王 璐，曾廣豐，侯穎燁，董 潔，蔡翠玲，肖可茵，張憲臣，李嘉儀，謝建軍*

（1．廣州海關(guān)技術(shù)中心，廣東 廣州 510623；2．國(guó)家級(jí)進(jìn)出口食品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)驗(yàn)證評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室（化妝品），廣東 廣州 510623；3．中山海關(guān)技術(shù)中心，廣東 中山 528400）

我國(guó)作為世界化妝品消費(fèi)第一大國(guó)，化妝品安全問(wèn)題日益成為關(guān)注焦點(diǎn)?；瘖y品禁用原料目錄包括1 284項(xiàng)禁用物質(zhì)［1］，其種類繁多，數(shù)量龐大，然而現(xiàn)有的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)方法有限，可能會(huì)使某些違法添加行為處于監(jiān)測(cè)盲區(qū)［2］。因此，對(duì)于化妝品中風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)的檢測(cè)，亟需建立一種滿足定性與定量要求的快速、高效的廣譜篩查模式。

常見(jiàn)的廣譜篩查技術(shù)包括組學(xué)［3］、指紋圖譜［4］、拉曼光譜［5］、高分辨質(zhì)譜［6-8］等，其中，以飛行時(shí)間質(zhì)譜（TOF MS）為代表的高分辨質(zhì)譜技術(shù)因具有質(zhì)量分辨率高、掃描速度快、采集信息量大等優(yōu)勢(shì)，在有毒有害化合物篩查鑒定方面被廣泛應(yīng)用［9-12］。例如，曾廣豐等［13］運(yùn)用高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜（HPLC-Q-TOF MS）非靶向快速篩查涼茶中的非法添加物；章璐幸等［14］建立了谷物中18 種真菌毒素的HPLC-Q-TOF MS 非靶向篩查方法；黎梓城等［15］利用超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF MS）建立了同時(shí)檢測(cè)食品接觸用塑料中50種添加劑遷移量的方法。

本研究選擇45 種化合物作為質(zhì)控化合物，基于超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）技術(shù)，建立了霜膏類化妝品的QuEChERS 前處理方法，并擴(kuò)展運(yùn)用于297 種風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)的HPLC-QTOF MS 靶向篩查，構(gòu)建了化妝品風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)的高分辨質(zhì)譜篩查列表。風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)的種類覆蓋β-受體激動(dòng)劑、阻斷劑類、大環(huán)內(nèi)酯類、磺胺類、喹諾酮類、硝基咪唑類、非甾醇消炎藥類、苯并咪唑類、激素類、β-內(nèi)酰胺類、酰胺醇類、農(nóng)藥等。該方法可用于化妝品中風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)的識(shí)別和發(fā)現(xiàn)，能有效解決化妝品風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)“檢不全，檢不快”的問(wèn)題，為化妝品質(zhì)量安全監(jiān)管提供了重要的技術(shù)手段。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 標(biāo)準(zhǔn)品、試劑及樣品

297種標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自天津阿爾塔科技有限公司，純度為89．3%～99．9%，質(zhì)量濃度均為100 mg/L。其中45 種質(zhì)控化合物分為2 組，組1：鹽酸克倫特羅、鹽酸妥布特羅、林可霉素鹽酸鹽、甲苯噻嗪、甲氧芐氨嘧啶、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氟羅沙星、氧氟沙星、奧比沙星、甲磺酸培氟沙星、2-氨基氟苯達(dá)唑、5-羥基甲苯咪唑、坎苯達(dá)唑、氟苯達(dá)唑、氨基甲苯咪唑、丙氧苯咪唑、噻苯噠唑、乙氧酰胺苯甲酯、氮哌酮、殺蟲脒、金剛烷胺、頭孢匹啉、頭孢拉定、阿莫西林三水合物、替諾昔康；組2：苯甲酰磺胺、磺胺甲基異唑、磺胺苯吡唑、磺胺喹啉、氟尼辛葡甲胺、苯硫胍、甲芬那酸、胺丙畏、潑尼松、曲安西龍、丙磺舒、二甲雙胍、鹽酸萘甲唑啉、胍乙啶、鹽酸苯乃嗪、布坦卡因鹽酸鹽、非諾唑酮、異唑肼、帕拉米松。

甲醇、乙腈、無(wú)水乙醇、甲酸均為HPLC 級(jí)，購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher 公司。氯化鈉、中性氧化鋁（Al-N）、氨丙基粉（NH2）、石墨化炭黑（GCB）、N-丙基乙二胺（PSA）、硅膠粉、十八烷基鍵合硅膠（C18）均購(gòu)自上海安譜公司。實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水。

霜膏類化妝品樣品主要為實(shí)驗(yàn)室送檢樣品，包括面霜、護(hù)手霜、粉底霜等。

1.2 儀器條件

1.2.1 UPLC-MS/MS條件色譜條件見(jiàn)表1。質(zhì)譜條件：API 4000Q Trap UPLC-MS/MS（美國(guó)AB公司），配備ESI離子源；正離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式；氣簾氣壓力：1．03×105Pa；霧化氣壓力：3．45×105Pa；加熱輔助氣壓力：3．45×105Pa；碰撞氣壓力：Medium；電離壓力：5 500 V；離子源溫度：550 ℃。

