王姍淇， 鄭婉婷， 張穎穎， 張英， 何國振

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州 510006）

春砂仁是產(chǎn)于廣東陽春地區(qū)的一種道地藥材，主要功效為健脾和胃[1]。隨著陽春砂種植年限的延長，砂仁植株的葉片病害伴發(fā)相應(yīng)嚴(yán)重，威脅植株的生長，影響砂仁的產(chǎn)量，造成經(jīng)濟損失[2]。因此，積極控制植株病害具有重要意義。植物會產(chǎn)生一些具有保護作用的次生代謝物質(zhì)[3]，應(yīng)用植物源農(nóng)藥防治中藥材和果蔬病害已成為當(dāng)前綠色防控的新趨勢。鴉膽子為苦木科植物鴉膽子Brucea javanica（L.）Merr.的干燥成熟果實[4]，主產(chǎn)于我國廣東、海南、廣西及云南等地[5-6]，其含有油酸、苦木內(nèi)酯類、黃酮類等多種化合物，具有抗癌、抗腫瘤、抗菌等多種藥理作用[7]。有研究表明，鴉膽子及其葉子的提取物對薯蕷炭疽菌、意大利青霉、蘋果褐腐病菌、芒果炭疽病菌、番茄灰霉病菌、草莓軟腐病菌、黃瓜枯萎病菌、辣椒枯萎病菌、茄子枯萎病菌和番茄枯萎病菌均具有一定的抑制作用[8-11]。

農(nóng)藥多通過破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)完整性，阻礙菌絲體生長，發(fā)揮抑菌作用[12]。本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)，鴉膽子提取物對陽春砂葉片上存在的2種病原真菌——Epicoccum thailandicum和Muyocopron laterale，有較好的抑制作用。Epicoccum屬和Muyocopron屬的其他真菌也可引起多種植物致病[13-14]。因此，本研究以陽春砂葉片2 種典型病原菌為研究對象，以細(xì)胞膜相關(guān)的生理生化參數(shù)為指標(biāo)，探討鴉膽子提取物的抑菌作用及機理，以期為鴉膽子開發(fā)為植物源農(nóng)藥提供參考，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 試材與菌種鴉膽子果實購自廣西百色那坡縣，洗凈晾干后打成中粉。引起陽春砂葉片病害的2 種真菌Epicoccum thailandicum和Muyocopron laterale由本實驗室對發(fā)病植株取樣后分離純化，并經(jīng)過致病性驗證和菌種鑒定后獲得。

1.2 試劑與儀器二喹啉甲酸（BCA）試劑盒（北京蘭杰柯科技有限公司）；過氧化氫（H2O2）試劑盒（貨號：A064-1-1）、丙二醛（MDA）試劑盒（貨號：A003-2）、過氧化物酶（POD）試劑盒（貨號：A084-3）和總超氧化物歧化酶（T-SOD）試劑盒（貨號：A001-1-2）（南京建成生物工程研究所）。透射電鏡（日立高新技術(shù)公司，HT7700 型）；生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司，BPC-70F 型）；恒溫培養(yǎng)搖床（上海一恒科學(xué)儀器有限公司，THZ-103B 型）；紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司，UV-5500PC 型）；高速冷凍離心機（THINK SCOMP?，13R型）。

1.3 鴉膽子提取物的制備參考?xì)W陽輝桂[15]的方法調(diào)整提取條件，選擇95%乙醇作為溶劑，料液比1∶7，提取溫度60 ℃，提取時間2 h，提取次數(shù)3 次。合并濾液后，35 ℃減壓濃縮真空干燥至恒質(zhì)量，密封冷藏備用。

