陳 成，付 越，李 亮，李 豐

湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208

胃癌是世界上發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤之一，對人類健康和安全構成嚴重威脅。根據國際癌癥研究機構（IARC）最新統(tǒng)計，2020 年全球大約76.3 萬人死于胃癌，在惡性腫瘤發(fā)病率排名第五，死亡率排名第四［1］。東亞、東歐和南美是胃癌高發(fā)的重點地區(qū)［2］。其發(fā)生發(fā)展是一個多因素摻雜、存在多個階段的復雜病理過程。臨床實踐和科學研究發(fā)現中醫(yī)藥在治療癌癥方面具有確切療效［3］。四君子湯源自《太平惠民和劑局方》。LI等［4］研究發(fā)現四君子湯可整合增強非替尼抗癌的調節(jié)特性，提示四君子湯可能在癌癥治療中發(fā)揮作用。LUO 等［5］通過高通量組學研究發(fā)現四君子湯可通過上調MicroRNA 表達改善胃癌癥狀，其靶基因中關系最為密切的通路是Wnt/β-catenin。Wnt/β-catenin 是一個高保守的信號通路，大量證據證明其參與了腫瘤的增殖、分化、遷移和侵襲過程［6］。因此，這一分子途徑在癌癥靶向治療中具有重要意義。有研究揭示脾氣虛證在胃癌的整個病程中具有重要作用［7］。四君子湯為治療脾氣虛證的代表方，但四君子湯能否通過調節(jié)Wnt/β-catenin發(fā)揮作用的機制仍不明確。

前期研究發(fā)現四君子湯對胃癌脾氣虛證具有改善作用［8］，四君子湯通過作用于血漿和唾液的共同靶基因miR-151a-3 調控胃癌脾氣虛證的發(fā)生、發(fā)展。因此，基于前期研究基礎，本研究以Wnt/β-catenin 信號通路為切入點進一步探討四君子湯對胃癌脾氣虛證的治療作用。

1 材料與方法

1.1 細胞人胃癌NCI-N87 細胞購自北納生物制品公司（質檢編號：338548）。

1.2 實驗動物BALB/c 雄性裸鼠25 只，4～6 周齡，體質量（16±4）g，湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，實驗動物許可證號：SYXK（湘）2019-0009，飼養(yǎng)在濕度（50±10）%和溫度（22±2）℃的環(huán)境下，實驗方案已通過動物倫理委員會批準，倫理編號：LL2020061501）。

1.3 藥品、試劑與儀器

1.3.1 四君子湯 由人參12 g、白術12 g、茯苓12 g 和甘草6 g 組成，購于遼寧龍參健康藥業(yè)有限公司（批號：200905），經湖南中醫(yī)藥大學藥學院袁林祥教授鑒定合格。四君子湯藥液制備：以10倍水充分浸泡中藥2 h，回流提取2 次，轉移至旋轉蒸發(fā)儀，75 ℃蒸發(fā)濃縮成2 g/mL 的藥液于-20 ℃冰箱保存。灌胃時水浴加熱至37 ℃。

1.3.2 番瀉葉 購于湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院（批號：201019），以10倍水充分浸泡30 min，回流提取2 次，轉移至旋轉蒸發(fā)儀，75 ℃蒸發(fā)濃縮成1 g/mL的藥液于-20 ℃冰箱保存。

1.3.3 主要試劑 RPMI-1640 培養(yǎng)基（大連美侖生物技術有限公司，批號：MA0215-Feb-16G2）；BI特級胎牛血清（Biological Industries 公司，批號：04-001-1ACS）；超純總RNA 提取試劑盒（新景生物試劑開發(fā)有限公司，批號：5003050）；BCA 蛋白定量試劑盒（伊萊瑞特生物科技有限公司，批號：E-BC-K318-M）；ECL 發(fā)光液（Biosharp 公司，批號：BL520B）；RIPA 蛋白裂解液（批號：CW2333s）、蛋白磷酸酶抑制劑混合物（批號：CW2383S）；SDSPAGE上樣緩沖液（批號：CW0027S）均購自康為世紀科技有限公司；Wnt1、β-catenin、C-myc、Mmp-7、Gsk-3β、GAPDH 抗體（武漢三鷹生物技術科技有限公司，批號分別為：27935-1-AP、66379-1-Ig、67447-1-Ig、10374-2-AP、22104-1-AP、10494-1-AP）；山羊抗兔免疫球蛋白、山羊抗鼠免疫球蛋白（伊萊瑞特生物科技有限公司，批號分別為E-AB-1003、E-AB-1001）。