表1 儀器色譜條件Table 1 Instrument chromatographic conditions

1.2.2 HPLC-Q-TOF MS 條件色譜條件見(jiàn)表1。質(zhì)譜條件：LC-20AD 液相色譜系統(tǒng)（日本島津公司），TripleTOFTM5600高分辨質(zhì)譜儀（美國(guó)AB公司），配備ESI和APCI離子源，樣液為ESI離子化方式，APCI 源連接自動(dòng)校正系統(tǒng)，每10個(gè)樣品自動(dòng)校正1次；正負(fù)離子分別掃描；一級(jí)TOF MS掃描范圍m/z：100 ～1 000 Da，采集時(shí)間100 ms；二級(jí)IDA-MS掃描范圍m/z：50～1 000 Da，采集時(shí)間50 ms；氣簾氣壓力：2．76×105Pa；錐孔電壓：5 500 V；離子源溫度：650 ℃；去簇電壓：100 V；碰撞能量：40、55 eV。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理準(zhǔn)確稱取0．5 g（精確至0．001 g）樣品于10 mL具塞比色管中，加入1．0 mL飽和氯化鈉溶液使樣品均勻分散，加入8 mL 無(wú)水乙醇，渦旋振蕩1 min，使試樣與提取溶劑充分混勻，超聲提取15 min，用無(wú)水乙醇定容至10 mL，搖勻，以10 000 r/min 離心5 min。吸取1．00 mL 上清液于裝有50 mg C18粉的1．5 mL 離心管中，渦旋振蕩2 min，以12 000 r/min 離心5 min，取上清液過(guò)0．22 μm 有機(jī)濾膜，待HPLC-Q-TOF MS測(cè)定，并采用空白樣品提取液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 建立篩查列表將1 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液按照“1．2．2”方法上機(jī)測(cè)定，得到所有化合物的一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜圖，并與文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行比較，建立297 種化合物的高分辨質(zhì)譜篩查表，包括化合物的名稱、分子式、離子化模式、保留時(shí)間、母離子及子離子等信息。

1.3.3 篩查方法利用PeakView 2．0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，將篩查表中化合物的英文名稱、分子式、離子化模式導(dǎo)入軟件，設(shè)置精確質(zhì)量數(shù)偏差范圍為± 1×10-5，保留時(shí)間偏差范圍為±0．2 min，比較化合物的一級(jí)、二級(jí)精確質(zhì)量數(shù)、保留時(shí)間、碎片離子豐度比的實(shí)測(cè)值和篩查列表理論值，匹配則鎖定為“可疑目標(biāo)物”，并采用UPLC-MS/MS進(jìn)行定量確證。

2 結(jié)果與討論

2.1 QuEChERS前處理質(zhì)控研究

選擇不同類別、不同結(jié)構(gòu)、不同極性的45 種代表性化合物作為質(zhì)控化合物，包括β-受體激動(dòng)劑、阻斷劑類、大環(huán)內(nèi)酯類、磺胺類、喹諾酮類、硝基咪唑類、非甾醇消炎藥類、苯并咪唑類、激素類、β-內(nèi)酰胺類、酰胺醇類、農(nóng)藥等，以保證各類化合物的提取、凈化效果。質(zhì)控研究通過(guò)UPLC-MS/MS進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，并進(jìn)行方法驗(yàn)證，以確保方法穩(wěn)定可靠。

2.1.1 凈化劑種類及用量的優(yōu)化考察了C18、PSA、NH2、Al-N、GCB、硅膠粉6 種吸附劑在相同用量下的凈化效果及最佳用量，結(jié)果顯示，C18對(duì)45 種質(zhì)控化合物的吸附最小，回收率為56．0%～103%，其他5種吸附劑均影響較大，其中頭孢匹啉、頭孢拉定和替諾西康等的回收率不足40%，部分化合物的回收率偏高。同時(shí)考察了C18用量（30、50、70、90、110 mg）對(duì)凈化效果的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)C18用量為50 mg時(shí)，45種質(zhì)控化合物的回收率在99．5%～121%之間，吸附影響最??；當(dāng)用量≥70 mg時(shí)，隨著用量的增大，吸附影響越來(lái)越大。因此，選擇50 mg C18作為最佳凈化劑。

2.1.2 提取溶劑的選擇考察了甲醇、無(wú)水乙醇、乙腈對(duì)霜膏類化妝品的提取效果，發(fā)現(xiàn)使用甲醇作為提取溶劑時(shí)，大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類、β-內(nèi)酰胺類等的回收率偏低；使用乙腈和無(wú)水乙醇作為提取溶劑時(shí)，質(zhì)控化合物的回收率總體較好，而無(wú)水乙醇提取的響應(yīng)和峰形優(yōu)于乙腈提取，因此，優(yōu)先考慮使用無(wú)水乙醇進(jìn)行提取?？紤]到霜膏類化妝品較為粘稠，分散溶劑穿透能力強(qiáng)，可使樣品更均勻，因此使用常見(jiàn)的飽和氯化鈉溶液作為分散溶劑，再使用無(wú)水乙醇提取的方法進(jìn)一步優(yōu)化環(huán)丙沙星、噻苯噠唑等的回收率。結(jié)果顯示，45種質(zhì)控化合物的回收率為87．0%～119%，效果較好。