1.4 病原真菌內(nèi)容物釋放量的測定接種2 種病原菌的菌絲于馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基（PDB）中25 ℃培養(yǎng)72 h，無菌條件下稱取2.0 g 的真菌團塊若干份，分別放入50 mL 鴉膽子提取物濃度為100 mg·mL-1的無菌磷酸鹽緩沖液（PBS，pH=7.2）中，將此處理方法設(shè)為處理組，對照組為加入真菌團塊的50 mL 無菌PBS。25 ℃下120 r·min-1（離心半徑15 cm）振蕩培養(yǎng)。分別于0、1、2、3、4、5、6、8 和10 h 取1 mL 培養(yǎng)液，4 000 r·min-1（離心半徑8.75 cm）離心5 min，測定上清液吸光度（OD）260 nm處值，每組處理3次重復(fù)。

1.5 病原真菌菌絲體內(nèi)可溶性蛋白含量的測定接種2 種病原真菌菌絲于PDB 培養(yǎng)基中25 ℃培養(yǎng)72 h，無菌條件下稱取1.0 g的真菌團塊若干份，分別放入20 mL 鴉膽子提取物濃度為100 mg·mL-1無菌去離子水中，將此處理方法設(shè)為處理組，對照組為加入真菌團塊的20 mL 無菌去離子水。25 ℃下120 r·min-1（離心半徑15 cm）振蕩培養(yǎng)。分別在0、3、6、12、24 h 時取出菌絲，用無菌水沖洗并用滅菌濾紙吸去水分后，加入2.5 mL 預(yù)冷生理鹽水中，冰浴，研磨至勻漿狀，2 500 r·min-1（離心半徑8.75 cm），4 ℃低溫離心10 min，取上清液20 μL按照BCA 試劑盒的方法測定蛋白含量，每組重復(fù)處理3次。

1.6 病原真菌菌絲H2O2和MDA 含量的測定按照“1.5”項下方法制備樣本，取上清液按照試劑盒說明書采用分光光度法測定2種病原真菌菌絲體內(nèi)H2O2含量，采用比色法測定菌絲體內(nèi)MDA 含量，每組處理3次重復(fù)。公式如下：

1.7 病原真菌菌絲POD和T-SOD活性的測定2種病原真菌粗酶液的制備同“1.5”項下操作，取上清液按照試劑盒說明書采用比色法測定菌絲體內(nèi)POD 活性，采用羥胺法測定菌絲體內(nèi)T-SOD 活性，每組處理3次重復(fù)。公式如下：

1.8 病原真菌菌絲形態(tài)的觀察無菌條件下取PDB 培養(yǎng)基中25 ℃培養(yǎng)72 h 的真菌團塊，放入鴉膽子提取物濃度為100 mg·mL-1的無菌水溶液中，對照組為無菌水。25 ℃下130 r·min-1（離心半徑15 cm）振蕩培養(yǎng)24 h，用無菌水沖洗去除表面的鴉膽子提取物，將處理好的樣品放入3%戊二醛和1%四氧化鋨中雙固定，用乙醇水溶液梯度脫水，樹脂包埋后切片，用醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙染色，于透射電鏡下觀察。

1.9 統(tǒng)計方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。各組數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，采用配對T檢驗。內(nèi)容物釋放量因鴉膽子提取物本身帶有吸光度，所以測得的數(shù)據(jù)選擇與初始時刻相比較，其余指標(biāo)的數(shù)據(jù)與對照組同時刻下的數(shù)據(jù)相比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鴉膽子提取物對陽春砂葉片病原真菌細(xì)胞內(nèi)容物釋放量的影響OD260nm值可以代表核酸的吸光度，用以指示細(xì)胞內(nèi)容物的釋放量。處理組培養(yǎng)液的OD260nm值高于對照組（見圖1）。相比初始時刻，E.thailandicum的處理組在10 h 時升高了5.32倍（P＜0.001），M.laterale的處理組在1 h 時升高了98.55%（P＜0.001）。說明鴉膽子提取物使病原真菌菌絲所在溶液的OD260nm值增高，提示2 種病原真菌細(xì)胞內(nèi)容物外滲。

圖1 鴉膽子提取物對E.thailandicum 和M.laterale細(xì)胞內(nèi)容物釋放量的影響Figure 1 Effect of Brucea javanica extract on the release of cell contents of E.thailandicum and M.laterale

