王建鳳，王澤昊，2，張藝楷，劉 艷*，馮月超*

（1．北京市科學(xué)技術(shù)研究院分析測(cè)試研究所（北京市理化分析測(cè)試中心），北京市食品安全分析測(cè)試工程技術(shù)研究中心，北京 100089；2．首都師范大學(xué) 化學(xué)系，北京 100048）

代謝組學(xué)利用高通量技術(shù)對(duì)生物體內(nèi)代謝產(chǎn)物進(jìn)行系統(tǒng)性分析。通過(guò)代謝組學(xué)研究，可以發(fā)現(xiàn)與疾病、環(huán)境、遺傳等因素有關(guān)的代謝物的變化規(guī)律和代謝途徑，從而為疾病的早期診斷和治療提供新的思路和方法。相關(guān)研究主要使用的技術(shù)包括質(zhì)譜、核磁共振和色譜等［1］。質(zhì)譜是目前最常用的技術(shù)，其中氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）技術(shù)應(yīng)用最為廣泛［2］。目前代謝組學(xué)研究仍存在數(shù)據(jù)的豐富性和復(fù)雜性等挑戰(zhàn)，因此，需要不斷完善相應(yīng)的研究技術(shù)和數(shù)據(jù)分析方法，進(jìn)一步提高代謝組學(xué)研究的可信度和廣泛性。

分子網(wǎng)絡(luò)是基于串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)的組織和可視化，根據(jù)相關(guān)化合物二級(jí)質(zhì)譜碎片的相似性［3］，計(jì)算光譜相似度，揭示同源質(zhì)譜片段的存在［4］。根據(jù)碎片相似度的高低，運(yùn)用MS-聚類(lèi)算法［5］可將質(zhì)譜碎片圖整合為一種能夠可視化的網(wǎng)絡(luò)圖譜［6］，譜圖以節(jié)點(diǎn)形式聚集形成類(lèi)似物簇［7］。在簇中，每個(gè)節(jié)點(diǎn)代表一種化合物，彼此之間通過(guò)直接或間接的方式進(jìn)行節(jié)點(diǎn)連接，表示一些簡(jiǎn)單的生化反應(yīng)。相連化合物可能互為轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，可通過(guò)將邊緣的質(zhì)量差異轉(zhuǎn)換成結(jié)構(gòu)差異，來(lái)推測(cè)識(shí)別新的化合物，進(jìn)一步揭示藥物和轉(zhuǎn)化產(chǎn)物之間的作用關(guān)系［8］，輔助人們理解這些代謝物在生物過(guò)程中的生理和病理意義。目前分子網(wǎng)絡(luò)被廣泛應(yīng)用于化合物的鑒定及發(fā)現(xiàn)、天然產(chǎn)物的代謝產(chǎn)物鑒定、天然產(chǎn)物化學(xué)成分的定性及定量等。該技術(shù)可與多種質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理工具連接，如代謝組學(xué)軟件Progenesis QI 等，作為代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理的補(bǔ)充。

氧氟沙星是一種人工合成的氟喹諾酮類(lèi)抗生素，應(yīng)用較為廣泛。研究表明氟喹諾酮類(lèi)抗生素會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重或致殘的副作用，這些副作用可能是不可逆的［9］。目前關(guān)于氧氟沙星體外降解產(chǎn)物的研究較多［10-18］，體內(nèi)代謝產(chǎn)物的研究尚未成熟。

本文以氧氟沙星為研究對(duì)象，利用超高效液相色譜-四極桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜（UHPLC-Q-TOF MS），建立特征分子網(wǎng)絡(luò)（FBMN），并結(jié)合Progenesis QI和分子網(wǎng)絡(luò)（GNPS）平臺(tái)提供的特征分子網(wǎng)絡(luò)快速分析氧氟沙星在小鼠肌肉、結(jié)腸、肝臟、腎臟、回腸和內(nèi)容物中的代謝產(chǎn)物。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材 料

氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品（純度99．3%，德國(guó)Dr．Ehrenstorfer公司）；二甲基亞砜、乙腈、甲醇、甲酸、甲酸銨（色譜純，美國(guó)Thermo Fisher Scientific 有限公司）；有機(jī)尼龍濾膜（0．22 μm，天津津騰公司）；FaVEx-NM50獸藥殘留凈化柱（巨研科技股份有限公司）。

