張 嚴(yán)，樸林華，佟嘉程，馬炫霖，劉珺宇

（北京信息科技大學(xué) 北京傳感器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101）

微流控芯片是指通過微加工技術(shù)將微驅(qū)動(dòng)泵、微儲(chǔ)液池、微流體管路、微開關(guān)、微檢測元器件和連接器等功能元件高度集成在微芯片材料上的微全分析系統(tǒng)［1］。其可以替代傳統(tǒng)的大型檢測儀器，縮短檢測時(shí)間以及減少試劑用量［2］。微流控芯片的基底材料包括硅、玻璃和聚合物。硅材料因具有優(yōu)良的化學(xué)惰性和熱穩(wěn)定性而最早被研究人員用于制備微流控芯片的基底材料，但其由于易碎、透光性差、價(jià)格昂貴、表面化學(xué)改性困難而逐漸被玻璃所取代［3］。玻璃廉價(jià)易得，具有優(yōu)良的光學(xué)性能和電滲特性，但其加工制備較復(fù)雜，需使用具有一定危險(xiǎn)性的化學(xué)品進(jìn)行刻蝕［4］。聚合物價(jià)格低廉，具有良好的透光性和電絕緣性，易改性且適合細(xì)胞培養(yǎng)和規(guī)模化生產(chǎn)，但其存在與大多數(shù)有機(jī)溶劑不相容、成本高等問題［5］。紙基微流控芯片是以濾紙代替硅、玻璃和聚合物等基底材料，采用光刻、蠟印、噴墨打印等技術(shù)制備成具有親疏水交替結(jié)構(gòu)的微流控芯片［6］。相對(duì)于其他材料制備的微流控芯片，紙基微流控芯片具有成本低、制備簡單、尺寸小、便于攜帶、分析速度快、生物兼容性好、樣品試劑消耗少、無需額外的流體驅(qū)動(dòng)裝置、環(huán)境可降解、可實(shí)現(xiàn)多目標(biāo)物同時(shí)檢測，以及可集成多種檢測方式等優(yōu)點(diǎn)［7-8］?；诩埿酒闹T多優(yōu)勢，可將其廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷、環(huán)境檢測和食品安全等領(lǐng)域。

紙基微流控芯片的制備原理是通過物理或者化學(xué)手段填充纖維紙的空隙或者對(duì)纖維素進(jìn)行改性從而圖案化紙基材料，在紙基材上構(gòu)建允許流體定向流動(dòng)的親疏水通道。常見的制備方法包括光刻法［9］、蠟印法［10］、噴墨打印法［11］、激光打印法［12］、等離子體處理法［13］等。其中光刻法相對(duì)于其他幾種方法具有較高的加工精度，且最小通道寬度可達(dá)微米級(jí)別，可廣泛用于微小尺寸和高精度的紙芯片制備。2007 年Whitesides 課題組［14］首次提出了使用光刻法制備紙芯片，并將其成功用于葡萄糖和蛋白質(zhì)的檢測。此后，王方方等［15］利用光刻法制備了紙芯片并將其用于葡萄糖和尿酸的檢測研究，Kamali 等［9］成功利用光刻法制備紙基微流控芯片，并探究了不同工藝參數(shù)對(duì)通道質(zhì)量的影響，實(shí)現(xiàn)最小100 μm的通道寬度。但以上研究的光刻技術(shù)在制備紙芯片時(shí)需提前定制特定的掩膜版，整個(gè)工藝流程復(fù)雜、耗時(shí)、成本高昂，且每一次更改紙芯片結(jié)構(gòu)均需重新制作掩膜，欠缺靈活性。

