許勇前，陳 飚,2,3，覃良云，陳金妮，牛天祎，粱甲元,2,3

（1.廣西大學海洋學院，廣西 南寧 530004；2.廣西南海珊瑚礁研究重點實驗室，廣西 南寧 530004；3.廣西大學珊瑚礁研究中心，廣西 南寧 530004）

【研究意義】珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)是海洋四大生態(tài)系統(tǒng)之一，分布于熱帶和亞熱帶寡營養(yǎng)淺水區(qū)，極具生物和功能多樣性，具有重要的生態(tài)價值和經濟價值［1-2］。然而，在過去幾十年里，活珊瑚覆蓋率大幅度下降，全球珊瑚礁持續(xù)退化［3］。據(jù)Loya 等［4］、Hoegh-Guldberg 等［5］預測，到21 世紀中葉，全球活珊瑚覆蓋率會繼續(xù)下降70%～90%?！吧汉?蟲黃藻”共生體是珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)的基礎［6］，蟲黃藻為珊瑚提供了超過95%的光合能量，促進珊瑚鈣化和生長［7］；同時，珊瑚宿主也會為蟲黃藻提供二氧化碳、氮、磷以及其他無機物，以維持蟲黃藻的光合作用［8］。然而，受全球氣候變化和人類活動干擾，珊瑚與蟲黃藻的共生關系易破裂，進而導致珊瑚白化、死亡［9］。因此，了解“珊瑚-蟲黃藻”共生體的環(huán)境適應能力具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】珊瑚的環(huán)境適應能力與其共生蟲黃藻的群落結構有關。一般而言，在一定范圍內，蟲黃藻密度與珊瑚的耐受性存在正相關?；谖覈虾Ｉ汉鹘竻^(qū)大空間尺度的調查表明，具有較高蟲黃藻密度的珊瑚宿主一般也表現(xiàn)出較強的抗逆性［10］。室內模擬實驗也證實，霜鹿角珊瑚（Acropora pruinosa）的熱耐受性與共生蟲黃藻密度呈正相關［11］。此外，蟲黃藻的群落組成也影響珊瑚的環(huán)境耐受性。例如，主導系群分別為Cladocopium和Durusdinium的Pocillopora珊瑚，兩者的熱耐受性顯著不同［12］。Berkelmans 等［13］將多孔鹿角珊瑚（Acropora millepora）移植到溫度較高的海域后，占據(jù)主導優(yōu)勢的C2 亞系群逐漸被Durusdinium屬所取代，且珊瑚的耐熱性增加了1～1.5 ℃。因此，了解蟲黃藻的群落結構對于評估珊瑚的環(huán)境適應能力十分必要?！颈狙芯壳腥朦c】“珊瑚-蟲黃藻”共生體對環(huán)境的響應是一個動態(tài)變化的過程，多種環(huán)境因素均會引起蟲黃藻群落結構的變化，而目前的研究多聚焦于空間尺度上。例如，Chen等［14］基于兩個氣候帶73 個調查站位的研究發(fā)現(xiàn)，南海珊瑚共生蟲黃藻群落組成整體呈現(xiàn)出由高緯度的Cladocopium主導轉變?yōu)橹?、低緯度Cladocopium+Durusdinium主導的空間分布模式。而在時間尺度上，Gong 等［15］比較了霜鹿角珊瑚（Acropora pruinosa）和鹿角杯型珊瑚（Pocillopora damicornis）共生蟲黃藻密度的晝夜變化情況，發(fā)現(xiàn)白天的蟲黃藻密度顯著高于晚上?；跁円构?jié)律變化的監(jiān)控數(shù)據(jù)已對蟲黃藻響應短時間尺度的變化特征有了初步的認識，而跨越季節(jié)和偶發(fā)性極端氣候的生態(tài)調查則可以更好的解析蟲黃藻對環(huán)境變化的響應特征。因此，亟待補充長時間尺度，特別是季節(jié)性的生態(tài)調查。【擬解決的關鍵問題】本研究以潿洲島一種代表性的熱敏感枝狀霜鹿角珊瑚為研究對象，分別在2019—2020 年連續(xù)4 個季節(jié)定點采集珊瑚樣品，同時收集了采樣期間的遙感衛(wèi)星環(huán)境數(shù)據(jù)，通過分析4 個季節(jié)的蟲黃藻密度、群落組成、群落結構與環(huán)境變量的相關性來揭示季節(jié)性環(huán)境變化驅動蟲黃藻的生態(tài)效應。