1.3.4 主要儀器 細胞培養(yǎng)箱（Thermo 公司）；低溫高速離心機（長沙維爾康）；varioskan LUX酶標儀（Thermo 公司）；蛋白電泳儀、蛋白表達成像系統(tǒng)、580BRMy-CyclerPCR 儀、ChemiDocXRS+凝膠成像分析系統(tǒng)均美國Biorad公司。

1.4 方法

1.4.1 模型制備

1.4.1.1 脾氣虛證制備 將20 只裸鼠分為正常組6 只、模型組14 只，正常組常規(guī)喂養(yǎng)，灌胃蒸餾水；模型組灌胃番瀉葉結合饑飽失常法制備脾氣虛證模型，番瀉葉藥液（1 g/mL）按每日10 mL/kg劑量灌胃，灌胃后禁食12 h，再恢復足量喂食，共15天。

1.4.1.2 人胃癌裸鼠原位移植瘤模型制備［9］另取5 只4～6 周齡BALB/c 雄性裸鼠，將NCI-N87 人源胃癌細胞懸液（2×106/mL）接種于裸鼠腋下，培育胃癌組織塊。觀察裸鼠腋下種植瘤生長情況，長到直徑10 mm 左右剝取出來，作為原位移植瘤的癌源。脫頸處死癌源裸鼠，剝取腋下腫瘤，清理瘤體上的包膜纖維和殘留血管等，PBS 溶液沖洗呈魚肉狀，剪成1 mm 大小瘤體，將瘤體種植于脾氣虛證裸鼠胃體上，用無菌針頭輕微挑破胃大彎中部皮下筋膜，微微滲血即可，將制備好的瘤體用OB 膠粘貼于筋膜劃破處，醫(yī)用膠凝固定，粘牢瘤體，分層關閉腹腔，整個操作過程要迅速、保溫，嚴格遵守無菌原則。

1.4.2 動物分組、干預及樣本采集 將造模成功的模型組（14 只）中裸鼠隨機挑選7 只（四君子湯組）灌胃四君子湯（10.92 g/kg），每日1 次，剩余裸鼠仍記為模型組。模型組、正常組灌胃蒸餾水。于造模后14天末，禁食禁水12 h，處死裸鼠，打開腹腔，分離剝取模型組和四君子湯組裸鼠胃癌組織。測量腫瘤質量，置于無菌凍存管-80 ℃冰箱保存。

1.5 觀察指標及測定方法

1.5.1 中醫(yī)行為學表征及體質量 造模后，每日清晨8 點密切觀察3 組裸鼠精神狀態(tài)、皮膚色澤、反應力、活動度及肛門、糞便狀態(tài)［10］等行為學表征，每3天測量裸鼠體質量。

1.5.2 瘤體體積及抑瘤率 末次給藥后處死裸鼠，稱重腫瘤組織，計算腫瘤生長抑制率（抑瘤率）。

抑瘤率（%）=（模型組平均瘤重-給藥組平均瘤重）/模型組平均瘤重×100%

1.5.3 腫瘤組織Wnt/β-catenin 相關蛋白表達檢測（Western blot法） 將-80 ℃冰箱中的腫瘤組織取出，稱重，在研磨器中加入含蛋白酶抑制劑的裂解液，冰上低溫研磨，離心取上清，用BCA試劑盒測定胃癌組織蛋白濃度，配上樣緩沖液，于-20 ℃保存。剩余原液置-80 ℃保存。電泳條件：160 V，30 min，400 V，90 min。PVDF膜濕轉400 mA，1 h。5%脫脂奶粉搖床封閉90 min，TBST沖洗干凈牛奶后孵育一抗Wnt1 抗體（1∶1000）、β-catenin 抗體（1∶30000）、C-myc 抗體（1∶30000）、Mmp-7 抗體（1∶5000）、Gsk-3β 抗體（1∶4000）4 ℃過夜，TBST 清洗4 次，每次8 min，37 ℃孵育二抗（兔抗1∶10000，鼠抗1∶10000）1 h，TBST 清洗4 次，8 min，ECL 顯影液于凝膠成像系統(tǒng)中顯影成像，Image J 軟件分析圖像。

1.5.4 Wnt1、β-catenin、C-myc、Mmp-7 和Gsk-3β的mRNA表達檢測（qPCR法） -80 ℃冰箱取出腫瘤組織稱重，TRIzol法提取胃癌組織RNA，測其濃度，按照1000 ng每20 μL逆轉錄成cDNA，使用SYBR染料，檢測Wnt-1、β-catenin、C-myc、Mmp-7和Gsk-3β的mRNA 表達（qPCR），以GAPDH 為內參，用2-ΔΔCt法計算各mRNA相對表達量。各引物序列見表1。

表1 Wnt-1、β-catenin、C-myc、Mmp-7和Gsk-3β引物序列

1.6 統(tǒng)計學方法采用SPSS 26.0 軟件分析數據，計量資料以±s表示，采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 裸鼠脫落情況手術種瘤后，模型組死亡1只，四君子湯組死亡1只。