本文提出了無掩膜光刻法制備紙基微流控芯片，首先使用L-edit 軟件設(shè)計(jì)紙芯片的版圖結(jié)構(gòu)，并通過光刻工藝將設(shè)計(jì)的版圖結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)移到濾紙上，考察了不同曝光時(shí)間對(duì)紙芯片微通道親疏水性能的影響，通過接觸角測量實(shí)驗(yàn)探究疏水圖案的疏水程度，并利用無掩膜光刻技術(shù)制備的紙芯片進(jìn)行亞硝酸鹽的檢測研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Whatman No．1 濾紙（美國丹納赫集團(tuán)），硅片（寧波江北賽邦晶圓電子材料經(jīng)營部），膠棒（Jong le Nara Co．，Ltd．），RFJ-220瑞紅光刻膠、RFX-2277負(fù)膠顯影液（瑞紅電子化學(xué)品股份有限公司），KW-4B型臺(tái)式勻膠機(jī)、SC-H-II型烤膠機(jī)（北京賽德凱斯電子有限責(zé)任公司），計(jì)時(shí)器（廣州星威電子實(shí)業(yè)有限公司），無掩膜光刻機(jī)（中國科學(xué)院光電技術(shù)研究所），超聲清洗機(jī)（深圳市春霖清洗設(shè)備有限公司），移液槍（上海力辰邦西儀器科技有限公司），亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液（國家有色金屬及電子材料分析測試中心），磺胺（天津大茂化學(xué)試劑廠），鹽酸萘乙二胺（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），電子天平（上海菁海儀器有限公司），藥匙（泰州市培正科教儀器有限公司），棕色容量瓶（江蘇華鷗玻璃有限公司）。

1.2 紙基微流控芯片的制備

紙芯片的制備基于RFJ-220 瑞紅負(fù)性光刻膠，負(fù)性光刻膠在前烘時(shí)會(huì)蒸發(fā)掉部分溶劑提高光引發(fā)劑的含量，在曝光時(shí)負(fù)性光刻膠受到光照發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)形成致密的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，而未曝光的區(qū)域則會(huì)在顯影時(shí)被顯影液除去從而恢復(fù)紙的親水性，形成具有親疏水區(qū)分的紙芯片，隨后使用紫外接觸角測量儀對(duì)疏水區(qū)域的接觸角進(jìn)行測量，并使用顯微鏡對(duì)制造的紙芯片進(jìn)行顯微觀測。紙芯片的制備工藝流程如下：

