季濤云

北京大學第一醫(yī)院兒科（北京 100034）

發(fā)育性癲癇性腦病（developmental and epileptic encephalopathy，DEE）是癲癇中最為嚴重的一類疾病，致殘率、致死率高，嚴重影響患兒的生活質量，給家庭和社會帶來沉重負擔[1]。雖然DEE中許多疾病均為罕見病，但作為一組疾病，其總體發(fā)病率為（0.27～0.54）/1000例新生兒[1-2]。DEE病因包括遺傳性和非遺傳性，隨著技術的發(fā)展，尤其是二代測序（next-generation sequencing，NGS）技術的進步，越來越多DEE的遺傳性病因被識別。本文主要闡述遺傳性病因相關DEE的特點、發(fā)病機制及治療。

1 發(fā)育性癲癇性腦病的概念

DEE 是一組神經發(fā)育性疾病，以早發(fā)癲癇、腦電圖異常及發(fā)育落后或倒退為主要特征，包括早發(fā)性嬰兒DEE、嬰兒癲癇伴游走性局灶性發(fā)作、嬰兒癲癇性痙攣綜合征、Dravet綜合征、Lennox-Gastaut綜合征、癲癇性腦病伴睡眠中棘慢波激活、病因特異性癲癇性腦病[鉀電壓門控通道亞家族Q 成員2（KCNQ2）-發(fā)育性癲癇性腦病、細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶5（CDKL5）-發(fā)育性癲癇性腦病、吡哆醇依賴性發(fā)育性癲癇性腦病]等[3-4]。DEE存在顯著遺傳異質性和表型異質性。遺傳異質性是指不同遺傳因素可導致相同的臨床表型，例如影響不同分子或信號通路的基因變異可導致相似的電-臨床綜合征如嬰兒癲癇性痙攣綜合征。同一個基因變異也可以導致多種不同的臨床表型即所謂的表型異質性，如鈉電壓門控通道α 亞基1（SCN1A）基因變異可導致遺傳性癲癇伴熱性驚厥附加癥、Dravet綜合征、早發(fā)性嬰兒發(fā)育性癲癇性腦病等，其基因型-表型的關聯與SCN1A變異是功能獲得性（gain of function，GoF）還是功能缺失性（loss of function，LoF）有一定關系。除此之外，遺傳背景也會改變基因型與表型的關系。相關研究發(fā)現在鉀電壓門控通道亞家族A 成員1（Kcna1）基因敲除和鈣電壓門控通道亞基α1A（Cacna1a）錯義變異相結合的動物模型中，與Cacna 1 a相關的癲癇表型被掩蓋，同時Kcna 1缺失變異導致的致死性表型被減輕[5]。因此，基因型-表型關聯的機制復雜，尚需要大量研究以進一步明確。

2 發(fā)育性癲癇性腦病的遺傳性病因

DEE的遺傳性病因涉及不同功能的基因變異如細胞遷移、增殖和分化、神經元興奮性、突觸傳遞及神經可塑性等。隨著檢測技術的進步，尤其是NGS技術的普及，越來越多的DEE 致病基因得到確認，目前已有上百個基因被確認與DEE相關。除了基因變異導致的DEE 外，約8%的DEE 與新發(fā)的拷貝數變異有關[6-7]。在約10%DEE 患者的父母中檢測出低比例的變異嵌合體[8-9]，上述發(fā)現對遺傳咨詢評估具有重要意義。非編碼區(qū)變異、腦組織中存在變異嵌合體、寡基因遺傳（oligogenic inheritance）和表觀遺傳等均可導致DEE，但是目前常用的NGS方法無法檢測到上述異常。

非編碼區(qū)變異主要與基因表達和調控有關，可能是由于非編碼區(qū)變異導致毒性外顯子產生，進而影響RNA轉錄本的正常剪接。有研究對640例不明原因DEE患者SCN1A基因的11個非編碼候選區(qū)域進行測序，根據其進化保守性和功能特征分析，在內含子20中發(fā)現了5個變異，這些變異導致毒性外顯子產生，影響全長SCN1A蛋白的正常表達[10]。有研究針對皮質發(fā)育畸形所致DEE患者的腦組織和血液配對樣本進行深度測序，發(fā)現在腦組織中存在變異嵌合體[11-13]。對于大多數DEE患者來說，獲取腦組織極其困難，臨床實踐中可能低估了變異嵌合體在DEE 中的影響?；谏鲜鲈?，已有研究試圖從腦脊液中提取DNA以進行相關病因的探索[14-15]，其對于DEE的病因明確具有重要意義。寡基因遺傳不符合單基因遺傳的特點，而是由多個（≥2 個）基因變異相互作用導致的復雜臨床表型。1個基因是主要致病基因（主效基因），而其他基因則起修飾作用。離子通道基因變異所致癲癇患者和動物模型均證實了寡基因遺傳的存在[5,16-17]。有研究在1例生后3個月出現頻繁癲癇發(fā)作、喂養(yǎng)困難、嚴重發(fā)育遲緩（21個月體重5.6 kg、身長69 cm、頭圍39.5 cm，尚不能豎頭、不能發(fā)出“啊啊”聲音）、最終因為強直-陣攣發(fā)作導致死亡的男性患兒中發(fā)現，同時存在KCNJ10基因及KCNT1基因的致病變異，在非洲爪蟾卵母細胞中進行功能研究時發(fā)現兩種變異同時存在時會導致致死的表型[17]。

