余 強(qiáng)，李 祥，馬素芳

（1．山西醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)影像學(xué)院，山西 太原 030001；2．山西醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山西 太原 030001）

粘度作為細(xì)胞微環(huán)境的重要參數(shù)之一，不僅對(duì)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和新陳代謝具有重要意義，而且能夠通過影響活細(xì)胞內(nèi)生物分子和化學(xué)信號(hào)的相互作用直接或間接影響細(xì)胞的各種生理功能，如自噬等［1-5］。此外，細(xì)胞內(nèi)粘度的異常與許多疾病相關(guān)，如神經(jīng)退行性疾?。?］、糖尿病［7］、癌癥［8］等，因此，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)粘度的變化不僅對(duì)細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)研究具有重要意義，而且對(duì)相關(guān)疾病的診斷和治療具有非常重要的指導(dǎo)作用。

傳統(tǒng)的粘度檢測(cè)方法有毛細(xì)管、落球和旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)法等，然而以上方法僅適用于宏觀流體粘度的檢測(cè)，且因檢測(cè)誤差大、取樣量多、會(huì)破壞生物樣品等缺陷，無法用于細(xì)胞微環(huán)境內(nèi)粘度的檢測(cè)［9-11］。因此，亟需開發(fā)一種能夠檢測(cè)細(xì)胞微環(huán)境中粘度的新技術(shù)。熒光探針法是近年來興起的一種新型檢測(cè)技術(shù)，該方法具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、可實(shí)時(shí)檢測(cè)、非侵入式等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于活性小分子的檢測(cè)［12-14］。近年來，熒光探針法與生物成像技術(shù)相結(jié)合，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)生物標(biāo)志物的實(shí)時(shí)檢測(cè)，大大加速了學(xué)者們對(duì)生物體內(nèi)相關(guān)疾病發(fā)生和發(fā)展過程的了解，為疾病的精準(zhǔn)診斷和治療開辟了新方法［15-17］。其中，用于粘度檢測(cè)的熒光探針也被相繼開發(fā)［18-20］。然而，熒光成像技術(shù)用于細(xì)胞微環(huán)境粘度檢測(cè)時(shí)，熒光探針常受到細(xì)胞微環(huán)境中pH值、極性以及細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)的干擾。因此，構(gòu)建一種特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好的粘度探針是當(dāng)前需解決的難點(diǎn)之一。此外，目前已報(bào)道的絕大多數(shù)粘度探針合成過程復(fù)雜，探針的純化常需經(jīng)過柱層析，甚至重結(jié)晶等方法，提高了探針制備成本。通過一步合成法構(gòu)建特異性粘度探針，并減少其純化過程是當(dāng)前探針領(lǐng)域需解決的關(guān)鍵科學(xué)問題之一。2022年，董川課題組報(bào)道了一種線粒體靶向的近紅外熒光探針，并實(shí)現(xiàn)了脂肪肝組織、炎癥小鼠等模型中粘度的實(shí)時(shí)、原位和可視化檢測(cè)［21］。

粘度響應(yīng)的熒光探針的作用機(jī)制主要有以下幾種：（1）分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）機(jī)理。該類探針一般具有D（電子供體）-π-A（電子受體）的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。當(dāng)探針分子識(shí)別粘度后，分子體系的推拉電子能力發(fā)生改變，導(dǎo)致其最佳吸收光譜和最佳熒光發(fā)射光譜發(fā)生變化，進(jìn)而可通過光譜改變判斷探針分子對(duì)粘度的識(shí)別能力。如林偉英課題組構(gòu)建了一類基于ICT 機(jī)理的陽離子粘度探針，該探針可用于活細(xì)胞和斑馬魚線粒體中粘度的可視化檢測(cè)［22］。（2）熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）機(jī)理。基于FRET 識(shí)別機(jī)理的粘度探針，其最大的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是供體的最佳發(fā)射波長(zhǎng)和受體的最佳吸收波長(zhǎng)具有一定的重疊，導(dǎo)致體系發(fā)生非輻射能量躍遷，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)粘度的檢測(cè)。如林偉英課題組報(bào)道的基于FRET 識(shí)別機(jī)理的比率型熒光探針，成功應(yīng)用于線粒體中粘度的定量檢測(cè)［23］。（3）扭曲分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（TICT）機(jī)理。大多數(shù)粘度探針基于該機(jī)理構(gòu)建，此類探針一般具有可旋轉(zhuǎn)的D-π-A結(jié)構(gòu)，高粘度環(huán)境將限制分子結(jié)構(gòu)中碳碳鍵的自由旋轉(zhuǎn)，從而增大分子結(jié)構(gòu)的共軛程度，導(dǎo)致其熒光增強(qiáng)。如唐波課題組報(bào)道的花菁類粘度探針，可通過TICT機(jī)理有效識(shí)別粘度，并成功應(yīng)用于活體小鼠血栓中粘度的檢測(cè)［24］。