①使用L-edit 軟件繪制紙基微流控芯片結(jié)構(gòu)的數(shù)字掩膜；將濾紙剪裁成4 寸硅片大小并平整粘貼于硅片表面；

②將芯片放入勻膠機(jī)，設(shè)定轉(zhuǎn)速為慢速50 r/s，高速750 r/s，進(jìn)行勻膠；

③將勻膠后的芯片放在熱臺(tái)上，105 ℃烘烤60 s，部分蒸發(fā)光刻膠中的溶劑；

④將烘烤后的芯片取下，冷卻后放入光刻機(jī)工作臺(tái)上，并設(shè)定曝光時(shí)間5 s，膠面設(shè)置95．8；

⑤將正面曝光后的芯片揭下翻轉(zhuǎn)粘貼在硅片表面，放入光刻機(jī)中再次進(jìn)行反面曝光；

⑥將曝光完成的芯片取出放入培養(yǎng)皿中，倒入顯影液充分去除未參與曝光部分紙表面的光刻膠，從而恢復(fù)紙的親水性；

⑦將顯影后的紙芯片用水沖洗并放在熱臺(tái)上105 ℃烘烤3 min。

1.3 紙基微流控芯片檢測亞硝酸鹽

首先配制亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)濃度梯度液和檢測試劑Griess試劑。將100 μg/mL亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)樣液加水進(jìn)行稀釋得到質(zhì)量濃度分別為0、1、3、5、10、15、20 μg/mL 的亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)梯度液。Griess 試劑由磺胺溶液（A 液）和鹽酸萘乙二胺溶液（B 液）按1∶1 混合組成。A 液：稱取0．5 g 磺胺充分?jǐn)嚢枋蛊淙芙獠⒍ㄈ萦?0 mL 棕色容量瓶中儲(chǔ)存?zhèn)溆?。B 液：稱取0．5 g 鹽酸萘乙二胺加入適量水，攪拌使其充分溶解后定容于50 mL 棕色容量瓶中避光存儲(chǔ)。使用移液器將0．5 μL 的B 液滴加在紙芯片的檢測區(qū)，真空干燥5 min；然后在紙芯片的進(jìn)樣區(qū)滴加6．5 μL 亞硝酸鹽溶液，待亞硝酸鹽溶液通過紙芯片通道流至檢測區(qū)時(shí)，在檢測區(qū)滴加0．5 μL 的A 液?；前吩谒嵝原h(huán)境下與亞硝酸鹽發(fā)生重氮反應(yīng)，生成瞬態(tài)重氮鹽，之后與預(yù)先干燥沉積的鹽酸萘乙二胺反應(yīng)生成紫紅色絡(luò)合物，故在檢測區(qū)可觀察到顏色紫紅色的變化，即可證明亞硝酸鹽的存在。在滴加A液后等待5 min，然后將紙芯片置于暗箱中以閃光燈作為光源使用手機(jī)進(jìn)行拍照，將反應(yīng)產(chǎn)生的顏色圖像上傳至計(jì)算機(jī)，使用Photoshop軟件進(jìn)行處理得到不同濃度亞硝酸鹽溶液產(chǎn)生顏色變化后對(duì)應(yīng)的灰度值，從而建立亞硝酸鹽濃度與其顏色灰度值的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

1.4 紫外可見分光光度法檢測亞硝酸鹽

分別將各質(zhì)量濃度梯度的50 μL 亞硝酸鹽溶液與3 mL Griess 試劑加至比色皿中進(jìn)行混合，將3 mL水加至比色皿中作為參比溶液。設(shè)定紫外可見分光光度計(jì)的掃描波長為200～700 nm，得到各濃度對(duì)應(yīng)的掃描曲線，取掃描245 nm 處對(duì)應(yīng)的吸光度值與亞硝酸鹽濃度建立對(duì)應(yīng)關(guān)系，驗(yàn)證紙芯片檢測法與分光光度法的一致性。上述方法均在同一實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 紙芯片的制造

采用無掩模光刻法制備的紙基微流控芯片如圖1A所示，紙芯片由進(jìn)樣區(qū)（邊長4 mm）、流道（長度4 mm）和比色檢測區(qū)（邊長3 mm）組成，整個(gè)紙芯片的樣本容量約10 μL。從圖中可以看出紙芯片的邊界和通道結(jié)構(gòu)清晰，疏水壁壘呈現(xiàn)深黃色，其他區(qū)域?yàn)榘咨２捎米贤饨佑|角測量儀對(duì)疏水壁壘進(jìn)行測量得到疏水區(qū)域的接觸角為100．62°（如圖1B），表明采用無掩模光刻法制備的紙芯片疏水區(qū)域具有非常好的疏水性。深黃色的疏水壁壘是由于負(fù)性光刻膠在光刻機(jī)中受到曝光發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)形成的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，而白色的親水區(qū)域則是未參與反應(yīng)的光刻膠在顯影時(shí)被顯影液去除從而恢復(fù)白色的紙纖維。將芯片置于顯微鏡下進(jìn)行觀測（如圖1C），紙?jiān)诨謴?fù)親水性時(shí)仍殘留部分光刻膠無法去除干凈，紙纖維呈淡黃色，因此液體在其上的流動(dòng)速度下降，但下降程度在可接受范圍內(nèi)，不影響紙芯片的使用。同時(shí)可以看到曝光后形成的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)非常致密緊實(shí)，形成了較強(qiáng)的疏水屏障。

