朱利威,張樹暾,焦 震

缺氧缺血性腦病(hypoxia-ischemia brain damage,HIBD)是由于各種圍生期因素引起的腦缺氧或缺血而形成的常見腦損傷,主要表現(xiàn)為意識狀態(tài)及肌張力變化。根據(jù)病情變化可分為輕度、中度、重度。輕度、中度表現(xiàn)為興奮或遲鈍,肌張力正?；驕p低,重度可表現(xiàn)為昏迷、肌張力松軟、驚厥頻繁等。多伴有嚴(yán)重的后遺癥,如腦癱、癲癇、學(xué)習(xí)困難等[1-3]。枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharide,LBP)是一種生物活性物質(zhì),從傳統(tǒng)中藥枸杞子中提取的一種水溶性多糖,具有生殖系統(tǒng)保護(hù)、抗氧化及抗衰老、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、調(diào)節(jié)血脂和降血糖、抗輻射、神經(jīng)保護(hù)、抗癌等作用[4-5]。本實(shí)驗(yàn)主要探討LBP通過Toll樣受體4(TLR4)/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)通路緩解新生大鼠HIBD的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

選取100只SD新生大鼠,體質(zhì)量18～22 g,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供,動物許可證號:SCXK(京)2017-0022。

1.1.2 藥物與試劑

枸杞多糖購自青?？灯丈锟萍脊煞萦邢薰?質(zhì)量分?jǐn)?shù)為55%,生產(chǎn)批號:KPGQZ-TQW-13-02;脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自杭州四季青生物工程材料有限公司;丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;RIPA裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠配制試劑盒購自美國Cell Signaling Technology公司;一抗和二抗購自美國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組、模型構(gòu)建及藥物處理

100只SD新生大鼠,隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組)、模型組(HIBD組)及LBP低劑量組(HIBD+L-LBP組)、中劑量組(HIBD+M-LBP組)、高劑量組(HIBD+H-LBP組),每組20只。Sham組大鼠只進(jìn)行創(chuàng)傷處理;HIBD組采用Rice-Vannucci方法建立大鼠HIBD模型[6];HIBD+L-LBP組、HIBD+M-LBP組、HIBD+H-LBP組建立大鼠HIBD模型后,再用10、20、40 mg/kg的LBP進(jìn)行藥物處理。為觀察高劑量LBP對脂多糖(LPS)激活TLR4/STAT3通路后相關(guān)蛋白表達(dá)、氧化應(yīng)激和炎性因子的影響,建立大鼠HIBD模型后,LPS激活TLR4/STAT3通路(HIBD+LPS組),再用40 mg/kg的LBP進(jìn)行處理(HIBD+LPS+H-LBP組)。

1.2.2 蘇木精-伊紅(HE)染色

處死大鼠,取腦組織,制成切片。將腦組織置于二甲苯溶液、無水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、70%乙醇中各浸泡5 min;磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌3次,然后浸入蘇木精內(nèi)染色3～5 min,水洗30～60 s;酸水浸潤20 s,水洗30～60 s;氨水中浸潤40 s,水洗30～60 s,伊紅染液中染色2 min,清洗并用濾紙吸干多余染液,再滴加適量中性樹膠,蓋玻片封固,顯微鏡下觀察染色情況并分析。

1.2.3 TUNEL染色

取大鼠腦組織切片,依次使用二甲苯和無水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、70%乙醇溶液清洗,在37 ℃條件下,用蛋白酶K處理15 min,PBS清洗。10%中性甲醛固定2次,加入末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)緩沖液,孵育5 min;再加入預(yù)熱終止液,反應(yīng)20 min,滴加過氧化酶標(biāo)志物抗體,孵育20 min,加上3,3′-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液,30 min后用無水乙醇和二甲苯固定,晾干,封片。熒光顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