1 材料與方法

1.1 樣品標記與采集

珊瑚樣品于2019 年7、10 月以及2020 年1、4 月在潿洲島珊瑚礁區(qū)固定苗圃（21°8.27' N，109°12.6' E）采集。每次采集5 個霜鹿角珊瑚枝（長約5 cm），采樣深度為6～7 m，共計20 個樣品。珊瑚出水后用無菌海水沖洗3 遍，避免外源蟲黃藻的干擾［16］，隨后立即裝入無菌密封袋并置于液氮速凍，回到實驗室進行后續(xù)實驗操作。

1.2 潿洲島珊瑚礁區(qū)環(huán)境數(shù)據(jù)

通過Giovanni Ocean Color tool（https://giovanni.gsfc.nasa.gov/giovanni）獲取潿洲島珊瑚礁區(qū)從2019 年7 月至2020 年7 月的遙感數(shù)據(jù)（MODISAqua 4 km）。獲取的遙感數(shù)據(jù)類別包括：表層海水溫度（Sea surface temperature，SST，℃）、光合有效輻射（Photosynthetically active radiation，PAR，E/m2·d）、海水葉綠素a 濃度（Chlorophyll a，mg/m3）、490 nm下的入射光漫射衰減系數(shù)（Kd490，Kd/m）和顆粒有機碳（Particulate organic carbon，POC，mg/m3）。

1.3 蟲黃藻密度和葉綠素a 測定

用無菌海水高壓沖洗霜鹿角珊瑚樣品，直至珊瑚組織全部脫落，確保將蟲黃藻全部沖洗下來。收集全部沖洗液，測量并記錄體積，吸取1 mL 沖洗液，8 000 r/min 離心10 min 后去上清，加入4%甲醛1 mL 進行固定。蟲黃藻計數(shù)參考朱昔恩等［17］的方法。剪取錫箔紙包裹珊瑚骨骼表面，稱量錫箔紙重量，以5 cm × 5 cm的錫箔紙稱量作為標準，根據(jù)錫箔紙重量與表面積的相關性計算珊瑚表面積［18］。單位面積的蟲黃藻密度根據(jù)Xu 等［19］的方法進行計算。

取適量珊瑚組織（約100 g）浸泡于90%丙酮中，在4 ℃黑暗條件下萃取24 h。然后在酶標儀內分別讀取波長664、647、630 nm 處的吸光值，并參考趙永平等［20］的方法計算葉綠素a 濃度。

1.4 DNA 提取、高通量測序和數(shù)據(jù)分析

每枝珊瑚剪取3 份組織用于生物學重復，每份組織90 mg，包含碳酸鈣骨骼、組織和黏液成分，用于基因組DNA 的提取，4 個季節(jié)20 個珊瑚枝共計60 份樣品。DNA 提取參照海洋動物基因組DNA 提取試劑盒（TIANGEN，DP324）說明書操作。以質檢合格的DNA 為模板，使用特異性引物ITSintfor2（5'-GATTGCAGAACTCCGTG-3'）［21］和ITS2-reverse（5 '-GGGATCCATATGCTTAAGT TCAGCGGGT-3'）［22］對蟲黃藻的ITS2 區(qū)域進行擴增。PCR 反應體系、反應條件和高通量測序流程參考Liang 等［23］的方法。測序完成后，對二代測序下機數(shù)據(jù)進行嚴格的數(shù)據(jù)拆分和質控拼接，通過DADA2 和Deblur 對優(yōu)化后的數(shù)據(jù)進行降噪處理，去除高通量測序數(shù)據(jù)中可能存在的錯誤，獲得ASV 代表序列和豐度表。將ASV 豐度表與Chen 等［14］建立的蟲黃藻數(shù)據(jù)庫比對，獲得亞系群的代表序列及豐度表，并用于后續(xù)蟲黃藻群落統(tǒng)計分析。原始數(shù)據(jù)保存于NCBI 的SRA 數(shù)據(jù)庫（Accession number：PRJNA880748）。