圖1 紙基微流控芯片（A），疏水壁壘的接觸角（B）及光刻后濾紙的顯微觀測圖（C）Fig．1 Paper-based microfluidic chip（A），contact angle of hydrophobic barriers（B），and microscopic observation of filter paper after photolithography（C）

2.2 制備條件的優(yōu)化

采用相同的制備工藝，在同一張紙基底上分別采用1 、2 、3 s的曝光時(shí)間對(duì)芯片進(jìn)行正反面曝光，并在光刻后的紙芯片親水區(qū)域內(nèi)分別滴加10 μL 墨水進(jìn)行測試，探究不同曝光時(shí)間對(duì)疏水屏障疏水強(qiáng)度的影響（見圖2）。結(jié)果顯示，在進(jìn)樣區(qū)滴加墨水后，1 s 曝光時(shí)間產(chǎn)生的疏水圖案處液體發(fā)生滲漏，疏水屏障未起到良好的疏水作用。2 s 和3 s 曝光時(shí)間產(chǎn)生的圖案則具有良好的疏水作用，可阻擋液體流出屏障并沿既定的圖案流至整個(gè)區(qū)域，且芯片蔬水區(qū)域的接觸可達(dá)100．56°。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明曝光時(shí)間過短會(huì)導(dǎo)致交聯(lián)反應(yīng)不充分，無法充分形成阻擋液體流動(dòng)的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，過長則會(huì)導(dǎo)致交聯(lián)反應(yīng)過重，從而對(duì)圖案邊緣產(chǎn)生影響，不利于顯影時(shí)恢復(fù)紙的親水性，也延長了制備時(shí)間。實(shí)驗(yàn)最終選擇最佳曝光時(shí)間為2 s。

圖2 曝光后墨水流動(dòng)測試圖Fig．2 Ink flow test chart after exposure

2.3 紙芯片特征尺寸研究

紙基微流控芯片通常需要紙芯片具有更小的芯片結(jié)構(gòu)以減少檢測試劑的量，同時(shí)減小芯片的尺寸以集成更多的芯片。本文采用無掩膜光刻法制作紙芯片，設(shè)計(jì)通道寬度分別為90 μm 和100 μm，采用“1．2”的制作工藝進(jìn)行無掩膜光刻，烘干后使用顯微鏡觀察和測量芯片的通道寬度，并分別在每個(gè)芯片的進(jìn)樣區(qū)滴加10 μL 黑色墨水（見圖3）。結(jié)果顯示，墨水在100 μm 的通道中可以很好的流動(dòng)，但在90 μm 的通道中流動(dòng)受阻。采用顯微鏡對(duì)100 μm通道進(jìn)行測量，得到紙芯片最小親水通道的實(shí)際寬度為（68±5） μm。

圖3 不同通道寬度的紙芯片液體流動(dòng)情況Fig．3 Liquid flow of paper chips with different channel widths

為獲得更小的芯片尺寸，不僅要盡量減小親水通道的寬度，疏水屏障的寬度同樣具有重要影響。采用相同的芯片結(jié)構(gòu)分別設(shè)計(jì)寬度為70、80、90 μm 的疏水屏障，采用“1．2”的紙芯片制作工藝，并在親水區(qū)域滴加5 μL黑色墨水，液體的流動(dòng)情況如圖4所示。70 μm寬的疏水屏障未能阻擋液體的流動(dòng)，而80 μm和90 μm寬的疏水屏障具有阻擋液體流動(dòng)的效果。使用顯微鏡對(duì)加工后的實(shí)際芯片疏水屏障進(jìn)行測量，結(jié)果顯示采用無掩模光刻法制作的紙芯片的最小疏水屏障寬度為（104±9）μm。

圖4 液體在不同寬度疏水屏障中的流動(dòng)情況Fig．4 Flow of liquids in hydrophobic barriers of different widths

