何新榮， 盧漢祺， 鄧麗娥， 鐘云良， 李強

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州 510006；2.東莞市中醫(yī)院，廣東東莞 523000）

糖尿病腎?。╠iabetic kidney disease，DKD）是糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）最常見的微血管并發(fā)癥，是在全球范圍內(nèi)嚴重影響人類生命健康的三大非傳染性疾病之一[1]。在患2 型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）的人群中有高達40%的患者會出現(xiàn)腎臟并發(fā)癥[2]，臨床上定義為腎功能受損或尿白蛋白排泄升高或二者皆有[3-5]。中國成人的糖尿病患病率已經(jīng)從2007 年的9.7%上升到了2017 年的11.2%[6]。DKD 的早期癥狀不明顯，主要表現(xiàn)為蛋白尿、腎小球高濾過，通常最先在隨診過程中的尿檢及腎功能檢查時發(fā)現(xiàn)異常，否則難以引起患者的關(guān)注。隨著病程進展，腎小球濾過率（eGFR）進行性下降，患者臨床表現(xiàn)可涉及多系統(tǒng)、多器官，包括終末期腎?。╡nd-stage renal disease，ESRD）、其他部位進行性靶器官損害等。一旦進入ESRD，患者將需要依賴腎臟替代治療以改善癥狀、延長壽命，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。因此，預(yù)防和管理糖尿病患者的腎臟并發(fā)癥是其整體管理的關(guān)鍵目標。但是，DKD 發(fā)病機制復(fù)雜，其發(fā)病率逐年上升，干預(yù)手段有限。

益腎方是東莞市中醫(yī)院的協(xié)定方。多年的臨床實踐表明，益腎方在改善DKD 患者癥狀及延緩DKD 進展方面療效顯著，但其作用機制尚未明確，這在一定程度上影響了其臨床的推廣與應(yīng)用。因此，為闡明益腎方改善DKD 潛在的機制，篩選DKD 治療的新靶點及探索中藥新適應(yīng)癥提供新思路，本研究觀察了益腎方對db/db 小鼠體質(zhì)量、血糖、尿微量白蛋白/肌酐比值（UACR）、尿微量白蛋白（MAU）、血清胱抑素C（Cys-C）及腎臟病理改變的影響，并采用轉(zhuǎn)錄組、小RNA（sRNA）測序技術(shù)檢測腎臟組織RNA、微小RNA（microRNA，miRNA）表達變化，進行生物信息學(xué)分析，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物28 只無特定病原體（SPF）級6 周齡雄性（Lepr）ko/ko db/db 糖尿病小鼠和7 只同遺傳背景雄性（Lepr）db/m 小鼠，體質(zhì)量22 ～50 g，均購自江蘇集萃藥康生物科技有限公司，動物生產(chǎn)許可證號： SCXK（蘇）2015-0001。動物在暨南大學(xué)動物實驗中心SPF級動物房進行飼養(yǎng)。每天自由攝食、飲水，12 h/12 h光暗循環(huán)，室內(nèi)溫度保持在（24±1）℃，環(huán)境濕度保持在45% ± 10%。本研究獲暨南大學(xué)動物倫理委員會審批同意（倫理批號：PZ22033）。

1.2 主要藥物及制備益腎方組成：黃芪30 g、山茱萸15 g、柴胡10 g、當(dāng)歸10 g、菟絲子20 g、僵蠶15 g。中藥材由東莞市中醫(yī)院提供。將上述藥材加入5 倍量蒸餾水煎煮30 min，煎煮2 次，混合過濾后將水煎液濃縮到200 g，于4 ℃冰箱中存儲備用。洛汀新（北京諾華制藥有限公司生產(chǎn)，批準文號：國藥準字H20000292），將洛汀新研磨成粉，每500 mL 生理鹽水中加入500 mg 粉劑混勻，制備成洛汀新混懸液后常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑與儀器Cys-C 酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（武漢伊萊瑞特生物公司）；尿肌酐（UCr）ELISA 試劑盒、MAU ELISA 試劑盒（武漢酶免生物公司）；蘇木精染液和伊紅染液（武漢塞維爾生物科技有限公司）；糖原PAS 染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；神經(jīng)鈣黏蛋白（Ncad）、纖維連接蛋白（FN）、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）和上皮鈣黏蛋白（E-cad）等抗體（武漢塞維爾生物科技有限公司）；GAPDH抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗兔IgG 二抗、HRP 標記驢抗山羊IgG 二抗（武漢生物科技有限公司）；Agilent BioAnalyzer 2100 系統(tǒng)的RNA Nano 6000 檢測試劑盒（美國Agilent Technologies 公司）。BV-2 垂直電泳儀（武漢Servicebio 公司）；RT-6100酶標儀（美國Rayto 公司）；BT-2 轉(zhuǎn)印電泳儀（武漢Servicebio 公司）；CFX-96 PCR 擴增儀（美國伯樂公司）。