2.1.3 基質(zhì)效應(yīng)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線法考察基質(zhì)效應(yīng)，采用無(wú)水乙醇和空白基質(zhì)溶液分別配制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用無(wú)水乙醇配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析時(shí)，林可霉素鹽酸鹽、甲氧芐氨嘧啶、恩諾沙星等化合物的回收率偏低，最低僅為19．4%；5-羥基甲苯咪唑、頭孢匹啉等的回收率偏高，最高達(dá)316%。而用基質(zhì)配制的曲線定量時(shí)，回收率為83．8%～119%。因此，本研究采用空白樣品提取液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線以消除基質(zhì)效應(yīng)。

2.1.4 方法驗(yàn)證在空白霜膏類化妝品中添加不同低濃度水平的質(zhì)控化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液，處理后按“1．2．1”條件進(jìn)行分析，部分質(zhì)控化合物的MRM 離子流色譜圖如圖1所示。結(jié)果顯示，45種質(zhì)控化合物在對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r2）＞0．99。檢出限（LOD）為0．01～0．20 mg/kg，定量下限（LOQ）為0．04～0．40 mg/kg（見(jiàn)表2）。采用空白基質(zhì)進(jìn)行低、中、高3個(gè)濃度水平的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，同時(shí)進(jìn)行6 組平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，45 種質(zhì)控化合物的回收率為81．5%～117%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2．0%～14%，回收率和RSD均滿足要求。

圖1 部分質(zhì)控化合物的MRM離子流色譜圖Fig． 1 MRM ion flow chromatograms of partial quality control compounds A：clenbuterol hydrochloride；B：tulobuterol hydrochloride；C：lincomycin hydrochloride

表2 45種化合物的保留時(shí)間、質(zhì)譜參數(shù)、檢出限與定量下限Table 2 Retention times，MS parameters，limits of detection and limits of quantitation of 45 compounds

2.2 HPLC-Q-TOF MS 快速篩查

基于“2．1”所建立的QuEChERS前處理方法可知，其穩(wěn)定性好、靈敏度高，將其進(jìn)一步擴(kuò)展應(yīng)用于霜膏類化妝品中297種風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)的靶向篩查。樣品經(jīng)提取、凈化，HPLC-Q-TOF MS 上機(jī)測(cè)定，采集一級(jí)質(zhì)譜信息（如保留時(shí)間、精確質(zhì)量數(shù)等）并與所建立的篩查列表（見(jiàn)表3）進(jìn)行比對(duì)分析，對(duì)精確質(zhì)量數(shù)偏差在± 1×10-5內(nèi)，保留時(shí)間偏差在± 0．2 min 內(nèi)的化合物，繼續(xù)進(jìn)行二級(jí)碎片離子信息的比對(duì)，若二級(jí)碎片離子及豐度比匹配，則鎖定“可疑目標(biāo)物”，再采用UPLC-MS/MS 進(jìn)行確證分析。UPLCMS/MS確證后則判定為檢出。本方法完全滿足霜膏類化妝品中297種風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)快速篩查的方法學(xué)要求。

表3 297種風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)的名稱、分子式、離子化模式、保留時(shí)間、母離子與子離子Table 3 Names，formula，ion modes，retention times，precursor ions and product ions of 297 risk substances

2.3 實(shí)際樣品檢測(cè)

隨機(jī)抽取29份霜膏類化妝品樣品，采用“1．2．2”方法快速定性篩查297種風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)，檢出的風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)再進(jìn)行定量分析。結(jié)果表明，兩款面霜篩查出風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)，其中一款面霜檢出甲芬那酸、鹽酸賽庚啶、克林霉素，檢出量分別為0．099 4、318 0、0．042 mg/kg，另一款面霜檢出甲芬那酸、鹽酸賽庚啶和林可霉素，檢出量分別為0．102 2、0．157 4、412 mg/kg。

3 結(jié) 論

本研究基于 QuEChERS 結(jié)合HPLC-Q-TOF MS 建立了霜膏類化妝品中297 種風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)的篩查方法。選擇45 種化合物作為質(zhì)控化合物，優(yōu)化了QuEChERS 前處理?xiàng)l件，建立了297 種風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)的高分辨質(zhì)譜篩查列表。該方法操作簡(jiǎn)單，具有較好的靈敏度和準(zhǔn)確度，實(shí)現(xiàn)了對(duì)多種風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)殘留的快速篩查，解決了化妝品風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)殘留“檢不全，檢不快”的問(wèn)題，可助力我國(guó)化妝品行業(yè)健康發(fā)展。