1.2 儀器與軟件

1.2.1 儀 器ACQUITYTM超高效液相色譜儀、SYNAPT G2-Si 四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters公司）［19-20］。GR22GⅢ高速冷凍離心機(jī)（日本Hitachi公司）；N-EVAPTM112氮吹儀配備OA-SYSTM 水浴加熱裝置（美國(guó)Organomation 公司）；MS200 多管渦旋混勻儀（杭州瑞誠(chéng)儀器有限公司）；Vortex-genie 2渦旋混合器（美國(guó)Scientific Industries公司）；Milli-Q Integral 5超純水制備系統(tǒng)（法國(guó)默克公司）。

1.2.2 軟 件數(shù)據(jù)采集軟件MassLynx 4．1，數(shù)據(jù)處理軟件Progenesis QI 3．0（均為Waters公司提供）；GNPS（https：//gnps．ucsd．edu）；可視化軟件Cytoscape3．7．2。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 給藥方法實(shí)驗(yàn)選用6周齡C57小鼠10只，隨機(jī)分為兩組：對(duì)照組（10%二甲基亞砜）和氧氟沙星組（50 mg/mL，10%二甲基亞砜），每組5 只小鼠。于每日上午9：30 對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃，換算小鼠的每日灌胃劑量為200 μL，每天稱量小鼠體重。實(shí)驗(yàn)期為14 d，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取小鼠肌肉、結(jié)腸、回腸、肝臟、腎臟及內(nèi)容物樣本。

1.3.2 樣品處理取均質(zhì)后的樣品0．15 g（精確至0．01 g）于50 mL 聚丙烯離心管中，先加入10 mL 0．5%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸-乙腈溶液，2 500 r/min 振蕩提取30 min，10 000 r/min 離心10 min，轉(zhuǎn)移全部上清液；再加入10 mL 甲醇，2 500 r/min 振蕩提取30 min，10 000 r/min 離心10 min，轉(zhuǎn)移全部上清液。分別準(zhǔn)確移取兩次上清液各5 mL于FaVEx-NM50快速柱，以每秒1滴流速加壓，收集濾液，于40 ℃氮吹至近干，用0．1%甲酸-乙腈∶0．1%甲酸-5 mmol/L 甲酸銨（13∶87，體積比）溶液定容至1 mL，渦旋復(fù)溶，經(jīng)0．22 μm有機(jī)尼龍濾膜過(guò)濾，待上機(jī)［21］。

1.3.3 色譜與質(zhì)譜條件色譜條件：色譜柱為Waters Acquity BEH C18（2．1 mm×100 mm，1．7 μm）；流動(dòng)相A 為含0．1%甲酸的乙腈溶液，B 為pH 3．0 的5 mmol/L 甲酸銨溶液。梯度洗脫程序：0～0．50 min，87% B；0．50～10．00 min，87%～50% B；10．00～10．75 min，50%～5% B；10．75～12．25 min，5%B；12．25～12．50 min，5%～87% B；12．50～15．00 min，87% B。流速為0．4 mL/min；柱溫為40 ℃。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧（ESI）離子源正離子模式；質(zhì)量數(shù)掃描范圍為m/z50～1 200；源溫為150 ℃，毛細(xì)管電壓為3．0 kV，錐孔電壓為40 V，脫溶劑氣為800 L/h，脫溶劑溫度為400 ℃，掃描時(shí)間：0～15 min；掃描間隔時(shí)間：0．1 s；全信息串聯(lián)質(zhì)譜（MSE）模式檢測(cè)；分辨率模式，連續(xù)掃描數(shù)據(jù)采集，低碰撞能量為6 eV，高碰撞能量為25～45 eV。質(zhì)量校正液為亮氨酸腦啡肽。