1.4 分組與給藥共分5 組。正常組：7 只db/m小鼠，給予10 mL·kg-1·d-1生理鹽水灌胃12 周；模型組：7只db/db糖尿病小鼠，給予10 mL·kg-1·d-1生理鹽水灌胃12 周；益腎方低劑量組：7 只db/db 糖尿病小鼠，給予2.5 g·kg-1·d-1益腎方水煎液灌胃12 周；益腎方高劑量組：7 只db/db 糖尿病小鼠，給予5.0 g·kg-1·d-1益腎方水煎液灌胃12周；洛汀新組：7 只db/db 糖尿病小鼠，給予10 mg·kg-1·d-1洛汀新混懸液灌胃治療12 周。db/db 糖尿病小鼠采用抽簽隨機分組法。小鼠進入動物房環(huán)境適應(yīng)1周后即小鼠第7 周齡開始灌胃，每日1 次。其中，益腎方低劑量組及洛汀新組小鼠的灌胃量根據(jù)人與動物間按體表面積折算表[7]計算得出，益腎方高劑量組的灌胃劑量為益腎方低劑量組的2倍。

1.5 觀察指標與方法

1.5.1 體質(zhì)量 分別于給藥前、給藥后每周固定時間以及處死小鼠前，記錄小鼠的體質(zhì)量。

1.5.2 血糖儀檢測空腹血糖 應(yīng)用快速血糖儀檢測小鼠空腹8 h尾靜脈血糖濃度，每周檢測1次。

1.5.3 ELISA 法檢測生化指標 代謝籠收集尿液，按照試劑盒說明書測定MAU 及UCr 水平，并計算得出UACR。給藥結(jié)束后，眼眶采血，按照試劑盒說明書檢測血清Cys-C水平。

1.5.4 Western Blot法檢測腎間質(zhì)纖維化相關(guān)蛋白N-cad、FN、α-SMA、E-cad 的表達水平 取腎臟組織加入放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解液（使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑），勻漿，離心（12 000g，4 ℃，10 min），取上清液（即為總蛋白溶液），應(yīng)用二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒測定上清液蛋白濃度。10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉1 h。加入以TBST 稀釋的一抗（1∶5 000），4 ℃孵育18 h，TBS液洗滌3次，加入以TBST稀釋的二抗（1∶5 000），37 ℃孵育30 min，TBS 液洗滌3 次。加入化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）顯色，進行顯影，定影。根據(jù)不同的發(fā)光強度調(diào)整曝光條件。將膠片掃描存檔，PhotoShop整理去色，Alpha軟件處理系統(tǒng)分析目標帶的光密度值。

1.5.5 光鏡觀察腎臟病理改變 取腎臟組織，石蠟包埋后切片（厚度約4 μm），進行蘇木素-伊紅（HE）染色和PAS染色。

1.5.6 RNA-seq測序與sRNA-seq測序

1.5.6.1 RNA 提取及質(zhì)量檢測 按照試劑盒說明書提取正常組、模型組及益腎方治療組小鼠腎臟組織總RNA，其中益腎方治療組包含低、高劑量組中隨機選出的7 個小鼠腎臟樣本。在1%瓊脂糖凝膠上監(jiān)測RNA 降解和污染；RNA 純度用Nanophotometer 分光光度計檢查；RNA 濃度用Qubit 2.0 熒光分光光度計中的Qubit RNA 檢測試劑盒進行檢測；使用Agilent BioAnalyzer 2100 系統(tǒng)的RNA Nano 6000檢測試劑盒評估RNA完整性。

1.5.6.2 文庫構(gòu)建與測序 根據(jù)制造商建議，按說明書使用NEBNext?UltraTMRNA Library Prep Kit for Illumina 生成RNA 測序文庫，使用NEBNEXT?Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina?生成sRNA 測序庫。將純化產(chǎn)物合成的cDNA 文庫在Agilent BioAnalyzer2100 系統(tǒng)上使用DNAHigh Sensition 芯片進行質(zhì)量評估。根據(jù)制造商的說明，使用Truseq SR 集群工具包V3-CBOT-HS（Illumia）在CBOT 集群生成系統(tǒng)上對索引編碼樣本進行聚類。聚類后，在Illumina HiSeq 2500 平臺上對文庫制劑進行雙端RNA 測序和sRNA 測序，并產(chǎn)生125 bp/150成對末端reads以及50 bp的單端reads。

1.5.6.3 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制 本次分析中，所用質(zhì)量評估軟件為FastQC，所用處理軟件為Trimmomatic，篩選規(guī)則為以TruSeq3-PE.fa 為模板去除接頭，限定最小序列長度RNA為50 nt、miRNA為17，去除序列開頭末尾質(zhì)量分數(shù)低于3 的堿基，以4 nt為滑窗長度，去除序列中平均質(zhì)量分數(shù)低于16的片段。