3 發(fā)育性癲癇性腦病發(fā)病機制

DEE 的發(fā)病機制復雜多樣，且多重機制交織在一起可共同影響大腦發(fā)育和神經元的興奮性。皮質和皮質下神經元相互作用，可引起正常皮質的功能改變[18]。神經元的電活動受Na+、K+離子通道相互作用的精細調節(jié)，如果平衡被打破可能會出現異常的去極化，導致異常的神經元活動和皮質興奮性改變[19]。DEE的發(fā)生與大腦處于動態(tài)的發(fā)育過程也息息相關，在大腦的發(fā)育過程中存在分子、形態(tài)及功能的變化，發(fā)育中的大腦更容易受到多種因素的影響，更容易發(fā)生頻繁、多灶的癲癇樣放電及癲癇發(fā)作[20]。同時研究也發(fā)現，發(fā)育中的大腦具有更強的可塑性，與發(fā)育成熟的大腦相比，長時間癲癇發(fā)作產生嚴重損傷的可能性較小[21]。DEE致病基因編碼的蛋白涉及多種生物學功能，如離子通道、膜運輸調節(jié)、轉運蛋白、細胞骨架蛋白、細胞黏附分子、細胞代謝及信號轉導等（表1），其中約25%的基因參與編碼離子通道，包括電壓門控離子通道和配體門控離子通道。下面以編碼電壓門控鈉離子通道相關的基因變異為例闡述DEE的發(fā)病機制。變異的功能研究對揭示病理生理機制、闡明基因型-表型關系、遺傳咨詢、精準治療及長期管理具有重要意義。

表1 DEE致病基因分類

編碼Ⅰ型鈉通道（Nav1.1）α亞基的SCN1A是臨床上最常見的癲癇致病基因之一，迄今已報道了數百種變異，其相關表型范圍從表型嚴重的DEE（早發(fā)性嬰兒DEE、Dravet綜合征）到相對較輕的遺傳性癲癇伴熱性驚厥附加癥，部分攜帶此基因變異的患者可表現為非癲癇表型如偏癱性偏頭痛。NaV1.1是γ-氨基丁酸（GABA）能中間神經元的主要Na+通道，位于GABA 能中間神經元的軸突初始段，SCN1A基因變異導致其興奮性降低，降低了GABA 能神經元的抑制作用[22-23]。GABA能神經元功能的抑制與Dravet綜合征相關，并且發(fā)現LoF的嚴重程度可以決定表型的嚴重程度[24-25]。研究發(fā)現，SCN1A基因變異引發(fā)的散發(fā)性或家族性偏癱性偏頭痛可能與NaV1.1功能增強有關[26-27]?；蛐?表型相關性可能主要取決于SCN1A基因變異后對功能的影響，但上述關聯亦受到遺傳背景以及SCN1A基因變異與癲癇發(fā)作之間的相互作用等的影響，這可能是基因型-表型關聯復雜的原因之一[28]。

SCN8A基因編碼電壓門控鈉離子通道亞基Nav1.6，該通道是位于成熟興奮性神經元軸突的主要Na+通道，是動作電位產生及傳導的重要分子基礎。新發(fā)的SCN8A基因雜合變異引發(fā)的臨床表現復雜多樣，大多數患者表現為DEE 且有癲癇猝死發(fā)生的風險[29]，部分患者表型相對較輕如表現為自限性家族性嬰兒癲癇[30]，還有一些患者表現為智力障礙、孤獨癥譜系障礙等，而無癲癇發(fā)作。研究發(fā)現與癲癇相關的表型多與GoF 變異相關，此種變異導致神經元興奮性增強；而無癲癇發(fā)作的智力障礙、孤獨癥譜系障礙多與LoF變異相關[31-32]。上述研究對治療有一定的指導作用，如部分SCN8A基因GoF變異的患者對高劑量的鈉通道阻滯劑有一定反應[30,33]。

編碼鈉離子通道基因SCN1A、SCN2A、SCN3A、SCN8A均可導致DEE，但是SCN1A基因主要在抑制性神經元中表達，而同樣編碼電壓門控鈉離子通道的SCN2A、SCN3A、SCN8A在大腦多個區(qū)域的興奮性神經元中優(yōu)先表達[34]。體外和體內電生理研究對于確定通道相關基因變異的功能影響至關重要，變異后功能的改變在相同基因家族中可能不同，甚至在相同基因中也可能不同。功能研究為藥物選擇和研發(fā)提供了重要的基礎。

