盧夢月，劉 銳，周 瑩，田 智，劉付昌盛

1 廣西中醫(yī)藥大學,廣西 南寧 530200； 2 廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530011

特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是最常見的間質(zhì)性肺疾病，預后差，病死率高。IPF中位生存期為2.5～3.5年，死亡年齡中位數(shù)為65 歲，并且發(fā)病率隨年齡增長而增加?，F(xiàn)有治療方案中，IPF 患者經(jīng)酪氨酸激酶抑制劑尼達尼布和抗纖維化吡啶類藥物吡非尼酮治療雖然能減緩強迫肺活量的降低和疾病進展速度［1-4］，但長期療效尚不確定，且不能完全有效降低死亡率、提高生存率，因此，需要尋找新的靶點和藥物干預措施，以便更有效地治療IPF，降低其死亡率。

麥門冬湯出自《金匱要略》，為肺痿專設湯劑。原方由麥門冬七升、半夏一升、人參三兩、甘草二兩、粳米三合、大棗十二枚組成，有滋養(yǎng)肺胃，降逆和中功效，原治呃逆上氣，咽喉不利證，后世醫(yī)家用于因肺胃陰虛，虛火上炎所致的肺痿胃陰虧虛證［5］。本研究主要通過生物信息學和網(wǎng)絡藥理學方法探討麥門冬湯治療肺纖維化的可能機制。

1 方法

1.1 麥門冬湯藥物活性成分和靶點篩選運用中藥分子機制生物信息學分析工具（A bioinformatics analysis tool for molecular mechanism of traditional Chinese medicine，BATMAN-TCM）以得分≥30與P＜0.05為臨界值［6］，中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）數(shù)據(jù)庫以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、藥物相似性（druglikeness，DL）≥0.18［7］檢索麥門冬湯相關(guān)化合物及其靶點，將收集到的中藥活性成分剔除重復后與相關(guān)文獻結(jié)合分析。

1.2 lPF 相關(guān)疾病靶點檢索以“Idiopathic pulmonary fibrosis”作為關(guān)鍵詞檢索人類基因數(shù)據(jù)庫GeneCards）、比較毒物基因組數(shù)據(jù)庫（CTD）、基因疾病關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)庫（DisGeNET）、藥物靶標數(shù)據(jù)庫（DrugBank）和在線孟德爾人類遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM）中已知的疾病靶點，數(shù)據(jù)清理原則為某一疾病靶點至少在3 個數(shù)據(jù)庫中都被收錄，保存刪除重復后所得靶點。

1.3 lPF相關(guān)靶點在美國國立生物中心基因表達集數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus；https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）以“Idiopathic pulmonary fibrosis”為關(guān)鍵詞檢索與IPF 相關(guān)的芯片數(shù)據(jù)，獲得編號為GSE53845 的芯片數(shù)據(jù)原始文件和GPL6480 芯片基因注釋文件，該芯片數(shù)據(jù)的原始文件檢測了包括40例IPF患者、8名健康對照者的肺活檢組織，并進行了全基因組轉(zhuǎn)錄組分析。原始數(shù)據(jù)采用robust multiarray average（RMA）算法進行背景校正和矩陣數(shù)據(jù)歸一化處理，利用limma 包二次分析芯片數(shù)據(jù)，以P值（P＜0.05）且以1為底數(shù)的異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）logFC≥1或logFC≤-1 為條件篩選相關(guān)數(shù)值，將篩選出的差異基因與已知IPF疾病靶點取交集，即為IPF發(fā)病過程已知靶點。

1.4 麥門冬湯對lPF 作用靶點預測通過venny 2.1.0 軟件（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）對篩選的麥門冬湯預測靶點與IPF 相關(guān)發(fā)病機制基因靶點進行對比分析，兩者交集基因即為麥門冬湯治療IPF 作用機制相關(guān)靶點。并將所得基因靶點導入SRTING 數(shù)據(jù)庫，將物種設置為人類，獲得相關(guān)蛋白互作網(wǎng)絡圖，保存為TSV 格式，運用Cytoscape 軟件對蛋白互作網(wǎng)絡進行拓撲分析。

1.5 相關(guān)microRNA 在線預測將麥門冬湯治療IPF潛在作用靶點的Gene Symbol上傳到microRNA在線預測工具（http：//ophid.utoronto.ca/mir-DIP/index.jsp）預測相關(guān)miRNA，按Integrated Score選取前10個miRNAtargets，通過Cytoscape進行可視化分析，探究麥門冬湯通過miRNA 治療IPF的相關(guān)機制。