基于TICT 機(jī)理構(gòu)建的熒光探針，通常具備可旋轉(zhuǎn)的D-π-A 結(jié)構(gòu)，且對(duì)粘度介質(zhì)具有較好的響應(yīng)性。本文以吲哚作為電子供體，半花菁作為電子受體，通過Knoevenagel縮合反應(yīng)制備了一種具有D-π-A結(jié)構(gòu)的熒光探針1，并用于細(xì)胞中粘度的檢測(cè)，系統(tǒng)研究了探針熒光強(qiáng)度隨細(xì)胞粘度的變化。結(jié)果表明，隨著體系粘度的增加，探針的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。此外，該探針對(duì)粘度具有較好的特異性，能夠通過生物熒光成像實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞中粘度變化的檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Cary Eclipse 型熒光光譜儀（美國Varian 技術(shù)有限公司）；Bruker AVANCE Ⅲ 400 MHz 核磁共振儀（德國Bruker公司）；6210型質(zhì)譜儀（安捷倫科技公司）；SGW? X-4顯微熔點(diǎn)儀（上海儀電物理光學(xué)有限公司）；FV3000激光共聚焦顯微鏡（日本奧林巴斯株式會(huì)社）。

用于合成的原料化合物均購自安徽澤升科技有限公司；生物試劑魚藤酮和羰基氰化氯苯腙（CCCP）購自上海邁瑞爾生化科技有限公司；人宮頸癌細(xì)胞（HeLa cells）購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.2 探針的制備

探針1的合成路線如圖1所示。

圖1 探針1的合成路線Fig．1 Synthetic route of probe 1

將1，2，3，3-四甲基-3H-吲哚鎓碘化物（1．0 g，2．8 mmol）和3-甲?；胚幔?．7 g，3．9 mmol）溶于乙醇中，回流反應(yīng)5 h。濃縮反應(yīng)液并抽濾，所得固體用無水乙醇重結(jié)晶，得到的熒光探針1 為橙色固體（0．5 g，收率33%）。

1.3 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

將HeLa 細(xì)胞接種于96 孔板中后，在37 ℃、5% CO2的環(huán)境中孵育24 h 待其貼壁。棄去原有培養(yǎng)液，分別向?qū)嶒?yàn)組加入濃度為2、4、6、8、10、15、20、25、30 μmol/L的探針溶液100 μL，繼續(xù)孵育24 h。將含有探針的培養(yǎng)液棄去，向每孔中加入3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）溶液（0．5 mg/mL）100 μL，培養(yǎng)4 h后，再將二甲基亞砜（DMSO，100 μL）分別加入到實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中，置于搖床上振蕩15 min后，用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔于490 nm處的吸光度值。

1.4 細(xì)胞熒光成像實(shí)驗(yàn)

將HeLa細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱中孵育24 h待其貼壁后分為3組。第1組細(xì)胞中加探針溶液（20 μmol/L，1 mL）培養(yǎng)30 min；第2組細(xì)胞中先加CCCP 溶液（10 μmol/L，1 mL）培養(yǎng)10 h后，再加探針溶液（20 μmol/L，1 mL）繼續(xù)培養(yǎng)30 min；第3組細(xì)胞中先加魚藤酮溶液（10 μmol/L，1 mL）培養(yǎng)8 h后，再加探針溶液（20 μmol/L，1 mL）繼續(xù)培養(yǎng)30 min。培養(yǎng)完成后將3組細(xì)胞中的溶液分別棄去，加入磷酸鹽緩沖溶液（PBS）洗滌3 次，4%多聚甲醛固定15 min，重新加入PBS，在激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞熒光成像實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 探針分子結(jié)構(gòu)表征