1.3.4 數(shù)據(jù)采集與處理方法采用MassLynx 進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，將采集的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Progenesis QI 軟件中，進(jìn)行峰識(shí)別、峰對(duì)齊、基線校正、去卷積和歸一化等預(yù)處理，依據(jù)人類(lèi)代謝組數(shù)據(jù)庫(kù)（HMDB）對(duì)代謝物進(jìn)行鑒定。鑒定結(jié)果以化合物ID（包括質(zhì)量數(shù)、保留時(shí)間、碎片離子譜圖等信息）方式呈現(xiàn)。用Progenesis QI 處理數(shù)據(jù)篩選出豐度值大于3 000 的化合物，將csv 和MSP 文件登錄并上傳至GNPS 平臺(tái)，建立FBMN。在分析計(jì)算界面，基礎(chǔ)設(shè)置中將數(shù)據(jù)來(lái)源設(shè)置為Progenesis QI，母離子質(zhì)量誤差和碎片離子質(zhì)量誤差均設(shè)置為0．02 Da。高級(jí)分子網(wǎng)絡(luò)設(shè)置中，最小成對(duì)余弦分?jǐn)?shù)設(shè)置為0．7，碎片離子最小匹配數(shù)設(shè)置為6，單節(jié)點(diǎn)最大連接節(jié)點(diǎn)數(shù)設(shè)置為10，單個(gè)網(wǎng)絡(luò)最大節(jié)點(diǎn)數(shù)設(shè)置為100。在高級(jí)譜庫(kù)搜索選項(xiàng)中，導(dǎo)入speclibs 文件，庫(kù)中搜索最小匹配峰數(shù)設(shè)置為6，得分閾值設(shè)置為0．7。多變量統(tǒng)計(jì)選項(xiàng)中，距離度量設(shè)置為cosine，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行分析，所得結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 軟件，將分析計(jì)算結(jié)果可視化為分子網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 Progenesis QI鑒定結(jié)果

樣品的總離子流色譜圖如圖1所示。利用Progenesis QI結(jié)合HMDB庫(kù)對(duì)所有小鼠組織樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行鑒定，共篩選出54 種小鼠體內(nèi)可能的代謝物，信息包括代謝化合物的名稱、質(zhì)荷比、保留時(shí)間、P值、偏差（ppm）。由顯著性檢驗(yàn)得到P值，判斷化合物間的差異，結(jié)果均小于0．05，表示鑒定結(jié)果為碰巧出現(xiàn)的可能性小于5%，具有顯著意義。在鑒定的54種化合物中，大部分為內(nèi)源性代謝物，共有2個(gè)與氧氟沙星代謝直接相關(guān)的化合物，即培氟沙星、N-氧化產(chǎn)物。其保留時(shí)間、加合離子以及母離子、子離子質(zhì)量數(shù)的理論值和實(shí)際值偏差如表1所示，偏差均小于5 ppm。

表1 基于Progenesis QI軟件的氧氟沙星及代謝產(chǎn)物鑒定結(jié)果Table 1 The identified results of ofloxacin and its metabolites based on Progenesis QI software

圖1 代表性樣品的總離子流色譜圖Fig．1 Total ion chromatograms of representative samples

2.2 使用GNPS平臺(tái)繪制的特征分子網(wǎng)絡(luò)

在生成的FBMN 中，喹諾酮類(lèi)成分可以被聚集，且質(zhì)譜裂解存在一定的規(guī)律，所形成的特征分子網(wǎng)絡(luò)可視化圖如圖2所示。在GNPS庫(kù)中進(jìn)行代謝物匹配，通過(guò)化合物二級(jí)質(zhì)譜相似性原理，匹配到化合物氧氟沙星，分子式為C18H20FN3O4，加合離子為［M+H］+，中性離子質(zhì)量為361．14 Da，質(zhì)荷比為362．150 6，匹配度為0．941 496。

圖2 小鼠體內(nèi)氧氟沙星及代謝產(chǎn)物的分子網(wǎng)絡(luò)圖Fig．2 Molecular network diagram of ofloxacin and its metabolites in mice

