尹春月,龍 禹

(廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,南寧 530021)

整個妊娠期胎盤微環(huán)境中的氧氣水平不是恒定的,妊娠早期生理性氧張力為2%～3%,妊娠中期和晚期為6%～8%[1]。這個缺氧階段與胎盤發(fā)育的最關(guān)鍵階段重疊,即胚泡植入、絨毛外滋養(yǎng)細胞(extravillous trophoblast,EVT)侵襲和螺旋動脈重塑。在胎盤早期發(fā)育過程中,細胞滋養(yǎng)層細胞(cytotrophoblast,CTB)增殖并形成細胞柱,該細胞柱遠端的CTB在孕早期開始分化為兩種唯一與母體接觸且具有遷移和侵襲能力的EVT,包括血管內(nèi)絨毛外滋養(yǎng)細胞(endovascular extravillous trophoblast,eEVT)和間質(zhì)絨毛外滋養(yǎng)細胞(interstitial extravillous trophoblast,iEVT),eEVT侵入螺旋動脈形成EVT栓,阻止母體血液流入絨毛空間,從而創(chuàng)造持續(xù)10周的低氧妊娠環(huán)境[2]。在妊娠頭3個月末,這些栓子逐漸消散,eEVT開始沿著血管向近端遷移,將螺旋動脈重塑成低阻力高流速的血管,逐漸將局部子宮氧張力水平升高并恢復到其“正?！鄙硭?iEVT則侵襲至子宮肌層的上1/3處。這種缺氧缺血/再氧合過程是正常的、生理的,并且對于正常的胎兒和胎盤發(fā)育至關(guān)重要[3]。氧張力水平的變化與胚胎發(fā)育結(jié)局密切聯(lián)系。先兆子癇、早產(chǎn)、復發(fā)性流產(chǎn)等妊娠相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展與氧合異常有關(guān)[4]。

氯化鈷(cobalt chloride,CoCl2)已被廣泛應用于模擬缺氧環(huán)境的化學試劑,能產(chǎn)生與缺氧缺血相似的反應[5],其誘導的化學性缺氧模型具有穩(wěn)健性好、可重復性高的優(yōu)點。本研究擬分離和培養(yǎng)原代人早孕EVT,探討其在CoCl2不同濃度和處理時間條件下的增殖、活力及缺氧相關(guān)反應基因的變化,以建立一個可靠、檢測方便的EVT細胞缺氧模型,為探索及防治EVT侵襲缺陷與缺氧的疾病奠定體外實驗的細胞學基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象 選取2022年4月至2023年1月在廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院行人工流產(chǎn)的正常孕婦。納入標準:年齡18～45歲;妊娠前無心血管系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)及糖尿病等病史;B超證實為宮內(nèi)妊娠,宮腔內(nèi)見孕囊、胚芽,并有原始心管搏動,孕周6～9周;術(shù)前3個月內(nèi)未服用過甾體類激素及抗早孕藥物。本實驗已獲得患者知情同意及倫理審查。

1.1.2 主要試劑與儀器 DMEM/F12培養(yǎng)液購自美國Gibco公司;DNase I酶、氯化鈷購自美國Sigma-Aldrich公司;優(yōu)級胎牛血清、胰酶購自大連美侖公司;兔抗人細胞角蛋白7抗體(cytokeratin 7,CK7)、兔抗人波形蛋白抗體(vimentin,VIM)、兔抗人人白細胞抗原-G蛋白抗體(human leucocyte antigen-G,HLA-G)、小鼠抗兔HRP多克隆二抗購自Bioss公司;Trizol試劑購自invitrogen公司;熒光定量PCR試劑盒購自Novoprotein公司;倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 原代EVT細胞分離培養(yǎng)和鑒定 參考Handschuh等[6]方法,取正常6～9孕周人工流產(chǎn)的絨毛組織,用含高濃度雙抗的PBS沖洗,剪除蛻膜、胎膜及血管,給予10mL/g組織復合酶(含0.02% EDTA的0.125%胰酶、DNase I酶、4.2mmol/L MgSO4、25mmol/L HEPES)靜置消化35～40min,依次經(jīng)200目和400目篩網(wǎng)過濾,300×g離心10min。將細胞沉淀重懸于2mL紅細胞裂解液,裂解10min,500×g離心5min,去上清,加5倍體積PBS清洗細胞,500×g離心3min。將細胞重懸于含20%血清的完全培養(yǎng)基,細胞計數(shù),接種于預先用鼠尾膠原蛋白I包被的培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿,置5% CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)32～48h,更換新的培養(yǎng)基或干預。用HLA-G、CK7和VIM抗體鑒定EVT。