1.5 統(tǒng)計分析和繪圖

對4 個季節(jié)的蟲黃藻密度和葉綠素a 濃度進行單因素方差分析，采用Tukey' s HSD 多均值比較進行事后檢驗，顯著性水平設為0.05，數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示?；谙x黃藻數(shù)據(jù)庫比對后的豐度表，通過冗余分析（Redundancy analysis，RDA）計算4 個季節(jié)蟲黃藻群落結構之間的統(tǒng)計差異，檢驗環(huán)境參數(shù)和蟲黃藻群落結構之間的相關性。群落組成所展示的數(shù)據(jù)為3 個生物學重復合并為1 個樣本。RDA 分析在軟 件R(version 4.2.1) 中通過vegan 和ggplot2 完成。其他繪圖在origin2023 中完成，統(tǒng)計分析在SPSS27.0 中進行。

2 結果與分析

2.1 潿洲島珊瑚礁區(qū)環(huán)境參數(shù)的季節(jié)變化

潿洲島珊瑚礁區(qū)環(huán)境參數(shù)的季節(jié)波動顯著，幾乎所有環(huán)境參數(shù)的極值均出現(xiàn)在夏季或冬季（圖1）。其中，SST 和PAR 的變化趨勢較為類似，最低值均出現(xiàn)在冬季，最高值分別出現(xiàn)在夏季和春末，且兩者隨季節(jié)交替平穩(wěn)變化，表現(xiàn)出較強的共線性；而Chlorophyll a、Kd490 和POC 的極值也出現(xiàn)夏季或冬季，但這3 種環(huán)境參數(shù)的最高值均出現(xiàn)在冬季，最低值均在夏季，且這3 種環(huán)境參數(shù)與季節(jié)變化并未表現(xiàn)出較強的關聯(lián)性。整體來看，在采樣時間范圍內，潿洲島氣候表現(xiàn)出夏季高溫強光和冬季低溫弱光的環(huán)境特征。

圖1 潿洲島珊瑚礁區(qū)2019—2020 年各月環(huán)境參數(shù)Fig.1 Environmental parameters of Weizhou Island coral reef area in each month from 2019 to 2020

2.2 潿洲島珊瑚礁區(qū)蟲黃藻密度的季節(jié)變化

由圖2 可知，不同季節(jié)珊瑚共生蟲黃藻的密度在0.56×106～2.33×106cells/cm2之間，夏、秋、冬、春的平均蟲黃藻密度分別為1.04（±0.33）×106、1.17（±0.37）×106、1.58（±0.49）×106、1.14（±0.27）×106cells/cm2，以冬季蟲黃藻密度最高、夏季最低，冬季蟲黃藻密度約為夏季的1.5 倍。對4 個季節(jié)的蟲黃藻密度進行單因素方差分析，冬季蟲黃藻密度顯著高于夏季（F=4.431，P＜0.01）。總體而言，蟲黃藻密度表現(xiàn)出夏季低冬季高的特點。

圖2 霜鹿角珊瑚蟲黃藻密度的季節(jié)變化Fig.2 Seasonal variation of density of Symbiodiniaceae in Acropora pruinose