2.2 裸鼠中醫(yī)行為學表征正常組裸鼠活動度正常，皮毛柔順有光澤，反應靈敏、大小便正常；模型組裸鼠精神萎靡不振，反應遲鈍，弓背懶動，皮毛雜亂，肛門紅腫且濕潤，大便呈溏狀；四君子湯組裸鼠精神狀態(tài)改善，活動度提高，反應尚佳，無明顯弓背懶動現象，皮膚光澤度尚可，泄瀉情況改善，糞便數量減少并趨于正常，肛周未見紅腫，便質變硬，呈黑褐色。

2.3 裸鼠體質量正常組裸鼠體質量呈平穩(wěn)上升趨勢；與正常組相比，不同時間段模型組、四君子湯組體質量降低（P＜0.05）。與模型組相比，第19 天開始，四君子湯組體質量增加（P＜0.05）。見表2。

表2 不同時間段3組裸鼠體質量比較（±s）g

表2 不同時間段3組裸鼠體質量比較（±s）g

注：*表示與正常組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05

組別正常組模型組四君子湯組第28天25.56±0.62 18.28±0.37*21.63±0.42*#鼠數6 6 6第16天24.17±0.40 20.25±0.54*20.55±0.41*第19天24.43±0.70 19.95±0.47*20.88±0.40*#第22天25.16±0.64 19.48±0.39*21.13±0.34*#第25天25.23±0.74 18.93±0.42*21.33±0.40*#

2.4 裸鼠瘤體質量與模型組相比，四君子湯組瘤體質量減輕（P＜0.05），抑瘤率為47%。見表3。

表3 3組裸鼠瘤體質量比較（±s）g

表3 3組裸鼠瘤體質量比較（±s）g

注：#表示與模型組比較，P＜0.05；-表示無瘤體

組別正常組模型組四君子湯組瘤體質量-0.045±0.0078 0.024±0.0040#鼠數6 6 6

2.5 Wnt-1、β-catenin、C-myc、Mmp-7和Gsk-3β的mRNA 表達與模型組相比，四君子湯組Wnt1、βcatenin、C-myc和Mmp-7的mRNA表達下降（P＜0.05），Gsk-3β的mRNA表達升高（P＜0.05）。見表4。

表4 兩組裸鼠Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白mRNA表達結果（±s）

表4 兩組裸鼠Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白mRNA表達結果（±s）

注：：#表示與模型組比較，P＜0.05

組別模型組四君子湯組Gsk-3β mRNA 1.53±1.25 2.18±1.16#鼠數6 6 Wnt-1 mRNA 0.72±0.35 0.33±0.12#β-catenin mRNA 1.17±0.80 0.51±0.18#C-myc mRNA 1.16±0.55 0.23±0.17#Mmp-7 mRNA 1.04±0.27 0.47±0.13#

2.6 Wnt-1、β-catenin、C-myc、Mmp-7 和Gsk-3β的蛋白表達與模型組相比，四君子湯組Wnt-1、β-catenin、C-myc和Mmp-7蛋白表達降低（P＜0.05），Gsk-3β蛋白表達升高（P＜0.05），見表5和圖1。

圖1 兩組裸鼠胃癌組織蛋白電泳

表5 兩組裸鼠Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白表達（±s）

表5 兩組裸鼠Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白表達（±s）

注：#表示與模型組比較，P＜0.05

組別模型組四君子湯組Gsk-3β 0.65±0.20 1.14±0.28#鼠數6 6 Wnt-1 1.15±0.20 0.56±0.22#β-catenin 1.50±0.77 0.60±0.04#C-myc 1.06±0.19 0.78±0.04#Mmp-7 0.97±0.06 0.75±0.08#

3 討論

胃癌是一種常見的惡性病質，包括上皮內瘤變、黏膜內癌、黏膜下癌及浸潤癌，病因未明，可發(fā)生于胃的任何部位［11］。胃癌屬中醫(yī)“反胃”“胃脘痛”“噎膈”“癥瘕”等范疇［12］。中醫(yī)認為脾胃為后天之本，脾胃受損則元氣不充，諸病由生，致積聚結塊?，F代研究認為胃癌的發(fā)生與“虛”“痰”“瘀毒”等因素密切相關，因脾氣不足，運化水濕失治，聚濕成痰，進一步加重中焦虛弱，氣血化生乏源，血液運行不暢，瘀血由生，痰瘀互結，痰瘀蘊久化毒，最后生成痰瘀毒交結的病理產物［13］。病性是本虛標實，脾胃氣虛是胃癌產生的根本，貫穿胃癌早、中、晚期及術后等，健脾益氣是治病求本，培本固元［14］。現代藥理研究顯示，機體的免疫逃逸也是造成腫瘤細胞持續(xù)增殖的主要原因，健脾益氣法可增強自身免疫［15］。因此可通過培本固元，調節(jié)機體陰陽、臟腑、氣血、經絡平衡，調動人體內的防御機制，抑制腫瘤生長。四君子湯方中人參為君，甘溫益氣，健脾養(yǎng)胃；臣以白術苦溫健脾燥濕，益氣助運；佐以甘淡茯苓，健脾滲濕，苓術相配則健脾祛濕之力顯著；使以甘草益氣和中，調和諸藥［16］。慢性萎縮性胃炎是胃癌進程中的重要過程，現代藥理研究發(fā)現四君子湯可改善胃局部炎癥和外周血白細胞炎癥，降低慢性胃炎患者胃癌的發(fā)生率［17］。四君子湯還可抑制胃癌干細胞GCSCs，通過降低β-catenin 核積累和DNA 結合活性來實現［18］。

