖3)。雖然帚狀曲霉和脂節(jié)擔(dān)菌在室溫濕沙層積赤霉素處理濕沙催芽發(fā)霉種子菌群中也存在，但豐度較低，這表明引起流蘇種子室內(nèi)常溫干燥貯藏和濕沙層積赤霉素處理濕沙催芽的主要霉變菌種不同。

3 討論與結(jié)論

3.1 種子發(fā)霉現(xiàn)象分析

研究中流蘇種子霉變高發(fā)期的時(shí)間段為4月中旬，通過(guò)觀察分析發(fā)現(xiàn)流蘇種子在日均溫14.2 ℃，最高氣溫為22 ℃，相對(duì)濕度為67.00%的環(huán)境條件下易發(fā)生霉變。相關(guān)研究也表明，淀粉、油脂等含量高的種子在一定溫度、濕度條件下容易發(fā)生霉變現(xiàn)象[8-10]。劉愛民等[8]在研究雜交水稻劣變特性時(shí)，考察了6個(gè)母本系品種的雜交種子，發(fā)現(xiàn)降雨高濕是雜交水稻種子霉變現(xiàn)象普遍存在的原因。楊書香等[10]基于武漢市四季溫度和濕度設(shè)置4個(gè)不同的溫度和濕度進(jìn)行正交試驗(yàn)，研究花生的霉變情況，發(fā)現(xiàn)花生種子在18 ℃、70%的濕度條件下處理3 d后出現(xiàn)霉變現(xiàn)象，在18 ℃、95%的濕度條件下處理3 d后霉變率為30%，在28 ℃、90%的濕度環(huán)境中3 d霉變率達(dá)80%；初步鑒定霉變菌種為黃曲霉菌和黑曲霉菌。劉龍龍等[11]發(fā)現(xiàn)收獲期的燕麥籽粒在夜間氣溫8～13 ℃、白天溫度15～25 ℃且濕度較高的環(huán)境中易發(fā)生霉變。蔣淑儒等[12]通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)濕度大的環(huán)境中油茶籽更容易發(fā)生霉變現(xiàn)象。

本研究中流蘇種子千粒重為200.90g，凈度為93.90%，含水量為13.35%，種子縱、寬的平均數(shù)分別為11.70、4.97 mm，種子質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果表明該批種子質(zhì)量良好[13-14]。TTC種子活力檢測(cè)發(fā)現(xiàn)正常流蘇種子生活力為81.82%，霉變后的生活力為44.00%，這表明室內(nèi)干燥貯藏過(guò)程中發(fā)生霉變會(huì)導(dǎo)致部分種子失活、生活力下降。吸水率試驗(yàn)表明流蘇種子萌發(fā)過(guò)程中所需水分沒(méi)有受到種殼限制，但隨著浸泡時(shí)間的增長(zhǎng)出現(xiàn)了霉變現(xiàn)象；在室溫濕沙層積赤霉素處理濕沙催芽過(guò)程中，發(fā)霉現(xiàn)象嚴(yán)重?zé)o法發(fā)芽，因此在流蘇種子發(fā)芽過(guò)程中亦應(yīng)嚴(yán)格防霉。

3.2 致霉菌的危害及防治分析

基于高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)流蘇樹種子常溫干燥貯藏過(guò)程中帚狀曲霉和脂節(jié)擔(dān)菌豐度最高。濕沙層積赤霉素處理濕沙催芽過(guò)程種茄病鐮刀菌的豐度最高。帚狀曲霉可以在極端干旱、低濕、鹽漬和厭氧環(huán)境條件中生存，常見于室內(nèi)灰塵、人體皮膚和干燥的食物等介質(zhì)[15-16]。脂節(jié)擔(dān)菌為節(jié)擔(dān)菌屬(Wallemia)的一種耐干旱性真菌，在海洋、土壤以及室內(nèi)和室外廣泛存在，可以引起甜點(diǎn)類食物(水果、蛋糕、面包等)、咸腌類食物(咸干魚、咸花生、咸肉等)及烘干類食物腐敗，同時(shí)可以引起蘋果煤污病，是煤污病菌類群中唯一的一個(gè)擔(dān)子菌種類[17-21]。茄病鐮刀菌(Fusariumsolani)作為分解者在土壤、發(fā)霉腐爛的植物材料中廣泛存在，是許多重要農(nóng)作物、動(dòng)物甚至人類身體中的病原體[22-26]。茄病鐮刀菌可以侵染多種作物，引起植物發(fā)生根腐病、莖腐病等癥狀，比如丹參根腐病、苜蓿根腐病、菜豆根腐病、人參根腐病、百合枯萎病、薯干腐病、桉樹枯萎病、橡膠樹莖桿潰瘍病、咖啡黑果病、大豆猝死癥等多種疾病，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[25-28]。有研究表明茄病鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢適宜碳源依次為淀粉、麥芽糖；適宜氮源依次為蛋白胨、牛肉膏、硝酸鉀，最適合溫度為25～30 ℃，最適pH為7～8，濕度對(duì)孢子萌發(fā)影響較大，完全光照有利于病原菌生長(zhǎng)[29]。

為防止流蘇種子在貯藏過(guò)程中發(fā)霉，務(wù)必嚴(yán)格控制種子含水量，同時(shí)應(yīng)注意密封，以抑制旱生真菌的大量繁殖[30]。在流蘇種子催芽前應(yīng)嚴(yán)格對(duì)種子和基質(zhì)進(jìn)行消毒，發(fā)芽過(guò)程中如出現(xiàn)霉變現(xiàn)象，應(yīng)及時(shí)施用殺菌劑如甲基硫菌靈可濕性粉劑、多菌靈等[31- 35]。