1.6 靶點功能富集分析將麥門冬湯治療IPF潛在作用靶點的Gene Symbol 上傳到David 6.8數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）進行功能富集分析，收集生物過程（biological process，BP）、細胞成分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）和KEGG 通路（KEGGPathway）的富集分析結(jié)果，并以P＜0.05 為顯著富集的生物功能和生物信號通路，根據(jù)富集分析結(jié)果與相關(guān)信號通路，探究麥門冬湯潛在靶點治療IPF的相關(guān)機制。

1.7 分子對接選取Cytoscape軟件拓撲分析結(jié)果中關(guān)聯(lián)度（degree）值排名前5的化合物及12個藥物-疾病交集靶點，從RCSB PDB數(shù)據(jù)庫（http：//www1.rcsb.org/）及TCMSP 數(shù)據(jù)庫下載關(guān)鍵靶點與相關(guān)化合物的三維結(jié)構(gòu)與化學結(jié)構(gòu)，將其上傳至iGEMDOCK 軟件，并對關(guān)鍵靶點與相關(guān)化合物進行分子對接分析。

2 結(jié)果

2.1 麥門冬湯的活性成分與靶點篩選共獲得包括麥門冬22 個、半夏43 個、人參168 個、甘草205個、粳米23個、大棗74個在內(nèi)的502個化合物活性成分，剔除重復項后共獲得1039 個麥門冬湯藥物靶點。

2.2 特發(fā)性肺纖維化相關(guān)基因分析與檢索在GeneCards、CTD、DisGeNET、DrugBank 及OMIM 數(shù)據(jù)庫分別檢索到2792、32988、378、24、322 個靶點，收集至少在3 個數(shù)據(jù)庫中都被收錄的疾病基因，刪除重復出現(xiàn)的基因靶點后共獲得與IPF 發(fā)生發(fā)展相關(guān)的作用靶點303個。

應用GEO數(shù)據(jù)庫下載GSE53845基因芯片數(shù)據(jù)，通過GEO2R在線工具分析IPF組與對照組數(shù)據(jù)，以P＜0.01 且以1 為底的差異倍數(shù)｜logFC｜≥1 為條件篩選到713個差異表達基因，其中包括430個上調(diào)基因和283個下調(diào)基因，并與IPF已知靶點進行關(guān)聯(lián)分析，共獲取43 個共同表達的疾病基因靶點。

2.3 “藥物-疾病”交集靶點預測麥門冬湯與IPF藥物-疾病交集靶點共12個。麥門冬湯與IPF交集靶基因包括：精氨酸酶1（ARG1）、前列腺素G/H合酶2（PTGS2）、白細胞介素13（IL13）、血管細胞黏附蛋白1（VCAM1）、Ⅰ型血管緊張素Ⅱ受體（AGTR1）、缺氧誘導因子1-α（HIF1A）、尿激酶型纖溶酶原激活劑（PLAU）、間質(zhì)膠原酶（MMP1）、基質(zhì)溶素1（MMP3）、膠原α-1（Ⅰ）鏈（COL1A1）、膠原α-1（Ⅲ）鏈（COL3A1）、骨橋蛋白（SPP1），以上靶基因即為麥門冬湯治療IPF的直接或間接作用靶點。見圖1。

圖1 麥門冬湯與特發(fā)性肺纖維化的藥物-疾病交集靶標韋恩圖

將上述12個交集靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫，獲得相關(guān)蛋白互作網(wǎng)絡圖，保存為TSV 格式，運用Cytoscape 軟件對蛋白互作網(wǎng)絡進行拓撲結(jié)構(gòu)分析，包括靶點和靶點、靶點和化合物間直接及間接作用關(guān)系。見圖2。

圖2 麥門冬湯治療IPF相關(guān)靶點和化合物網(wǎng)絡圖

2.4 miRNA 靶向基因調(diào)控網(wǎng)絡構(gòu)建將12 個潛在作用靶點導入mirDIP數(shù)據(jù)庫進行miRNA預測分析，Minimum Score 選擇very high，共搜索到與預測靶點相互關(guān)聯(lián)的278條miRNA，按Integrated Score 排序選取前15 個miRNA，分別是hsa-miR-29c-3p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-29b-3p、hsamiR-98-5p、hsa-miR-17-5p、hsa-let-7b-5p、hsalet-7c-5p、hsa-let-7i-5p、hsa-let-7g-5p、hsalet-7f-5p、hsa-let-7d-5p、hsa-let-7e-5p、hsamiR-26a-5p、hsa-miR-101-3p、hsa-miR-128-3p，將以上miRNA 及其相互關(guān)聯(lián)的靶點數(shù)據(jù)導入Cytoscape進行可視化分析，見圖3。