2.2 鴉膽子提取物對陽春砂葉片病原真菌菌絲體內(nèi)可溶性蛋白濃度的影響可溶性蛋白濃度是多種生理生化指標(biāo)計算的基礎(chǔ)，蛋白質(zhì)可構(gòu)成多種保護酶，結(jié)合其他指標(biāo)可分析菌絲體的狀態(tài)。前3 h，處理組和對照組菌絲體內(nèi)可溶性蛋白濃度下降（見圖2），可能與菌絲更換培養(yǎng)體系，滲透壓差改變有關(guān)。3 ～6 h，處理組菌絲體內(nèi)可溶性蛋白濃度下降，根據(jù)后期透射電鏡結(jié)果，推測細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變，可溶性蛋白外滲，使得菌絲體內(nèi)蛋白濃度下降。3 h時處理組與對照組相比，E.thailandicum的處理組可溶性蛋白含量增加了3.13 倍（P＜0.001），M.laterale的處理組可溶性蛋白含量增加了1.70 倍（P＜0.001），說明病原真菌菌絲體內(nèi)可溶性蛋白含量顯著增加與鴉膽子提取物的刺激有關(guān)。

圖2 鴉膽子提取物對E.thailandicum 和M.laterale菌絲體內(nèi)可溶性蛋白濃度的影響Figure 2 Effect of Brucea javanica extract on the concentration of soluble protein in the mycelium of E.thailandicum and M.laterale

2.3 鴉膽子提取物對陽春砂葉片病原真菌H2O2和MDA 含量的影響過量的活性氧可導(dǎo)致包括細(xì)胞膜在內(nèi)的多種細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損傷。H2O2含量是反映細(xì)胞膜過氧化程度的重要指標(biāo)[16]。如圖3 所示，前6 h，對照組H2O2含量出現(xiàn)較明顯的波動，主要與病原菌的培養(yǎng)環(huán)境改變有關(guān)。6 h 后，處理組H2O2含量均高于對照組，E.thailandicum24 h 時升高93.30%（P＜0.001），M.laterale6 h時增加1.14倍（P＜0.01），說明鴉膽子提取物可以刺激病原真菌菌絲細(xì)胞產(chǎn)生過量的H2O2。

圖3 鴉膽子提取物對E.thailandicum 和M.laterale過氧化氫（H2O2）含量的影響Figure 3 Effect of Brucea javanica extract on the content of hydrogen peroxide in E.thailandicum and M.laterale

MDA 是膜質(zhì)過氧化過程的重要代謝產(chǎn)物。MDA 含量是反映細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化程度和損傷程度的重要指標(biāo)[17]。2種病原真菌的MDA含量變化趨勢一致，處理組明顯高于對照組（P＜0.001），見圖4，說明鴉膽子提取物刺激E.thailandicum和M.laterale菌絲細(xì)胞發(fā)生了過氧化。

圖4 鴉膽子提取物對E.thailandicum 和M.laterale丙二醛（MDA）含量的影響Figure 4 Effect of Brucea javanica extract on the malondialdehyde（MDA）content of mycelium of E.thailandicum and M.laterale

2.4 鴉膽子提取物對陽春砂葉片病原真菌POD 和T-SOD 活性的影響POD 和T-SOD 是細(xì)胞過氧化的保護酶，其活性的變化可以反映細(xì)胞的過氧化過程[18]。由圖5 可見：2 種病原真菌對照組的POD含量整體呈上升趨勢，可起到消除過氧化產(chǎn)物的作用，保護細(xì)胞；E.thailandicum處理組的POD 活性呈下降趨勢，12 h 后POD 活性趨近于零。M.laterale的POD 始終趨于零活性，M.laterale的POD活性相比對照組均顯著降低（P＜0.001），提示POD可能受到鴉膽子提取物干擾而失活。

圖5 鴉膽子提取物對E.thailandicum 和M.laterale過氧化物酶（POD）活性的影響Figure 5 Effect of Brucea javanica extract on the peroxidase（POD）activity of E.thailandicum and M.laterale