4 發(fā)育性癲癇性腦病治療

目前DEE 治療主要是對癥治療，包括針對癲癇發(fā)作的抗癲癇發(fā)作藥物的應用，以及針對發(fā)育落后的康復治療。在部分DEE 患者中，即使癲癇發(fā)作得到較好的控制，但發(fā)育障礙和其他合并癥仍然較為嚴重[35]。隨著人們對疾病發(fā)病機制研究的逐漸深入，發(fā)現許多疾病是由于遺傳物質改變所致，例如某一基因的變異導致蛋白表達異常，從而引起病變。基因治療可通過修復致病基因達到緩解和治愈疾病的目的，為DEE 患者帶來了新的希望。目前常用的基因治療方法包括：①使用病毒載體的基因替代治療；②調節(jié)基因表達，如反義寡核苷酸（antisense oligonucleotides，ASOs）治療脊髓性肌萎縮癥；③基于成簇的規(guī)律間隔的短回文重復序列（CRISPR）的基因編輯療法。

腺相關病毒（adeno-associated virus，AAV）是目前基因治療的主流病毒載體。在SCN1A變異所致Dravet 綜合征的小鼠中注射AAV9-REGABAeTFSCN1A(ETX101)可顯著降低無誘因和發(fā)熱誘發(fā)的癲癇發(fā)作的發(fā)生率，并延長其生存期[36]。在結節(jié)性硬化癥的小鼠模型中應用AAV1-環(huán)化重組酶以及AAV9-錯構瘤蛋白，小鼠生存期延長，腦病理異常亦顯著減少[37]。也有研究在Cdkl5變異導致的小鼠模型中注射AAV-PHP.B-hCDKL5_1，注射后小鼠腦中CDKL5 表達有所恢復且運動功能有改善[38]。ASOs是一種與特定靶mRNA互補的單鏈脫氧核酸，包含12～28個堿基，通過與mRNA或前mRNA序列互補，ASOs 可被合成為DNA/RNA 異源雙鏈體，成為影響蛋白質編碼和非編碼核糖核酸的疾病修飾劑，降低毒性蛋白質水平，增加功能蛋白質的水平或修飾受損蛋白質的結構以改善功能[39]。2020年相關研究發(fā)現用ASOs治療Scn8a基因變異的R1872W小鼠，延遲了其癲癇發(fā)作起病時間，并延長了其存活時間[40]。在Dravet綜合征動物模型中，通過反義寡核苷酸靶向增強核基因輸出（targeted augmentation of nuclear gene output，TANGO）可增加Scn1a轉錄物和Nav1.1蛋白的表達，從而降低癲癇發(fā)作的頻率、延長壽命且能將中間抑制性神經元的興奮性恢復至野生型的水平[41-42]。STK-001是用于治療Dravet綜合征的ASOs藥物，可選擇性上調SCN1A基因的一個等位基因，從而增加NaV1.1 蛋白質的產生，STK-001應用于Dravet綜合征患者的臨床研究正在進行中[43]，期待能為Dravet綜合征提供新的有效治療藥物。CRISPR 是一種基因編輯技術，該技術通過修復或敲除變異基因和編輯其他相關基因來治療疾病。它使得在細胞和組織中快速、廉價和相對容易糾正基因組中的錯誤成為可能。CRISPR突出的優(yōu)勢是具有治療由單基因變異引起的遺傳疾病方面的潛在用途。目前CRISPR已應用于阿爾茲海默癥、杜氏肌營養(yǎng)不良、Dravet綜合征等疾病的動物和細胞實驗。在CRISPR的潛力轉化為臨床有效治療之前，仍然存在許多挑戰(zhàn)，如該技術的遞送效率、脫靶效應、安全性等[44]。

DEE 表型復雜，致病基因種類繁多，以上特點導致其基因治療的研究和臨床應用面臨更大挑戰(zhàn)和困難。隨著相關技術的進步，應加強對該疾病的基礎性研究，通過對變異的功能研究揭示其病理機制和闡明基因型-表型相關性至關重要，有助于開展進一步的基因治療研究。遞送技術是基因治療過程中的關鍵技術，現已開發(fā)更多有效的非病毒載體，如細胞外囊泡、脂質納米顆粒及類病毒體等，其技術進步將極大推動基因治療的應用范圍，還將有助于進一步降低生產成本?；蛑委熢贒EE中的應用目前仍存在以下問題[45]：①由于大多數DEE與廣泛的大腦功能障礙有關，因此需要針對整個大腦進行遞送；②DEE 發(fā)病機制復雜，與LoF 或GoF 有關，過量表達可能導致不良影響；③DEE發(fā)病部分與體細胞嵌合有關，導致替代治療的量和分布更加復雜；④治療窗口期非常重要，基因的替代治療應該在腦神經網絡發(fā)育成熟之前進行。雖然目前基因治療還存在諸多問題，但相信隨著科學技術的進步，上述問題將會迎刃而解。

5 結語

癲癇是最常見兒童神經系統疾病之一，根據起病年齡、癲癇發(fā)作類型、腦電圖特征、病因、合并癥及預后，可以分為不同的癲癇類型和癲癇綜合征。DEE 是其中最為嚴重的類型之一，嚴重影響患者及其家庭的生活質量。DEE表型多樣，病因復雜，針對致病機制的研究結果為我們提供了更清晰的靶向目標，為研究安全有效的治療方法提供了基礎，針對病因的個體化基因治療未來可期。