Wnt/β-catenin 信號通路也被稱為經典或β-catenin 依賴信號通路，是一個保守的信號軸，參與各種生理過程，如細胞生長、分化、凋亡、遷移、侵襲和組織穩(wěn)態(tài)［19］。研究發(fā)現Wnt/β-catenin 信號通路與胃癌、肝癌和乳腺癌等多種惡性病質密切相關［20］，其通路的激活依賴于β-catenin 的過度積累和表達。但一種被稱為“破壞復合物”的復合物有助于β-catenin 在生理條件下的降解。“破壞復合物”由腺瘤性大腸息肉病、Dishevelled（Dvl）、酪蛋白激酶1 和Axin/Axin2 組成，β-catenin 會導致其被糖原合成酶激酶-3β（Gsk-3β）降解，然而，Dvl 的刺激會“破壞復合體”，從而導致抑癌基因Gsk-3β失活，大量β-catenin在細胞質中積累，并轉運至細胞核，與淋巴增強子結合因子和t 細胞因子相互作用，從而活化轉錄，促進下游靶基因如C-myc 和Mmp-7 等，造成細胞周期調節(jié)失控，細胞周期調節(jié)失控是惡性腫瘤的重要特征之一，這將對細胞產生災難性影響［21］。Wnt1是Wnt家族的第一個成員，其在系統(tǒng)發(fā)育方面保守，對于腫瘤發(fā)生和多種發(fā)育過程至關重要。研究發(fā)現Wnt1 表達與胃癌大小、分化程度、浸潤深度和淋巴結轉移及生存率密切相關。正常成熟的胃組織Wnt1信號表現缺如［22］。說明Wnt1可作為胃癌潛在生物標志物的靶標［23］。β-catenin又名B-連環(huán)蛋白，是Wnt通路的關鍵因子，幽門桿菌可激活β-catenin 以促進胃上皮細胞的腸道轉分化［24］，β-catenin 及胃癌相關E-鈣黏蛋白被證實不僅是黏附連接的靜態(tài)成分，而且是下游Wnt 信號級聯的重要介質，二者可作為胃癌發(fā)生和發(fā)展的獨立危險因素［25］。C-myc基因是MYC基因家族的重要成員之一，C-myc蛋白為細胞程序的主要調節(jié)劑，該基因既是可轉基因，也是受多種因子調控的調控基因。C-myc通過腫瘤細胞內在機制及宿主免疫和TME 依賴機制啟動和維持癌癥［26］。Mmp-7 蛋白（又稱金屬蛋白酶7）屬Mmp 家族，參與基底膜和細胞外基質的破壞，導致腫瘤侵襲和轉移。LONG等［27］發(fā)現Mmp-7與胃癌的分化程度和臨床分期密切相關，并提示Mmp-7參與了胃癌組織的侵襲和轉移，有望作為確定胃癌進展和預后的有用生物標志物。

本研究結果顯示，模型組裸鼠胃癌組織中Wnt1、β-catenin、C-myc 和Mmp-7 蛋白及其mRNA 表達上升，Gsk-3β蛋白及其mRNA 表達下降，四君子湯組Wnt1、β-catenin、C-myc 和Mmp-7 蛋白及其mRNA表達下降，Gsk-3β蛋白及其mRNA表達上升。由此推斷，四君子湯可通過影響Wnt 信號通路相關蛋白來影響胃癌脾氣虛證裸鼠癌瘤體的生長。預測影響途徑可能是上游wnt 配體的調控、關鍵基因β-catenin 核異位下調和基因表達或影響下游靶基因C-myc和Mmp-7表達，細胞周期調節(jié)失控。

綜上所述，四君子湯可下調腫瘤因子表達，在一定程度上抑制Wnt/β-catenin 信號通路的激活，減緩胃癌脾氣虛證病程。