相比于POD，T-SOD 受鴉膽子提取物影響程度稍輕。與對照組相比，處理組E.thailandicum3 h時酶活性降低60.38%（P＜0.001），M.laterale12 h時酶活性降低79.61%（P＜0.001），見圖6。24 h內(nèi)，處理組酶活性始終呈現(xiàn)出低于對照組的現(xiàn)象，說明在鴉膽子提取物的作用下，病原真菌的TSOD 活性無法達到抵御細(xì)胞過氧化的正常水平。鴉膽子提取物降低了病原真菌的POD 和T-SOD 的活性，從而使其菌絲細(xì)胞因過氧化而造成損傷。

圖6 鴉膽子提取物對E.thailandicum 和M.laterale總超氧化物歧化酶（T-SOD）活性的影響Figure 6 Effect of Brucea javanica extract on the total superoxide dismutase（T-SOD）activity of E.thailandicum and M.laterale

2.5 鴉膽子提取物對陽春砂葉片病原真菌菌絲形態(tài)的影響細(xì)胞是菌絲的基本單元，破壞其結(jié)構(gòu)將導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物外滲，進一步影響菌絲的正常生理活動[19]。由圖7 可見，對照組細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞壁和細(xì)胞膜邊緣清晰，細(xì)胞間質(zhì)均勻。經(jīng)過鴉膽子提取物處理后，該2種病原真菌細(xì)胞膜出現(xiàn)不同程度的缺損或粗糙，細(xì)胞內(nèi)空腔增多，E.thailandicum出現(xiàn)核質(zhì)濃縮，M.laterale出現(xiàn)核碎裂。說明鴉膽子提取物可以透過并損壞病原真菌細(xì)胞膜。

圖7 鴉膽子提取物對E.thailandicum 和M.laterale菌絲形態(tài)的影響（×6 000）Figure 7 Effect of Brucea javanica extract on mycelial morphology of E.thailandicum and M.laterale（×6 000）

3 討論

附球菌屬（Epicoccumsp.）和Muyocopronsp.的真菌可引起多種植物致病，尤其是前者，附球菌屬的真菌在全球20個國家中危害多種植物的健康[13]。鴉膽子提取物可抑制這2 個屬中的病原真菌——Epicoccum thailandicum和Muyocopron laterale，在果蔬和中藥材種植過程中具有開發(fā)為植物源農(nóng)藥的潛能。

本研究中，真菌內(nèi)容物釋放量的測定顯示，鴉膽子提取物可以增加2 種病菌細(xì)胞膜的通透性?？疾爝@2 種病原真菌菌絲體內(nèi)H2O2和MDA 含量的變化，表明細(xì)胞膜通透性的改變可能與膜脂質(zhì)過氧化相關(guān)。研究[20-22]表明，一旦打破細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化和氧自由基反應(yīng)的動態(tài)平衡即可損傷細(xì)胞膜，增加細(xì)胞膜通透性，造成細(xì)胞損傷。進一步采用透射電鏡觀察鴉膽子提取物對2種病原真菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的影響，表明處理后的病原真菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損，細(xì)胞內(nèi)空腔增多。綜上所述，鴉膽子提取物可通過降低過氧化作用相關(guān)的保護酶活性，使得2種病菌細(xì)胞中過量的活性氧無法及時消除，進而發(fā)生脂質(zhì)過氧化，造成細(xì)胞膜通透性增加，細(xì)胞內(nèi)容物外滲，從而達到抑制菌絲生長的效果。

本研究主要集中在鴉膽子提取物對E.thailandicum和M.laterale細(xì)胞膜的通透性及細(xì)胞過氧化的影響方面。后續(xù)鴉膽子提取物抑制病原菌的機制研究有待進一步運用組學(xué)分析，例如基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)以及多個組學(xué)聯(lián)合應(yīng)用，并深入探討鴉膽子提取物是否影響DNA 復(fù)制、RNA 水平、轉(zhuǎn)運蛋白活性、糖基化過程等，以期更好地理解病原菌的細(xì)胞功能、生長、發(fā)育和生物系統(tǒng)構(gòu)建及遺傳互作[23]。