探針分子采用核磁氫譜（1H NMR）、核磁碳譜（13C NMR）、質(zhì)譜（ESI-MS）和紅外光譜（IR）進(jìn)行表征，并進(jìn)行熔點(diǎn)測(cè)定。結(jié)果如下：1H NMR（400 MHz，DMSO-D6）：δ8．71（s，1H），8．67（s，1H），8．29-8．26（m，1H），7．81-7．75（q，J=8．0 Hz，2H），7．63-7．61（m，1H），7．59（t，J=8．0 Hz，1H），7．51（t，J=8．0 Hz，1H），7．40-7．38（m，2H），7．21（d，J=16．0 Hz，1H），4．01（s，3H），1．81（s，6H）；13C NMR（100 MHz，DMSO-D6）：δ180．67，149．34，142．92，142．55，138．84，128．01，124．91，123．6，123．15，114．06，113．97，106．58，51．35，33．52，26．87；IR（cm-1）：3 427，3 118，1 577，1 480，1 405，1 239，820，751；EST-MS（m/z）：C21H22IN2計(jì)算值：429．082 8，實(shí)測(cè)值：429．084 0［M+H］+；熔點(diǎn)為276～277 ℃。

1H NMR 中，1．81 nm處為吲哚鹽部分C3原子所連2個(gè)—CH3的H，4．01 nm處為吲哚鹽部分N原子所連—CH3的H，7．21 nm 處為π 橋碳碳雙鍵的H；IR 結(jié)果顯示，3 427、3 118 cm-1處為N—H 鍵的伸縮振動(dòng)峰，1 577、1 480 cm-1處為苯環(huán)碳碳骨架的振動(dòng)峰，820 cm-1處為π 橋中碳碳雙鍵所在碳的碳?xì)湔駝?dòng)峰，751 cm-1處為苯環(huán)上的四氫峰。ESI-MS 也準(zhǔn)確測(cè)定出化合物的相對(duì)分子量。

以上表征數(shù)據(jù)均證明探針分子成功制備。

2.2 探針的光學(xué)性能研究

2.2.1 熒光探針的粘度響應(yīng)性研究為了考察探針對(duì)粘度的響應(yīng)性能，分別測(cè)定了探針在不同比例（g∶g）的水-甘油體系中的熒光發(fā)射強(qiáng)度。如圖2A 所示，隨著體系粘度的逐漸增加，探針（λem= 517 nm）的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。與純水體系相比，90%甘油體系的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)了約100 倍，可能原因是，高粘度環(huán)境下，探針受體吲哚鎓鹽和供體吲哚環(huán)之間C—C單鍵的自由旋轉(zhuǎn)受限，使得整個(gè)分子能夠共平面，導(dǎo)致其熒光增強(qiáng)。此外，根據(jù)F?ster-Hoffmann 方程可知［25］，探針熒光強(qiáng)度的對(duì)數(shù)與體系粘度的對(duì)數(shù)具有較好的線性擬合關(guān)系（r2= 0．998 0，圖2B），且檢出限（3σ/k）為1．167 cP。以上結(jié)果表明所合成的探針對(duì)于粘度檢測(cè)具有較高的靈敏度，有望用于微環(huán)境中粘度的檢測(cè)。

圖2 不同比例H2O-甘油體系中探針1的熒光發(fā)射光譜（A）及探針1熒光強(qiáng)度對(duì)數(shù)與體系粘度對(duì)數(shù)的線性關(guān)系（B）Fig．2 Fluorescence emission spectra of probe 1 in different ratios mixture of water-glycero（lA）and linear relationship between lgI and lgη（B）cprobe 1 = 10 μmol/L，λex = 480 nm

2.2.2 熒光探針的選擇性為了考察探針對(duì)粘度的選擇性，在探針?biāo)芤褐蟹謩e加入不同的活性小分子、離子等，并測(cè)定體系的熒光強(qiáng)度，結(jié)果如圖3A 所示：當(dāng)探針?biāo)芤褐屑尤肫渌》肿踊螂x子后，體系的熒光強(qiáng)度未發(fā)生明顯改變，僅在甘油溶液中的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。此外，通過測(cè)定探針在不同溶劑體系中的熒光強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)其僅在甘油體系中的熒光明顯增強(qiáng)，而在其它溶劑中的熒光強(qiáng)度均無明顯變化（圖3B）。由此可見，探針受其它物質(zhì)或周圍環(huán)境的影響較小，對(duì)粘度具有較好的選擇性，具有檢測(cè)細(xì)胞微環(huán)境中粘度變化的潛質(zhì)。

圖3 探針1在不同干擾物（A）及不同溶劑（B）中的熒光光譜Fig．3 Fluorescence spectra of probe 1 in the presence of various analytes（A） and in different solvents（B）cprobe 1 = 10 μmol/L，λex = 480 nm

