安 靜，肖珩玥，賀彰瑾，魯理平

（北京工業(yè)大學(xué) 環(huán)境科學(xué)系，北京 100124）

抗生素在生態(tài)系統(tǒng)中的持續(xù)積累已造成嚴(yán)重的環(huán)境危害，抗生素濫用引起了全世界的廣泛關(guān)注［1-2］。抗生素的不當(dāng)和過度使用導(dǎo)致其在環(huán)境和食品樣本中積累［3］。氯霉素（CAP）是一種高效的廣譜抗生素，被廣泛用于治療動物及人體受到的各種敏感菌感染［4］。然而，異常攝入CAP 可導(dǎo)致一系列嚴(yán)重的環(huán)境危害，造成動物和人體內(nèi)的抗生素殘留，對造血系統(tǒng)產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用，如再生障礙性貧血和白血病等［5］。因此，開發(fā)準(zhǔn)確、快速檢測痕量CAP的方法具有重要意義。

傳統(tǒng)的CAP 檢測方法側(cè)重于高效液相色譜（HPLC）［6］、氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）［7］、液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）［8］和酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）［9］。然而，上述技術(shù)在大型儀器、復(fù)雜操作和技術(shù)人員上的要求限制了其在簡單快速監(jiān)測中的應(yīng)用［10］。近年來，基于免疫反應(yīng)［11-12］和適配體化學(xué)［13-14］的電化學(xué)傳感技術(shù)在CAP 快速、靈敏檢測中受到了廣泛關(guān)注。核酸適配體是指通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化技術(shù)（SELEX），在隨機寡核苷酸序列的文庫中篩選得到的能與各種目標(biāo)物進行高親和力、高特異性識別的單鏈DNA 或RNA 分子［15-16］。與傳統(tǒng)方法相比，由于適配體易于修飾且與靶標(biāo)具有高親和力及高結(jié)合力，基于適配體構(gòu)建的氯霉素生物傳感器具有更高的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性以及更低的檢出限。量子點（QDs）一般由無機核和存在于核表面的有機基團組成，是由少量原子組成的準(zhǔn)零維半導(dǎo)體納米微晶體［17-18］。與傳統(tǒng)發(fā)光材料相比，量子點的激發(fā)光譜較寬且發(fā)射光譜較窄，具有較小尺寸的粒徑和易于功能化的表面，基于此特性，其成為具有新興價值的發(fā)光體之一［19-20］。然而，選擇合適的載體材料將量子點固定在電極表面是制備傳感器的重要環(huán)節(jié)。由于氧化石墨烯（GO）較大的比表面積和良好的生物相容性被廣泛用于生物傳感器研制［21-23］。

本文合成了量子點-氧化石墨烯納米復(fù)合材料（GO-QDs），并以其為基本單位制備適配體電化學(xué)發(fā)光（ECL）傳感器。修飾氨基基團的cDNA 與量子點表面的羧基通過酰胺鍵將cDNA 結(jié)合至電極表面。利用氯化血紅素（Hemin）可插入雙鏈DNA 堿基對中的獨特性質(zhì)及其過氧化物酶的特性造成共反應(yīng)劑過氧化氫的消耗，從而引起傳感器的電化學(xué)發(fā)光信號變化。當(dāng)CAP 存在時，由于與適配體結(jié)合致使雙鏈DNA（dsDNA）解旋，即氯化血紅素遠離電極表面，電極的電化學(xué)發(fā)光信號得以恢復(fù)，達到特異性檢測靶標(biāo)的目的。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

牛血清白蛋白（BSA）、氯化鎘、巰基丙酸（MPA）、硫代硫酸鈉、氧化石墨烯粉末均購于百靈威科技有限公司。磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鉀、氫氧化鈉均購于天津福晨化學(xué)試劑廠；聚（二烯丙基二甲基氯化銨）（PDDA）購自美國Sigma-Aldrich 公司；乙基-（3-二甲基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司；實驗用水為超純水（美國Milli-Q 公司，18．2 MΩ·cm）。所用DNA序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成純化，序列如下［24］：