1.2.4 試劑盒檢測氧化應(yīng)激水平

采用SOD、MDA、LDH試劑盒檢測其氧化應(yīng)激水平,操作過程按照附帶的詳細(xì)說明書進(jìn)行。

1.2.5 ELISA檢測炎性因子水平

ELISA試劑盒檢測白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-18、IL-6炎性因子水平,實(shí)驗(yàn)過程按照試劑盒的說明書嚴(yán)格、逐步進(jìn)行。

1.2.6 蛋白免疫印記法(Western Blot)檢測蛋白表達(dá)

剪碎大鼠腦組織,加入RIPA裂解液提取總蛋白。根據(jù)BCA檢測試劑盒測定蛋白濃度,取40 μg蛋白樣品上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜后封阻2 h,加入稀釋的一抗(Bcl-2、Bax 均為1∶800稀釋,磷酸化STAT3(p-STAT3)/STAT3、TLR4、磷酸化p65(p-p65)/p65和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)均為1∶1 000稀釋),4 ℃過夜,加入1∶2 000稀釋的二抗,室溫孵育2 h,滴加增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)化學(xué)發(fā)光液顯影,在凝膠成像系統(tǒng)中收集圖像,使用Quantity One軟件分析蛋白的相對表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 LBP對HIBD大鼠腦組織損傷的影響

與Sham組比較,HIBD組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)明顯升高,Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與HIBD組比較,HIBD+L-LBP組、HIBD+M-LBP組、HIBD+H-LBP組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)明顯降低,Bcl-2蛋白表達(dá)明顯升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖1、表1。

表1 各組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡率及Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)比較(±s)

圖1 各組腦組織Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)條帶圖

2.2 LBP對HIBD大鼠腦組織氧化應(yīng)激和炎性因子的影響

與Sham組比較,HIBD組腦組織SOD水平明顯降低,MDA、LDH水平以及IL-1β、IL-18、IL-6水平明顯升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與HIBD組比較,HIBD+L-LBP組、HIBD+M-LBP組、HIBD+H-LBP組大鼠腦組織SOD水平明顯升高,MDA、LDH、IL-1β、IL-18、IL-6水平明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠腦組織氧化應(yīng)激和炎性因子表達(dá)比較(±s)

2.3 LBP對HIBD大鼠腦組織TLR4/STAT3通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與Sham組比較,HIBD組大鼠腦組織p-STAT3/STAT3、TLR4、p-p65/p65和TNF-α蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05);與HIBD組比較,HIBD+L-LBP組、HIBD+M-LBP組、HIBD+H-LBP組大鼠腦組織p-STAT3/STAT3、TLR4、p-p65/p65和TNF-α蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)。詳見表3、圖2。

表3 各組大鼠腦組織TLR4/STAT3通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較(±s)

圖2 各組TLR4/STAT3通路相關(guān)蛋白表達(dá)的條帶圖

2.4 高劑量LBP對LPS激活TLR4/STAT3通路后相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與Sham組比較,HIBD組大鼠腦組織p-STAT3/STAT3、TLR4、p-p65/p65和TNF-α蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)。與HIBD組比較,HIBD+H-LBP組大鼠腦組織p-STAT3/STAT3、TLR4、p-p65/p65和TNF-α蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05);HIBD+LPS組各蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)。與HIBD+LPS組比較,HIBD+LPS+H-LBP組大鼠腦組織p-STAT3/STAT3、TLR4、p-p65/p65和TNF-α蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)。詳見表4、圖3。

表4 高劑量LBP對LPS激活TLR4/STAT3通路后相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(±s)

圖3 各組TLR4/STAT3通路相關(guān)蛋白表達(dá)的條帶圖

2.5 高劑量LBP對LPS激活TLR4/STAT3通路后氧化應(yīng)激和炎性因子的影響

與Sham組比較,HIBD組大鼠腦組織SOD水平明顯降低,MDA、LDH、IL-1β、IL-18、IL-6水平明顯升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與HIBD組比較,HIBD+H-LBP組大鼠腦組織SOD水平明顯升高,MDA、LDH、IL-1β、IL-18、IL-6水平明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);HIBD+LPS組大鼠腦組織SOD水平明顯降低,MDA、LDH、IL-1β、IL-18、IL-6水平明顯升高(P<0.05)。與HIBD+LPS組比較,HIBD+LPS+H-LBP組大鼠腦組織SOD水平明顯升高,MDA、LDH、IL-1β、IL-18、IL-6水平明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表5。