2.2.3 熒光探針的穩(wěn)定性由于細(xì)胞內(nèi)環(huán)境組成復(fù)雜，一種性能優(yōu)良的粘度響應(yīng)熒光探針還應(yīng)具備良好的光穩(wěn)定性和pH 值穩(wěn)定性。為考察探針的光穩(wěn)定性和pH 穩(wěn)定性，分別測(cè)定了室溫光照下探針?biāo)芤杭疤结樀?0%甘油-水溶液在不同時(shí)間的熒光強(qiáng)度，結(jié)果如圖4A 所示。由圖可知，兩種體系中探針的熒光強(qiáng)度在60 min 內(nèi)均未發(fā)生明顯改變。此外，對(duì)探針?biāo)芤杭疤结樀?0%甘油-水溶液在不同pH 值下的熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖4B 所示。在pH 4．0～9．0 范圍內(nèi)，探針的熒光強(qiáng)度均未發(fā)生明顯變化。以上結(jié)果顯示探針本身及其響應(yīng)粘度后的熒光強(qiáng)度均不受光照和pH值的影響，說明探針具有較好的光穩(wěn)定性和pH值穩(wěn)定性。

圖4 光照（A）及pH值（B）對(duì)探針熒光強(qiáng)度的影響Fig．4 Effects of light（A） and pH values（B） on fluorescence of probe 1 cprobe 1 = 10 μmol/L，λex = 480 nm

2.3 探針的生物應(yīng)用

2.3.1 熒光探針的細(xì)胞毒性研究利用MTT 法測(cè)定了不同濃度的探針溶液對(duì)細(xì)胞存活率的影響。將不同濃度（0～30 μmol·L-1）的探針溶液分別置于HeLa 細(xì)胞中培養(yǎng)24 h 后，細(xì)胞的存活率均達(dá)到85%以上（圖5），證明探針溶液的濃度對(duì)細(xì)胞存活率影響不大，可應(yīng)用于細(xì)胞微環(huán)境中粘度的檢測(cè)。

圖5 HeLa細(xì)胞在不同濃度探針1中的存活率Fig．5 The viabilities of HeLa cells in different concentrations of probe 1

2.3.2 細(xì)胞熒光成像研究探針響應(yīng)粘度主要通過熒光強(qiáng)度變化進(jìn)行?；诖?，將HeLa 細(xì)胞與探針溶液共孵育30 min，可觀察到微弱的熒光（圖6A）；分別將CCCP 或魚藤酮兩種藥物作用于HeLa細(xì)胞一段時(shí)間后，再加入探針溶液孵育30 min，可觀察到細(xì)胞熒光強(qiáng)度明顯增加（圖6B、圖6C、圖6D）。這是因?yàn)镃CCP和魚藤酮均可導(dǎo)致細(xì)胞線粒體功能異常，進(jìn)而引起細(xì)胞微環(huán)境的粘度增加。藥物刺激誘導(dǎo)細(xì)胞前后，探針?biāo)尸F(xiàn)的明顯的熒光增強(qiáng)現(xiàn)象表明該探針可對(duì)細(xì)胞微環(huán)境中的粘度變化進(jìn)行有效檢測(cè)。

圖6 HeLa細(xì)胞的熒光成像Fig．6 Fluorescence imagings of HeLa cells A． cultured with probe 1（20 μmol/L） for 30 min；B． incubated with CCCP（10 μmol/L） for 10 h，and then incubated with probe 1（20 μmol/L）for another 30 min；C． incubated with rotenone（10 μmol/L） for 8 h，and then incubated with probe 1（20 μmol/L） for another 30 min；D． relative fluorescence intensity comparison of A，B and C，scale bar：20 μm

3 結(jié) 論

以1，2，3，3-四甲基-3H-吲哚鎓碘化物為電子受體，吲哚為電子供體，通過一步反應(yīng)成功制備了具有D-π-A結(jié)構(gòu)的熒光探針。通過考察探針的光學(xué)性質(zhì)及細(xì)胞成像情況，系統(tǒng)探究了探針對(duì)不同粘度的響應(yīng)性能及其對(duì)細(xì)胞中粘度變化的檢測(cè)能力。結(jié)果表明，探針的熒光強(qiáng)度隨著細(xì)胞粘度的增加而增強(qiáng)，且不受其它物質(zhì)的干擾，探針對(duì)粘度具有較好的特異性。此外，探針對(duì)細(xì)胞的毒性較小，可以靈敏地檢測(cè)藥物刺激后細(xì)胞的粘度變化，證明該探針有進(jìn)一步應(yīng)用于生物體內(nèi)粘度檢測(cè)的潛力。