2.3 霜鹿角珊瑚葉綠素a 濃度的季節(jié)變化

由圖3 可知，不同季節(jié)霜鹿角珊瑚葉綠素a的濃度為9.53～13.67 μg/cm2。夏、秋、冬、春的平均葉綠素a 濃度分別為10.55（±0.81）、11.17（±0.75）、13.05（±0.48）、11.36（±0.91）μg/ cm2。其中，葉綠素a 濃度最高，其次為春季和秋季，夏季最低。冬季葉綠素a 濃度約為夏季的1.24 倍。對4 個季節(jié)的葉綠素a 濃度進行單因素方差分析，冬季顯著高于其它3 個季節(jié)（F=10.02，P＜0.05）?？傮w而言，葉綠素a 濃度變化趨勢類似于蟲黃藻密度，同樣表現(xiàn)出夏季低冬季高的特點。

圖3 霜鹿角珊瑚葉綠素a 濃度的季節(jié)變化Fig.3 Seasonal variation of concentration of chlorophyll a in Acropora pruinose

2.4 潿洲島珊瑚礁區(qū)蟲黃藻群落組成的季節(jié)性變化

蟲黃藻多樣性分析結果（圖4）顯示，共檢測到117 種ASVs 且均為Cladocopium屬。亞系群水平上，4 個季節(jié)的蟲黃藻組成較為相似，C1亞系群的相對豐度介于79.35%～82.97%之間，在4 個季節(jié)的霜鹿角珊瑚中占據(jù)絕對主導優(yōu)勢，其相對豐度無明顯變化；C1ca、C1p、C72 和Cspc等亞系群的相對豐度分別介于3.10%～6.19%、2.81%～3.95%、2.15%～2.93%、1.62%～2.64%之間，但其相對豐度隨季節(jié)交替而顯著變化（F=2.107，P＜0.01）。

圖4 霜鹿角珊瑚蟲黃藻群落組成的季節(jié)變化Fig.4 Seasonal variation of composition of Symbiodiniaceae communities in Acropora pruinose

2.5 潿洲島珊瑚礁區(qū)環(huán)境因子與蟲黃藻群落結構的相關性

RDA 分析（圖5）顯示，SST、PAR、Kd490、Chlorophyll a 和POC 均與蟲黃藻群落結構變化存在關聯(lián)性（Permutation test，P＜0.05），其中RDA1、RDA2 分別解釋蟲黃藻群落結構變化的54.97%和18.50%。整體來看，春季和秋季蟲黃藻群落結構相似度較高，而夏季和冬季的差異較大。此外，夏季蟲黃藻群落結構與SST 和PAR 呈正相關，與Kd490、Chlorophyll a、POC 則呈負相關，且環(huán)境參數(shù)對于冬季蟲黃藻群落結構的影響與夏季相反，PAR、SST、Kd490、Chlorophyll a、POC 對于蟲黃藻群落結構的影響依次減弱，SST和PAR 對蟲黃藻群落結構的影響高于Kd490、Chlorophyll a、POC。

圖5 蟲黃藻群落結構與季節(jié)環(huán)境參數(shù)之間的關聯(lián)性分析Fig.5 Correlation analysis between community structure of Symbiodiniaceae and seasonal environmental parameters

3 討論

3.1 蟲黃藻密度和葉綠素a 濃度的季節(jié)變化模式

蟲黃藻密度和葉綠素a 是珊瑚的重要生理參數(shù)，常用于評估珊瑚的環(huán)境適應能力［24］。本研究分析了潿洲島珊瑚礁區(qū)4 個季節(jié)的霜鹿角珊瑚共生蟲黃藻密度和葉綠素a 濃度變化情況，兩者均呈現(xiàn)出夏季低冬季高的規(guī)律。這與其他野外調查的結果一致［25-32］，但影響蟲黃藻密度和葉綠素a 濃度的因素較多，如表層海水溫度、光合有效輻射、營養(yǎng)鹽濃度、洋流等［19］。這兩種生理參數(shù)的變化情況不能用一種或幾種變量來解釋，需要綜合考慮研究區(qū)域的總體季節(jié)變化。