1.2.2 免疫細胞化學 制作EVT細胞爬片,培養(yǎng)32～48h,4%多聚甲醛室溫固定細胞30min,PBS洗滌3～5次。室溫封閉30min,加CK7、HLA-G和VIM一抗(稀釋比均為1∶100),4℃過夜。PBS清洗3次,每次5min,加HRP標記的二抗(稀釋比為1∶100)室溫孵育1h,PBS清洗,DAB顯色10～20min。顯微鏡觀察和拍照。

1.2.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應實驗(reverse transcription quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR) 按說明書使用TRIzol法提取RNA,將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。管家基因β-肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)參。引物序列:β-actin:F:CATTAAGGAGAAGCTGTGCT,R:GTTGAAGGTAGTTTCGTGGA。HIF-1α:F:GGCAGCAACGACACAGAAAC,R:TGCAGGGTCAGCACTACTTC。擴增條件:預變性95℃,1min;95℃,20s,60℃,1min,40個循環(huán)。實驗重復3次,取平均值來確定該基因mRNA水平表達。缺氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)mRNA相對表達量由β-actin矯正后以2-ΔΔCt計算。

1.2.4 CCK-8檢測 將EVT細胞按5×103/孔接種于96孔板,培養(yǎng)36～48h,給予不同濃度(0、50、100、150、300、600μmol/L)CoCl2和不同缺氧時間(6、12、24、48h)干預細胞,干預結(jié)束后加10μL CCK-8于37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2h。酶標儀檢測各孔OD值(檢測波長為450nm)。

2 結(jié) 果

2.1 原代EVT的體外培養(yǎng)及鑒定 原代分離的EVT細胞體外培養(yǎng)2h后開始貼壁,24h后基本貼壁和鋪展,貼壁細胞形態(tài)多樣,多呈上皮細胞樣生長,個別細胞呈纖維細胞樣。高密度種植時,EVT細胞間觸角相互連接緊密,多數(shù)培養(yǎng)3～4d逐漸積聚成團,頻繁操作易造成細胞片狀脫壁。相對絨毛滋養(yǎng)細胞(villous trophoblast,vCTB),EVT顯著特點是細胞發(fā)生遷移聚集現(xiàn)象(圖1A),但不會相互融合為多核的合體滋養(yǎng)層細胞(syncytio trophoblasts,STB)。相差顯微鏡下,細胞呈不規(guī)則的多角形,細胞核大居中,胞漿豐富透明。體外培養(yǎng)的EVT細胞CK7(圖1B)、HLA-G染色呈棕黃色(圖1C)、VIM淺棕色(圖1D)。隨機5個視野下,染色陽性率高,表明體外培養(yǎng)的細胞為人EVT且純度高,可滿足后續(xù)試驗需要。

圖1 早孕人EVT的細胞形態(tài)與免疫細胞化學鑒定

2.2 CoCl2對原代EVT細胞存活率的影響 CCK-8法檢測結(jié)果顯示,EVT的細胞存活率呈時間和濃度依賴性。相對于對照組(0μmol/L CoCl2),600μmol/L CoCl2組較早出現(xiàn)細胞毒性作用(P<0.05),余濃度組的細胞存活率變化不明顯。隨著時間增加,各濃度組的細胞存活率呈濃度依賴性降低:0～150μmol/L濃度組有下降趨勢,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),300μmol/L濃度組在24h對細胞抑制作用明顯,相對對照組,其細胞形態(tài)發(fā)生明顯改變,表現(xiàn)為細胞觸角大部分消失,空泡形成增多(圖2),但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),48h后細胞存活率小于50%(P<0.05)。600μmol/L濃度組在缺氧24h后細胞基本全部死亡,細胞存活率均小于50%(P<0.05)。見表1。