Apt DNA：5'-CAA TAA GCG ATG CGC CCT CGC CTG GGG GCC TAG TCC TCT CCT ATG CGT GCT ACC GTG AA-3’。

cDNA：5'-NH2-CAT CGC TTA TTG AAA AA AAA AA-3’。

實驗儀器：ECL 分析儀（MPI-E，西安瑞瑪電子科技有限公司）、電化學(xué)分析儀（CHI 660a，上海辰華儀器有限公司）、F-4600 熒光光譜儀（日本日立公司）、JEM 2011 透射電子顯微鏡（JEOL 有限公司）、UV-2450型紫外-可見吸收光譜儀（日本島津公司）。

1.2 CdS量子點的合成及GO-QDs復(fù)合物的制備

按照參考文獻，利用一步水浴加熱法合成CdS 量子點［25］。將MPA 滴加到20 mmol/L 氯化鎘水溶液中，持續(xù)攪拌并用NaOH溶液將pH值調(diào)至10．0。在氮氣環(huán)境中，加入硫代乙酰胺并保持持續(xù)機械攪拌狀態(tài)，加熱至80 °C并使其冷凝回流4 h以上，直至觀察到亮黃色的硫化鎘量子點，將其置于4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

依據(jù)參考文獻制備GO-QDs 復(fù)合材料［25-26］：將氧化石墨烯粉末在水溶液中超聲分散至形成分布均勻的GO 懸濁液（1 mg/mL）。取GO 懸濁液與17．2%的PDDA 溶液超聲混勻，在12 000 r/min 下離心20 min 后，用水洗滌至少3 次，以去除多余的PDDA。將離心后的GO-PDDA 沉淀分散到CdS QDs 懸濁液中，通過靜電吸附作用使CdS QDs和PDDA結(jié)合。將所得混合溶液在室溫下攪拌24 h，形成GO-QDs納米復(fù)合材料。最后將所得的復(fù)合材料離心20 min，并用水洗滌分散在水中，4 ℃下儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 電極預(yù)處理

將玻碳電極（GCE）進行預(yù)處理，依次用0．3 μm和50 nm粒徑的Al2O3打磨電極呈鏡面狀態(tài)，之后依次用水、乙醇、水超聲清洗，用氮氣吹干備用。

1.4 適配體傳感器的制備

CAP電化學(xué)發(fā)光傳感器的構(gòu)建過程如圖1所示。首先取10 μL混合均勻的GO-QDs納米復(fù)合材料滴涂于玻碳電極表面，此電極記為GO-QDs/GCE。之后將電極浸泡在含0．01 mol/L EDC 和0．005 mol/L NHS的混合溶液中，以獲得羧基化的量子點。在GO-QDs/GCE 表面滴加10 μL cDNA于濕潤環(huán)境中在室溫下孵育2 h，cDNA 修飾的氨基與量子點表面的羧基形成酰胺鍵，從而固載到電極表面，此電極記為cDNA/GO-QDs/GCE。隨后取10 μL Apt DNA滴至電極表面并于濕潤環(huán)境中在室溫下孵育8 h，形成雙鏈結(jié)構(gòu)，此時記為dsDNA/GO-QDs/GCE。將電極浸入1% BSA 溶液中，在37 ℃恒溫條件下孵育60 min 以封閉剩余的未結(jié)合位點。最后孵育10 μmol/L 的Hemin 溶液90 min，電極記為hemin-dsDNA/GO-QDs/GCE。

圖1 氯霉素適配體電化學(xué)發(fā)光傳感器的構(gòu)建過程及原理Fig．1 Construction process and principle of chloramphenicol aptamer electrochemiluminescence sensor

1.5 氯霉素的檢測

將上述修飾電極浸入不同濃度的CAP溶液避光孵育120 min，用5 mmol/L PBS溶液充分洗滌，將未結(jié)合的CAP、CAP 與Apt DNA 的復(fù)合物以及脫落的氯化血紅素徹底沖洗干凈，測定電化學(xué)發(fā)光信號。測量參數(shù)為：在-1．5～0 V的電位范圍內(nèi)以100 mV/s掃描，光電倍增管電壓設(shè)置為600 V。