潿洲島地處南海北部的高緯度地區(qū)，與其他海域相比，表層海水溫度和光合有效輻射是影響珊瑚生長的主要因素［33］，同時也可能是驅動蟲黃藻密度和葉綠素a 濃度季節(jié)變化的重要因素。有研究通過控制溫度和光照等變量，探究珊瑚共生蟲黃藻的密度變化情況。Nielsen等［34］對多孔鹿角珊瑚（Acropora millepora）進行了為期10 周的溫度脅迫，證實23.0 ℃低溫脅迫后蟲黃藻密度顯著上升，而高溫29.5 ℃脅迫后蟲黃藻密度顯著降低。此外，體外培養(yǎng)的蟲黃藻在高溫和強光脅迫下，密度也會降低［35］。上述研究發(fā)現(xiàn)，高溫和強光會降低蟲黃藻密度，同時潿洲島夏季高溫強光和冬季低溫弱光的季節(jié)特征可能是造導致蟲黃藻密度和葉綠素a 濃度變化的重要因素。

高溫和強光會破壞蟲黃藻的葉綠體光合系統(tǒng)Ⅱ，導致活性氧過量合成［36］?；钚匝跏枪夂献饔玫恼．a物，但濃度過高時會泄漏到珊瑚組織中，破壞珊瑚細胞和DNA，進而導致蟲黃藻細胞死亡或被排出珊瑚體外［37-38］。而在溫度較低的冬季，珊瑚為了提高對光的捕獲效率，蟲黃藻由單層排列轉變?yōu)槎鄬优帕?，蟲黃藻密度和葉綠素a 濃度間接增加［39］。因此，表層海水溫度和光合有效輻射的季節(jié)性波動可能通過影響蟲黃藻的光合作用，進而驅動其密度變化。

3.2 珊瑚共生蟲黃藻主導系群的季節(jié)響應特征

本研究發(fā)現(xiàn)，C1 亞系群蟲黃藻與霜鹿角珊瑚穩(wěn)定共生，且始終占據(jù)主導地位。一般情況下，成體珊瑚與多種蟲黃藻共生，且只有一種蟲黃藻系群能占據(jù)主導地位［6,40-42］。中國南海低緯度珊瑚礁區(qū)［43］、中國香港［44-45］、日本沖繩［46］、韓國濟州島［47］以及大堡礁南部［48］等亞熱帶低緯度地區(qū)的珊瑚幾乎均由C1 亞系群主導，而其他類型的蟲黃藻相對豐度較低，這與本研究在潿洲島的調查結果一致。C1 亞系群蟲黃藻與霜鹿角珊瑚高度穩(wěn)定的共生關系可能是長期自然選擇和演化的結果。珊瑚受到外界環(huán)境脅迫時，其共生蟲黃藻可通過重組［12,49］或者替換［50-51］兩種機制來適應環(huán)境。但也有研究表明，新的共生關系并不穩(wěn)定，當外界環(huán)境脅迫消除后，蟲黃藻會恢復為原始群落組成［52-56］。因此，長期野外調查發(fā)現(xiàn)，珊瑚共生蟲黃藻的主導系群基本不變［57］。這進一步表明，盡管環(huán)境變化會短暫影響珊瑚與蟲黃藻的共生關系，但在長時間尺度上，珊瑚依舊會與最適應環(huán)境的蟲黃藻形成共生關系。

C1 亞系群蟲黃藻對高溫敏感［43］，廣泛分布于印度-太平洋和大西洋-加勒比海域［58］。在受低溫脅迫的珊瑚礁區(qū)，C1 亞系群占據(jù)了主導地位［46-47］。而C15、C3u、D1.a 等耐熱型蟲黃藻則更常見于SST 較高和頻繁發(fā)生熱白化的熱帶低緯度礁區(qū)［59］。耐熱型蟲黃藻提高了珊瑚在高溫環(huán)境中的存活率［53］，卻也減少了向珊瑚宿主轉移的有機碳，降低了珊瑚宿主的鈣化率和骨骼生長速率［60-62］，甚至會使珊瑚更容易感染疾?。?3］。在采樣期間，潿洲島的最高SST 約為31 °C，尚未達到C1 亞系群的溫度上限，耐熱型蟲黃藻并沒有競爭優(yōu)勢［43］。另一方面，C1 亞系群的溫度適應范圍較廣，能夠適應低溫與富營養(yǎng)化環(huán)境，光合效率較高［64］，而C1 亞系群在低溫下的強光合速率可保證珊瑚在冬季正常生長和碳酸鈣骨骼形成［44］。因此，表層海水溫度可能是驅動C1 亞系群蟲黃藻與霜鹿角珊瑚穩(wěn)定共生的主要原因。