表1 CoCl2對EVT細胞存活率的影響

圖2 0μmol/L CoCl2和300μmol/L CoCl2對原代EVT細胞形態(tài)的影響(×100)

2.3 CoCl2對原代EVT HIF-1α mRNA表達的影響 取150μmol/L設(shè)時-效關(guān)系組,相對于對照組0h,缺氧6、12、24、48h組HIF-1α mRNA相對表達量分別是其0.50倍、0.64倍、1.45倍和3.00倍(圖3A)。缺氧24h,CoCl2對EVT細胞存活率影響尚可(表1、圖4)且HIF-1α mRNA表達量顯著增加,因此,取24h設(shè)量-效關(guān)系組,相對于對照組,50、100、150μmol/L CoCl2組HIF-1α mRNA相對表達量分別是其1.23倍、1.28倍、1.58倍(P<0.05)(圖3B)。

圖3 CoCl2對原代EVT HIF-1αmRNA表達的影響

圖4 150μmol/L CoCl2對原代EVT細胞形態(tài)的影響(×100)

3 討 論

由于不同物種間胎盤結(jié)構(gòu)、功能及發(fā)育過程存在高度異質(zhì)性[7-8],目前尚缺乏可靠的動物模型,體外模型仍是當前滋養(yǎng)細胞相關(guān)疾病的主要研究模型,且多以絨毛膜癌細胞系(如BeWo、JAR和JEG3)或滋養(yǎng)層永生化細胞系(HTR8/SVneo和SW71)為主,然而這些細胞系在來源及功能上異于真正滋養(yǎng)層細胞,體外實驗數(shù)據(jù)的代表性和說服力有限[9]。本研究成功分離和培養(yǎng)原代EVT,并利用CoCl2構(gòu)建了化學性缺氧細胞模型,結(jié)果提示適宜的缺氧濃度和時間為150μmol/L和24h,這為后續(xù)研究奠定了體外實驗的細胞學基礎(chǔ)。

氧在整個妊娠期胎盤發(fā)育中發(fā)揮著重要作用,缺氧環(huán)境影響滋養(yǎng)細胞增殖、分化、遷移和侵襲能力,氧調(diào)節(jié)異常引起胎盤發(fā)育不全可導致多種妊娠相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展[2]。因此,構(gòu)建缺氧細胞模型顯得尤為重要。細胞缺氧有物理性缺氧法和化學性缺氧法。目前物理性缺氧主要有2種方式:(1)培養(yǎng)室構(gòu)建,通過調(diào)節(jié)室中氣體成分來維持氧氣濃度。每次將細胞移出進行操作時,會迅速建立常氧環(huán)境,且平衡至所需的低氧氣濃度(需較長時間)。而且傳感器監(jiān)測的是培養(yǎng)箱內(nèi)部氣體環(huán)境的氧氣濃度,非培養(yǎng)液的溶解氧濃度[10]。(2)液態(tài)石蠟隔絕空氣法,但是石蠟對培養(yǎng)基液面不完全密封,隔絕氧氣的效果不佳,這些最終將影響實驗結(jié)果的穩(wěn)定性和準確性[10]?；瘜W性缺氧法通過在細胞培養(yǎng)液中添加化學試劑實現(xiàn),如CoCl2、去鐵氧胺和連二亞硫酸鈉等[10]。

CoCl2是一種廣泛應用誘導體外缺氧的化學試劑。通過異二聚體缺氧誘導因子1(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)蛋白的表達來評估缺氧與否,該蛋白由兩個亞基組成:HIF-1α和HIF-1β。HIF-1β在細胞核中組成型表達,HIF-1α受氧張力調(diào)節(jié)。促進HIF-1α降解HIF特異性脯氨酰羥化酶具有鐵結(jié)合核心,該核心處的鐵被認為對其酶活性至關(guān)重要[5]。這種鐵可被鈷取代,從而抑制HIF-1α降解[5]。此外,鈷抑制HIF-1α和von Hippel Lindau(VHL)蛋白(另一種參與HIF-1α降解的蛋白質(zhì))之間的相互作用,從而阻止HIF-1α的降解[11]?？偠灾?CoCl2主要通過穩(wěn)定HIF-1α表達來模擬缺氧。研究證明,CoCl2誘導的化學性缺氧和真正物理性缺氧相關(guān)的下游靶標,如血管內(nèi)皮生成因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1(glucose transporter-1,GLUT1)的調(diào)節(jié)是相似的[12-13]。