2 結(jié)果與討論

2.1 CdS QDs與GO-QDs的表征

硫化鎘量子點（CdS QDs）的透射電子顯微鏡圖如圖2A 所示，從圖中可明顯觀察到量子點的單位粒徑大小約為1～2 nm，分散性良好，呈現(xiàn)明顯的晶格狀條紋，形狀為球形或近球形。CdS QDs的紫外-可見吸收光譜及熒光光譜如圖2B 所示，其最大紫外吸收峰波長為379 nm，最大熒光峰值出現(xiàn)在570 nm（λex=370 nm）。將結(jié)果代入Yu等［27］提出的經(jīng)驗公式：

圖2 CdS QDs的透射電鏡圖（A）、紫外-可見吸收光譜和熒光光譜圖（B）以及GO-QDs的透射電鏡圖（C）Fig．2 Transmission electron microscope diagram of CdS QDs（A），ultraviolet-visible absorption spectrum and fluorescence spectrum（B） and the transmission electron microscope of GO-QDs（C）

其中D為直徑，將最大紫外吸收峰波長λmax=379 代入，計算得到CdS QDs 的直徑約為1．36 nm，與其透射表征結(jié)果相符。由氧化石墨烯-量子點（GO-QDs）的透射電鏡圖（圖2C）可見，基于層與層之間的電子排斥作用，GO 呈現(xiàn)薄紗形態(tài)和褶皺狀紋理。同時，大量量子點已負載到GO 表面，證明上述實驗成功合成了GO-QDs復(fù)合物。

2.2 傳感器的電化學(xué)表征

采用電化學(xué)阻抗（EIS）法分別對傳感器的修飾過程進行了各界面的性質(zhì)分析［28］。如圖3所示，阻抗譜圖中的半圓直徑數(shù)值可表征界面的電子傳遞性能，修飾GO-QDs 納米復(fù)合材料的電極阻抗（曲線B）小于裸GCE（曲線A），說明GO-QDs 復(fù)合材料具有較高的電子轉(zhuǎn)移能力。當(dāng)電極表面分別修飾cDNA（曲線C）和Apt DNA（曲線D）時，帶負電荷的DNA 磷酸骨架對陰離子（［Fe（CN）6］3-/4-）的靜電排斥作用致使阻抗逐步增大。當(dāng)修飾電極與靶標(biāo)物CAP孵育后，由于適配體與氯霉素的結(jié)合使DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解旋，并脫離電極表面，阻抗明顯減?。ㄇ€E）。實驗結(jié)果表明，該傳感器的制備方法是可行的。

圖3 修飾電極在5 mmol/L［ Fe（CN）6］3-/4（-0．1 mol/L KCl）溶液中的阻抗圖Fig．3 Impedance diagrams of the modified electrodes in 5 mmol/L［ Fe（CN）6］3-/4（-0．1 mol/L KCl） solution A：bare GCE；B：GO-QDs/GCE；C：cDNA/GO-QDs/GCE；D：ds-DNA/GO-QDs/GCE；E：CAP/hemin-dsDNA/GO-QDs/GCE

2.3 實驗條件的優(yōu)化

本傳感器的檢測信號變化基于體系中共反應(yīng)劑H2O2的消耗量，所以嵌入雙鏈DNA 中的氯化血紅素是關(guān)鍵因素。為獲得最優(yōu)條件，考察了氯化血紅素的濃度對修飾電極電化學(xué)發(fā)光強度的影響（圖4A）。如圖所示，隨著氯化血紅素濃度的增大，電化學(xué)發(fā)光信號快速減小，當(dāng)其濃度達到10 μmol/L 時，電化學(xué)發(fā)光信號趨于穩(wěn)定，因此選擇濃度為10 μmol/L 的氯化血紅素溶液。同時對氯化血紅素的孵育時間（30、60、90、120、150 min）進行了優(yōu)化，如圖4B 所示，隨著孵育時間的增加，電化學(xué)發(fā)光信號逐漸降低，并在120 min 后趨于穩(wěn)定，因此選擇最佳孵育時間為120 min。另外考察了cDNA 在電極表面的最佳孵育時間，如圖4C 所示，電化學(xué)發(fā)光信號隨著反應(yīng)時間的增加而逐漸減小，當(dāng)反應(yīng)時間為120 min 時，電化學(xué)發(fā)光信號強度不再變化，因此選擇cDNA的孵育時間為120 min。