3.3 季節(jié)變化對蟲黃藻群落結構的影響

本研究中，潿洲島珊瑚礁區(qū)霜鹿角珊瑚共生蟲黃藻不同季節(jié)的群落結構主要受SST 和PAR 影響。已有研究表明，表層海水溫度和光合有效輻射是影響蟲黃藻群落結構的關鍵因素［43］。室內模擬實驗也證實，杯型珊瑚（Pocilloporasp.）在受到溫度脅迫的時候，蟲黃藻群落結構隨溫度升高而發(fā)生轉變，主導系群C42 的相對豐度由76%下降至25%［65］。此外，光合有效輻射強度也會影響珊瑚共生蟲黃藻群落結構的轉變。例如，紅海萼形柱珊瑚（Stylophora pistillata）和加勒比海的山地星珊瑚（Orbicella faveolata）的主導類型蟲黃藻隨光合有效輻射減弱由Symbiodinium轉變?yōu)镃ladocopium［66-67］。可能受限于采樣頻率，本研究未發(fā)現(xiàn)主導系群發(fā)生替換的情況，C1 亞系群始終占據(jù)主導地位，不隨季節(jié)交替而顯著變化，但次主導系群變化顯著。

蟲黃藻群落由相對豐度高于5%的主導系群和低于5 %且高度多樣化的背景系群組成［68-69］，兩種類型的蟲黃藻共同決定整體群落對環(huán)境變化的響應［70］。低豐度的背景蟲黃藻比主導系群更活躍，在環(huán)境脅迫下取代主導系群后，“珊瑚-蟲黃藻”共生體的抗干擾能力增加，有助于珊瑚在極端環(huán)境下生存［71］。例如，在2005 年東加勒比海域的珊瑚白化事件中，蟲黃藻D1.a 由背景系群轉變?yōu)橹鲗等海岣吡税谆汉鞯纳媛?，增強了珊瑚抵御熱白化的能力?4］。因此，在潿洲島表層海水溫度和光合有效輻射季節(jié)性波動的環(huán)境下，背景系群蟲黃藻相對豐度的顯著上升可能有助于霜鹿角珊瑚生存。

4 結論

本研究通過對潿洲島霜鹿角珊瑚共生蟲黃藻進行調查和分析，揭示了其密度變化、葉綠素a濃度、群落組成、群落結構的季節(jié)變化規(guī)律。結果表明，夏季高溫強光致使蟲黃藻密度和葉綠素a濃度顯著降低，光合作用受損；而在冬季低溫弱光下，為提高光捕獲率，蟲黃藻密度和葉綠素a 濃度顯著增加。并且，C1 亞系群始終為4 個季節(jié)的主導系群，可能與其高光合效率、較寬的溫度耐受范圍以及富氮環(huán)境耐受等生理特性有關。此外，表層海水溫度和光合有效輻射通過影響蟲黃藻背景系群豐度變化，進而導致群落結構差異顯著。整體來看，季節(jié)性的表層海水溫度和光合有效輻射波動是影響蟲黃藻群落結構變化的主要因素。本研究以潿洲島霜鹿角珊瑚為例，解析了低緯度礁區(qū)珊瑚共生蟲黃藻群落的季節(jié)變化特征，有助于進一步揭示珊瑚微生物組的時空分布模式。