圖3 miRNA靶向基因調(diào)控網(wǎng)絡

2.5 靶點功能富集分析將12 個潛在作用靶點導入David 數(shù)據(jù)庫進行GO 功能富集和KEGG 通路分析，以P＜0.05 為閾值，篩選出麥門冬湯治療IPF 參與的生物學過程與相關(guān)信號通路。發(fā)現(xiàn)麥門冬湯治療IPF 潛在作用靶點參與了包括膠原分解過程、細胞外基質(zhì)組織、細胞外基質(zhì)分解、膠原蛋白生物合成過程、老化等29 個生物過程，細胞外空間、細胞外區(qū)域、膠原三聚體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、細胞外基質(zhì)5 個細胞組分，血小板衍生生長因子結(jié)合、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性、內(nèi)肽酶活性、細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)組成4 個分子功能；導出DAVID 數(shù)據(jù)庫GO 功能富集結(jié)果，以P＜0.05 為閾值，篩選出顯著富集條目，將分子功能、細胞組分及前10 個條目生物過程相關(guān)數(shù)據(jù)導入GraphPad Prism 8 軟件繪制成可視化條形圖，見圖4。KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示麥門冬湯治療IPF 的信號通路包括NF-κB 信號通路、ECM-受體相互作用、TNF 信號通路等，其中NF-κB 信號通路差異最顯著，將KEGG 通路富集分析結(jié)果數(shù)據(jù)導入Omicshare 軟件進行可視化分析，見圖5。

圖4 麥門冬湯治療IPF的生物學分析過程

2.6 交集靶點與相關(guān)化合物的分子對接分析在拓撲學參數(shù)計算結(jié)果中，化合物與對應靶點關(guān)聯(lián)度（degree）越大，麥門冬湯通過該化合物及其相關(guān)靶點治療IPF 的可能性越大。將關(guān)聯(lián)度排名前5 的化合物槲皮素（quercetin，MOL000098）、山奈酚（kaempferol，MOL000422）、β-胡蘿卜素（betacarotene，MOL002773）、豆甾醇（Stigmasterol，MOL000449）、纈氨酸（Valine，MOL000067）與12 個藥物-疾病交集靶點通過iGEMDOCK 進行分子對接驗證，得到60 個對接結(jié)果，見圖6。對接值越低，表示二者結(jié)合性能越好，對接結(jié)果顯示靶點MMP3與化合物β-胡蘿卜素結(jié)合度最高，結(jié)合性能最佳，對接值為-120.723。

3 討論

IPF 是一種進行性間質(zhì)纖維化肺病，其病理特征主要表現(xiàn)為炎癥細胞的激活與浸潤、成纖維細胞大量增殖、細胞外基質(zhì)過度沉積和肺組織結(jié)構(gòu)破外，目前尚無有效的治療方法。在IPF 的發(fā)生發(fā)展過程中，常涉及多種細胞因子及多條信號通路表達異常，現(xiàn)有的研究試圖從微小核糖核酸和信號通路層面探索新的治療方案及其相關(guān)機制。

微小RNA（MicroRNA，miRNA）是一類非編碼小RNA，長度為19-22 個核苷酸，在翻譯后水平調(diào)節(jié)基因表達［8-9］，基于本研究miRNA-靶點網(wǎng)絡分析發(fā)現(xiàn)miR-29 家族、let-7 家族等通過調(diào)節(jié)基因靶點參與了纖維化、肌成纖維細胞增殖和過度細胞外基質(zhì)沉積等干預IPF的進程，這與當前IPF相關(guān)微小核糖核酸研究不謀而合。miR-29家族均與COL3A1、COL1A1相關(guān)聯(lián)，Let-7家族與IL-13相關(guān)聯(lián)。miR-29家族是第一批在肺、心臟和肝臟纖維化疾病中發(fā)現(xiàn)被下調(diào)的微小核糖核酸之一，被認為是肺纖維化的主要調(diào)節(jié)者，COL1A1、COL3A1 是miR-29 的直接靶點，miR-29 通過抑制包括COL1A1、COL3A1 等膠原蛋白在內(nèi)的細胞外基質(zhì)，調(diào)節(jié)與膠原蛋白合成、交聯(lián)和降解相關(guān)的酶而發(fā)揮作用［10］。miR-29在肺纖維化組織中表達下調(diào)，COL1A1、COL3A1 等膠原蛋白合成增多，細胞外基質(zhì)沉積，最終誘發(fā)肺間質(zhì)纖維化［11-12］。COL1A1 和COL3A1 同為成纖維細胞纖維化的標志物，上皮細胞損傷后機體內(nèi)成纖維細胞可活化為肌成纖維細胞［13］，肺肌成纖維細胞的大量聚集和細胞外基質(zhì)過度沉積被認為是IPF 病理機制之一。Let-7 家族共有l(wèi)et-7a、-7b、-7c、-7d、-7e、-7f、-7g和-7i、miR-98等13個包含促纖維化過程的負調(diào)節(jié)因子成員。研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)let-7a 和let-7b 可抑制COL1A1 表達與肌成纖維細胞活化［14］，減緩IPF 發(fā)展進程。Let-7d 則通過減緩成纖維細胞增殖，降低其遷移能力及抑制成纖維細胞因子，上調(diào)Let-7d 表達可使成纖維細胞失去部分間充質(zhì)特性而達到治療IPF 的目的［15］。Let-7c、-7e、-7f、-7g 和-7i 目前研究較少，其機制可能是通過調(diào)節(jié)促炎細胞因子IL-13 表達，抑制IPF早期炎癥反應進程，起到抑制IPF的作用。