圖2 為氧氟沙星（m/z362．150 6［M+H］+，化學(xué)式C18H20FN3O4，保留時(shí)間2．48 min）分子集群，該集群包括16 個(gè)化合物節(jié)點(diǎn)，其中與氧氟沙星直接相連的有9個(gè)節(jié)點(diǎn)，經(jīng)鑒定有5個(gè)化合物與氧氟沙星直接相關(guān)，推測(cè)的代謝化合物信息如表2所示。m/z334．156 2［M+H］+（保留時(shí)間為2．37 min）的節(jié)點(diǎn)，分子量與氧氟沙星相差CO 的精確質(zhì)量數(shù)，是氧氟沙星開(kāi)環(huán)氧化形成分子式為C17H20FN3O3的代謝產(chǎn)物；m/z378．145 5［M+H］+（保留時(shí)間為2．40 min）的節(jié)點(diǎn)，分子量與氧氟沙星相差1 個(gè)O 的精確質(zhì)量數(shù)，是氧氟沙星的羥基化或某個(gè)N 上發(fā)生氧化，分子式為C18H20FN3O5的代謝產(chǎn)物，這兩個(gè)化合物與上述Progenesis QI 方法中鑒定出培氟沙星、N-氧化產(chǎn)物的結(jié)果一致。m/z318．160 9［M+H］+（保留時(shí)間為2．49 min）的節(jié)點(diǎn)，分子量與氧氟沙星相差CO2的精確質(zhì)量數(shù)，是氧氟沙星發(fā)生了脫羧反應(yīng)，形成分子式為C17H20FN3O2的代謝產(chǎn)物。m/z261．102 5［M+H］+（保留時(shí)間為2．50 min）的節(jié)點(diǎn)與m/z318．160 9［M+H］+的節(jié)點(diǎn)相差C3H7N 的精確質(zhì)量數(shù)，是脫羧、N-脫烷基化后，分子式為C14H13FN2O2的代謝產(chǎn)物。m/z183．090 8［M+H］+（保留時(shí)間為2．71 min）的節(jié)點(diǎn)，推斷為脫氨基并開(kāi)環(huán)脫羧后，分子式為C9H11FN2O 的代謝產(chǎn)物。根據(jù)小鼠體內(nèi)代謝產(chǎn)物和分子網(wǎng)絡(luò)中的連接關(guān)系，推斷小鼠體內(nèi)氧氟沙星可能的斷裂途徑如圖3所示。

表2 特征分子網(wǎng)絡(luò)推測(cè)氧氟沙星及代謝產(chǎn)物的結(jié)果Table 2 The results of ofloxacin and its metabolites speculated by FBMN

圖3 特征分子網(wǎng)絡(luò)分析推斷小鼠體內(nèi)氧氟沙星可能的斷裂途徑Fig．3 Possible rupture pathways of ofloxacin in mice inferred by FBMN analysis

在代謝產(chǎn)物分析中，依據(jù)化合物的響應(yīng)值，在各組織樣本中均檢出大量氧氟沙星原藥殘留，肝臟和回腸樣本中氧氟沙星原型累積最多，其次是腎臟、內(nèi)容物和肌肉樣本，在結(jié)腸樣本中含量最少。如圖4 所示，代謝產(chǎn)物以脫羧產(chǎn)物為主，在各組織樣本中的響應(yīng)值較高，在肝臟和回腸樣本中的含量最高，腎臟、肌肉和內(nèi)容物樣本中較高，結(jié)腸樣本中的含量較少；脫羧后N-脫烷基化產(chǎn)物在肝臟和回腸樣本中的含量最高，在腎臟、肌肉和內(nèi)容物樣本中較高，結(jié)腸樣本中的含量較少；N-氧化產(chǎn)物在肝臟樣本中的含量最高，在回腸、結(jié)腸和肌肉樣本中的含量較少；脫氨后開(kāi)環(huán)脫羧產(chǎn)物在肝臟樣本中的含量最高，腎臟其次，在肌肉和內(nèi)容物樣本中較少；培氟沙星在肝臟樣本中的含量最高，內(nèi)容物樣本中其次，其他樣本中較少。綜上，肝臟是氧氟沙星的主要代謝場(chǎng)所，其代謝產(chǎn)物以脫羧產(chǎn)物為主。

圖4 氧氟沙星及代謝產(chǎn)物在不同樣本中的相對(duì)含量Fig．4 The relative contents of ofloxacin and its metabolites in different samples

3 結(jié) 論

本研究借助UHPLC-Q-TOF MS，使用Progenesis QI 進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理和鑒定，并首次使用GNPS 平臺(tái)的FBMN工具，建立特征分子網(wǎng)絡(luò)探究氧氟沙星在小鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，得到小鼠體內(nèi)氧氟沙星的5種代謝產(chǎn)物，分別為脫羧產(chǎn)物、培氟沙星、N-氧化產(chǎn)物、脫羧后N-脫烷基化產(chǎn)物、脫氨后開(kāi)環(huán)脫羧產(chǎn)物，并得到小鼠體內(nèi)氧氟沙星可能的斷裂途徑，發(fā)現(xiàn)肝臟為氧氟沙星主要的代謝場(chǎng)所。