圖4 氯化血紅素濃度（A）及孵育時間（B） 和cDNA孵育時間（C）對電化學(xué)發(fā)光強度的影響Fig．4 Effect of hemin concentration（A），hemin incubation time（B） and cDNA incubation time（C）on the electrochemiluminescence intensity

2.4 氯霉素的檢測性能

在最佳實驗條件下，考察了電化學(xué)發(fā)光信號與CAP 濃度的線性關(guān)系。如圖5 所示，傳感器的電化學(xué)發(fā)光強度隨著CAP 濃度的增加而增加，通過測量差值ΔI=Ip-I0分析其檢測性能（其中，I0為傳感器在空白溶液中的ECL 強度，Ip為CAP 溶液中的ECL 強度）。結(jié)果表明，ΔI與CAP 濃度的對數(shù)在1．0×10-10～1．0×10-6mol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢出限（LOD）為3×10-11mol/L。

圖5 適配體傳感器對不同濃度CAP的ECL響應(yīng)曲線Fig．5 ECL response curves of aptamer sensor to different concentrations of CAP CAP concentration（a-e）：1．0×10-10，1．0×10-9，1．0×10-8，1．0×10-7，1．0×10-6 mol/L

2.5 生物傳感器的選擇性、穩(wěn)定性與重現(xiàn)性

特異性是評價生物傳感器檢測性能的重要指標(biāo)之一?？疾炝随溍顾?、卡那霉素、土霉素、四環(huán)素對測量結(jié)果可能產(chǎn)生的干擾影響。在保持其他條件一致時，利用生物傳感器測量0．1 μmol/L 的CAP，其中包含100 μmol/L 的干擾物質(zhì)。如圖6A 所示，干擾物的影響不超過6%，說明該傳感器對CAP 有很高的特異性。為驗證傳感器的穩(wěn)定性，進行了10 個周期的連續(xù)循環(huán)電位掃描，可以觀察到ECL 強度比較穩(wěn)定（圖6B）。同時考察了傳感器的重現(xiàn)性，在相同條件下制備了5 支傳感器，采用上述傳感器分別測量1．0×10-7mol/L的CAP，其ECL強度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為5．6%，表明傳感器的重現(xiàn)性良好。

圖6 干擾物對CAP的ECL響應(yīng)的影響（A），以及生物傳感器連續(xù)掃描10圈的ECL響應(yīng)-時間曲線圖（B）Fig．6 Effect of other antibiotics on the electrochemiluminescence intensity of CAP at the sensor（A），and ECL intensity-time curve of continuous scanning for 10 cycles of the biosensor（B）

2.6 實際樣品分析

將本文制備的電化學(xué)ECL 傳感器用于實際樣品中CAP 的檢測，從超市選取某品牌的純牛奶，用5 mmol/L 的PBS 緩沖溶液將牛奶稀釋后采用本傳感器進行檢測和加標(biāo)回收實驗，每組選擇3 個平行樣，結(jié)果如表1所示。實際樣品的回收率為99．8%～101%，RSD 為1．1%～4．5%，表明該傳感器可用于實際樣品分析。

表1 實際樣品的檢測結(jié)果Table 1 Detection results of real samples

3 結(jié) 論

本文利用PDDA 的正電性，以氧化石墨烯為載體制備了GO-QDs 納米復(fù)合材料，實驗結(jié)果表明該復(fù)合材料具有良好的導(dǎo)電性和穩(wěn)定性。通過將cDNA 與apt DNA 雜交形成雙鏈DNA 并與氯化血紅素結(jié)合作為檢測探針，構(gòu)建了電化學(xué)發(fā)光適配體傳感器。利用氯化血紅素過氧化物酶的作用與H2O2反應(yīng)，消耗共反應(yīng)劑H2O2，使發(fā)光體量子點的發(fā)光強度減小。當(dāng)CAP 存在時，雙鏈解旋導(dǎo)致氯化血紅素遠離電極表面，電化學(xué)發(fā)光信號恢復(fù)。該方法具有靈敏度高、特異性好等優(yōu)點，可用于實際樣品中CAP 的快速測定。