本研究GO 富集與KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示，麥門冬湯干預IPF 作用靶點主要參與了膠原分解過程、細胞外基質(zhì)組織、細胞外基質(zhì)分解、膠原蛋白的生物合成過程、老化等生物過程，參與調(diào)控的信號通路主要富集于NF-κB 信號通路、ECM-受體相互作用、TNF 信號通路等，還富集于癌癥、阿米巴病、黏著斑等疾病通路上。TNF 信號通路和NF-κB 信號通路是常見的炎癥相關(guān)信號通路，血管細胞黏附蛋白1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）共同富集于這兩條信號通路上。肺部炎癥反應是肺纖維化早期病變，其介導的血管內(nèi)皮細胞損傷及血管生成過多是肺間質(zhì)纖維化的重要病理過程。VCAM-1 是一類膜表面糖蛋白，廣泛存在于血管內(nèi)皮細胞中，是介導細胞與細胞外基質(zhì)相互黏附、結(jié)合的重要黏附因子。NF-κB信號通路參與機體免疫反應、炎癥反應和腫瘤發(fā)生發(fā)展等多種生理病理過程，VCAM-1 被證實是其直接靶點，VCAM-1 序列中含有NF-κB 結(jié)合位點并受其調(diào)控［16-17］。當NF-κB 信號通路激活時，VCAM1表達上調(diào)，誘導血管內(nèi)皮細胞黏附，細胞外基質(zhì)過度沉積，從而誘導肺間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展。TNF信號通路被激活時，其關(guān)鍵因子TNF-α 通過刺激血管上皮細胞促進VCAM-1 及其受體表達，進而誘導纖維化［4］。

本研究發(fā)現(xiàn)麥門冬湯干預IPF主要與槲皮素，山奈酚，豆甾醇、β-胡蘿卜素等化合物及MMP3、VCAM-1、IL-13等12個靶點密切相關(guān)，通過對以上化合物及靶點的分子對接分析發(fā)現(xiàn)，靶點MMP3 與化合物β-胡蘿卜素結(jié)合性能最佳。MMP3 是一類主要在上皮細胞、成纖維細胞等細胞內(nèi)表達的基質(zhì)金屬蛋白酶，通過在細胞外基質(zhì)周轉(zhuǎn)過程中激活基質(zhì)金屬蛋白酶原，降解大量的細胞外基質(zhì)蛋白，調(diào)控細胞外基質(zhì)中膠原蛋白不斷重塑，促進膠原蛋白沉積［18］。研究發(fā)現(xiàn)MMP3在IPF患者移植肺內(nèi)高表達，而細胞和動物模型相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)MMP3可通過激活肺上皮細胞中的β-catenin 信號傳導，增加E-鈣黏蛋白裂解和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，最終發(fā)展為IPF［19］?；衔铴?胡蘿卜素可能通過與靶點MMP3 高度結(jié)合參與MMP3 誘導IPF 進程。而山奈酚、豆甾醇被證實具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等多種作用［20-22］，由此推測麥門冬湯可在一定程度上干預IPF進展。

綜上所述，本研究從生物信息學及網(wǎng)絡藥理學的角度系統(tǒng)預測麥門冬湯治療IPF 的潛在分子機制，麥門冬湯治療IPF 涉及多個miRNA、多條通路、多個靶點，在治療IPF 時除了針對局部關(guān)鍵通路，還應考慮疾病病因、所處機體環(huán)境差異，進行多靶點、多系統(tǒng)干預，綜合發(fā)揮中醫(yī)藥多靶點、多方面干預的可行性和優(yōu)勢。