實(shí)驗(yàn)顯示，顯影干燥后，紙芯片的實(shí)際親水通道寬度小于設(shè)計(jì)寬度，疏水屏障寬度大于設(shè)計(jì)寬度。這可能是因?yàn)槠毓夂蟮氖杷琳虾臀雌毓鈪^(qū)域在顯影液和水中具有不同的變形量，所以導(dǎo)致干燥后紙芯片的疏水屏障變大，而親水通道變小。

2.4 亞硝酸鹽的測定

采用紙芯片法進(jìn)行亞硝酸鹽檢測，結(jié)果如圖5 所示。從圖中可以看出亞硝酸鹽和檢測試劑反應(yīng)后發(fā)生顏色變化，且隨著亞硝酸鹽濃度的增大顏色由淺粉色變成紫紅色。使用Photoshop 軟件對(duì)手機(jī)拍攝的顯色結(jié)果進(jìn)行分析，得到不同濃度（1、3、5、10、15、20 μg/mL）亞硝酸鹽溶液及其對(duì)應(yīng)的灰度值。結(jié)果顯示，在1～20 μg/mL范圍內(nèi)二者具有良好的線性關(guān)系，線性方程為Y=3．450X+34．83，r2=0．977 0。采用相同的紙芯片和實(shí)驗(yàn)方法重復(fù)檢測10 μg/mL亞硝酸鹽溶液3次，顯色后的顏色強(qiáng)度平均值為73．6，標(biāo)準(zhǔn)誤差為0．98。

圖5 紙芯片法檢測亞硝酸鹽的顯色結(jié)果及線性曲線Fig．5 Color development results and linear curve of nitrite detection by paper chip method

紫外可見分光光度計(jì)檢測亞硝酸鹽濃度是一種被廣泛認(rèn)可的方法（如圖6A），從圖中可以觀察到不同質(zhì)量濃度亞硝酸鹽溶液在245 nm 和540 nm 處有明顯吸收峰，且以245 nm 處的吸光度最大。將亞硝酸鹽溶液質(zhì)量濃度（1、3、5、10、15、20、25 μg/mL）與其在245 nm 的吸光度建立對(duì)應(yīng)關(guān)系，結(jié)果顯示在1～25 μg/mL范圍內(nèi)二者具有良好的線性關(guān)系（圖6B），線性方程為Y=0．011 56X+3．180，r2=0．992 3。方法用于亞硝酸鹽的檢測，檢測結(jié)果與紙芯片法 具有良好的一致性。

圖6 不同質(zhì)量濃度亞硝酸鹽在200～700 nm波長下的掃描曲線（A）及不同質(zhì)量濃度亞硝酸鹽在245 nm處的吸光度（B）Fig．6 Scan curves of nitrite different concentrations at 200-700 nm（A） and absorbance values of nitrite with different concentrations at 245 nm（B）

3 結(jié) 論

本文提出了一種基于無掩膜技術(shù)的新制備方法，采用該方法制備的紙芯片具有明顯的親疏水區(qū)分，無需制作特制的掩膜版，僅需2 s 的曝光時(shí)間就可以形成較強(qiáng)的疏水屏障，疏水區(qū)域的接觸角達(dá)100．56°。該方法制備的紙芯片最小可實(shí)現(xiàn)的疏水屏障寬度為（104±9） μm，最小可實(shí)現(xiàn)的親水通道寬度為（68±5） μm，將紙芯片用于亞硝酸鹽的檢測，得到亞硝酸鹽和顯色圖像灰度值之間具有良好的線性關(guān)系，線性方程為Y=3．450X+34．83，r2=0．977 0，檢測結(jié)果與分光光度計(jì)法具有良好一致性。該方法具有加工精度高、制造簡便、工藝流程簡單、時(shí)間短及便于攜帶等優(yōu)點(diǎn)，制備的紙芯片還可用于基于顯色反應(yīng)的多種物質(zhì)檢測，具有廣泛的應(yīng)用范圍和良好的使用前景。