表5 高劑量LBP對LPS激活TLR4/STAT3通路后氧化應(yīng)激和炎性因子的影響(±s)

3 討 論

HIBD的病理變化有很多,主要有腦水腫、選擇性神經(jīng)元壞死、基底神經(jīng)節(jié)大理石樣變性、大腦矢狀旁區(qū)神經(jīng)元損傷、腦室周圍白質(zhì)轉(zhuǎn)化。臨床癥狀有突然高熱、畏寒、劇烈頭痛伴噴射性嘔吐,嬰幼兒可有交替出現(xiàn)的煩躁與嗜睡,雙目凝視,尖聲哭叫,拒乳,易驚等,嚴(yán)重者迅速進(jìn)入昏迷狀態(tài)[7-9]。

本實(shí)驗(yàn)研究表明,與Sham組比較,HIBD組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡率明顯升高;與HIBD組比較,不同劑量LBP組腦組織細(xì)胞凋亡率明顯降低。已有類似的研究報(bào)道,與模型組比較,LBP各劑量明顯改善小鼠腦缺血后神經(jīng)功能缺陷,大腦神經(jīng)元凋亡率明顯降低[10]。有研究表明,與正常組比較,氧糖剝奪再灌注損傷組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率明顯升高;與損傷組比較,10、20、40 mg/L的LBP可明顯降低神經(jīng)細(xì)胞凋亡率。與正常組比較,模型組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率升高;與模型組比較,LBP治療組(10、20、40 mg/L)神經(jīng)細(xì)胞凋亡率明顯降低[11]。

本研究發(fā)現(xiàn)顯示,與Sham組比較,HIBD組大鼠腦組織氧化應(yīng)激程度和炎性因子水平明顯升高;與HIBD組比較,不同濃度LBP組氧化應(yīng)激程度和炎性因子水平明顯降低。有研究結(jié)果表明,LBP能夠抑制糖尿病小鼠視網(wǎng)膜內(nèi)的血管新生及氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng),對糖尿病視網(wǎng)膜病變具有治療作用[12]。LBP可提高高脂血癥小鼠抗氧化應(yīng)激能力[13]。LBP可保護(hù)急性胰腺炎(AP)小鼠的胰腺損傷,其機(jī)制可能與抑制炎性因子、氧化應(yīng)激分子有關(guān),將為LBP的臨床應(yīng)用提供依據(jù)[14]。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示,與Sham組比較,HIBD組大鼠腦組織TLR4/STAT3通路相關(guān)蛋白表達(dá)明顯升高;與HIBD組比較,不同濃度LBP組TLR4/STAT3通路相關(guān)蛋白表達(dá)明顯降低。鄧俊超等[15]研究發(fā)現(xiàn),佛司可林通過抑制TLR4/STAT3通路減輕新生大鼠HIBD氧自由基水平和炎癥水平。

本實(shí)驗(yàn)研究顯示,與HIBD組比較,LPS激活大鼠腦組織TLR4/STAT3通路后,其相關(guān)蛋白表達(dá)明顯升高,但LBP降低了LPS激活TLR4/STAT3通路后p-STAT3/STAT3、TLR4、p-p65/p65和TNF-α蛋白表達(dá)。與HIBD組比較,LPS激活TLR4/STAT3通路后,大鼠腦組織氧化應(yīng)激程度和炎性因子水平明顯升高,但LBP通過抑制TLR4/STAT3通路活化,降低氧化應(yīng)激程度和炎性因子水平。

綜上所述,LBP通過抑制TLR4/STAT3通路減輕新生大鼠HIBD,為治療心腦血管疾病提供了機(jī)制。