CoCl2可用于模擬多種癌細胞系的缺氧,包括乳腺癌和卵巢癌細胞[14,15]。CoCl2可誘導HIF-1α表達,但Co2+為重金屬離子,對細胞本身具有毒性作用,毒性作用大小也因細胞種類不同而有所差異。因此,CoCl2的作用濃度和時間的條件需摸索,以保證細胞在沒有受到明顯抑制作用狀態(tài)下成功模擬缺氧。本研究結(jié)果顯示,隨著細胞培養(yǎng)液中CoCl2濃度和時間的增加,細胞的存活率呈依賴性下降趨勢。以300μmol/L,24h為分界點,CoCl2對原代EVT細胞的毒性作用趨于明顯:0～150μmol/L低濃度組隨著時間的增加,細胞存活率略有下降,300μmol/L濃度組在24h后對細胞抑制作用明顯,細胞形態(tài)發(fā)生顯著改變,48h后細胞存活率小于50%,600μmol/L濃度組在24h后表現(xiàn)為細胞存活率均小于50%。然而,由于原代EVT獲取及實驗檢測技術(shù)應用的局限性,目前利用CoCl2構(gòu)建原代EVT細胞缺氧模型的文獻有限,主要模型仍為絨毛膜癌細胞系和永生化滋養(yǎng)細胞系。Wang等[16]報道,HTR-8/SVneo細胞在200μmol/L CoCl2濃度下培養(yǎng)24h細胞活力明顯下降,同樣時間下,400μmol/L濃度組的細胞存活率小于50%。Chen等[17]統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)其半數(shù)抑制濃度為300μmol/L,本研究數(shù)據(jù)與這些結(jié)果相近。也有研究[18]表明,該細胞系的半數(shù)抑制濃度高達500μmol/L,值得注意的是腫瘤來源滋養(yǎng)細胞系JEG-3表現(xiàn)為600μmol/L的高半數(shù)抑制濃度[19]。以上表明不同來源的同類型細胞,氯化鈷對其存活率的影響有較明顯的差異。

本研究在CoCl2對原代EVT的細胞存活率和細胞狀態(tài)影響的基礎(chǔ)上,選擇150μmol/L及以下濃度組進行后續(xù)缺氧細胞模型的探索。以HIF-1α表達水平確認是否成功構(gòu)建缺氧細胞模型。對于類型不同的細胞[5],CoCl2誘導缺氧的標志HIF-1α穩(wěn)定表達可最早在2h內(nèi)觀察到,最大表達峰值出現(xiàn)在100～300μmol/L和12～48h的濃度和時間范圍。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),150μmol/L濃度組的HIF-1α mRNA表達在12h內(nèi)是降低的,24h后其呈時間依賴性增加,缺氧24h的HIF-1α mRNA表達增加且顯著(P<0.05)。本結(jié)果顯示,不同濃度組(0、50、100μmol/L和150μmol/L)作用24h,HIF-1α mRNA表達具有濃度依賴性,在一定作用時間內(nèi)其表達不斷增加,但其僅在150μmol/L 濃度組表達具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。HIF-1α mRNA表達幅度增加均不明顯,可能原因:CoCl2誘導缺氧在轉(zhuǎn)錄和翻譯上的差異,這有待后續(xù)在蛋白質(zhì)水平的驗證;與細胞自身的自我保護機制有關(guān),由于選取人早孕(6～9周)原代EVT,在體內(nèi)正值生理性“缺氧”階段[1],此時EVT可能處于缺氧保護狀態(tài)。

綜上所述,CoCl2可用于原代人EVT細胞的缺氧誘導,成功構(gòu)建化學性缺氧細胞模型,綜合CoCl2的細胞毒性作用與HIF-1α mRNA的表達,原代EVT適宜的作用濃度和時間是150μmol/L和24h,這初步為EVT侵襲缺陷等疾病的氧調(diào)節(jié)研究奠定了可靠的細胞基礎(chǔ)。