1.5.6.4 表達量檢測 在GENCODE 網(wǎng)站（https://www.gencodegenes.org/）獲取小鼠（Genome assembly version：GRCm39；GENCODE release：M26；Release Date：2021.02）的參考基因組序列、參考轉(zhuǎn)錄本序列和基因組注釋文件，并根據(jù)物種的參考基因組、參考轉(zhuǎn)錄本和基因組注釋信息將處理后的測序數(shù)據(jù)比對到小鼠基因組上，并對每個轉(zhuǎn)錄本進行定量。RNA-Seq 所用比對軟件為STAR，miRNA為bwa 的aln 子程序，RNA 使用的定量軟件為HTSeq-count，miRNA為miRdeep2。

1.6 基因表達差異分析上述步驟獲得表達矩陣后，取10個及以上樣本表達量＞0的基因進行主成分分析（PCA），將離群剔除后再進行差異分析。R 語言DESeq2 包基于負二項式廣義線性模型檢測RNA、 miRNA 表達的差異性。 使用DESeq2（v1.32.0）R 包對各實驗組和對照組的基因差異分析，表達量差異倍數(shù)≥2以及調(diào)整后P值＜0.05 的基因被定義為差異表達基因。另外，使用R 包ggplot2 以火山圖形式對各實驗組和對照組的差異基因進行可視化。

1.7 基因本體論（GO）及京都基因與基因組百科全書（KEGG）分析上述步驟獲得的差異表達RNA使用R 包clusterProfiler 進行GO 和KEGG 通路富集分析，并采用BH 方法校正P值，矯正后的P值＜0.05的GO 和Pathway 定義為顯著富集，將得到的富集結(jié)果使用R 包ggplot2 進行繪圖。對于差異表達miRNA，則上傳至DIANA-miRPath v3.0（http://www.microrna.gr/miRPathv3），物種參數(shù)選擇人類，平臺選擇TargetsScan，然后進行靶基因預(yù)測及GO和KEGG通路富集分析[8]。

1.8 統(tǒng)計方法采用SPSS 26.0 統(tǒng)計處理軟件，計量資料應(yīng)用k-s單樣本檢驗方法檢驗各組變量正態(tài)分布的情況，以均數(shù)±標準差（±s）表示。若符合正態(tài)分布，組間比較使用獨立樣本t檢驗，多組間兩兩比較采用方差分析（LSD法）；非正態(tài)分布的兩獨立樣本間比較則采用Wilcoxon 秩和檢驗，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)的多樣本間比較采用Kruskal-Wallis檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠體質(zhì)量、生化指標檢測結(jié)果表1 結(jié)果顯示：與正常組比較，其他各組小鼠體質(zhì)量均有不同程度增加（P＜0.05），其中模型組體質(zhì)量增加最明顯；與模型組比較，益腎方低、高劑量組及洛汀新組小鼠體質(zhì)量有所下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；益腎方低、高劑量組小鼠體質(zhì)量與洛汀新組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組小鼠體質(zhì)量、血糖水平比較Table 1 Comparison of body mass and blood glucose among each group of mice（±s）

表1 各組小鼠體質(zhì)量、血糖水平比較Table 1 Comparison of body mass and blood glucose among each group of mice（±s）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

?

與正常組比較，模型組，益腎方低、益腎方高劑量組及洛汀新組血糖水平顯著升高（P＜0.05）；其余各組血糖水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2結(jié)果顯示：與正常組比較，其他各組UACR 水平顯著升高（P＜0.05），其中，模型組升高最為顯著（P＜0.05）；與模型組比較，益腎方低、高劑量組及洛汀新組UACR均下降，益腎方高劑量組下降幅度最大（P＜0.05）；益腎方低劑量組UACR 與洛汀新組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組小鼠生化指標比較Table 2 Comparison of biochemical indicators among each group of mice（±s）

表2 各組小鼠生化指標比較Table 2 Comparison of biochemical indicators among each group of mice（±s）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與洛丁新組比較；④P＜0.05，與益腎方低劑量組比較

?

與正常組比較，模型組MAU值升高（P＜0.05）；與模型組比較，益腎方低、高劑量組及洛汀新組的MAU 值有不同程度下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；益腎方低、高劑量組與洛汀新組之間兩兩比較，MAU水平無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

與正常組比較，模型組、洛汀新組Cys-C水平顯著升高（P＜0.05），益腎方低、高劑量組Cys-C無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；與模型組比較，益腎方低、高劑量組Cys-C 水平顯著下降（P＜0.05）；益腎方低、高劑量組Cys-C 水平顯著低于洛丁新組（P＜0.05）；Cys-C 值的益腎方低、高劑量組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 腎間質(zhì)纖維化相關(guān)蛋白表達結(jié)果圖1 ～圖2結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組、益腎方低劑量組的N-cad 表達水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，益腎方高劑量組、洛汀新組的N-cad表達水平顯著下降（P＜0.05）；益腎方高劑量組的N-cad 表達水平低于低劑量組（P＜0.05）；益腎方低、高劑量組N-cad表達水平與洛汀新組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 各組小鼠腎臟組織腎纖維化相關(guān)蛋白表達比較（±s）Figure 1 Effect of Yishen Prescription on renal fibrosis-associated proteins among each group of mice（±s）

圖2 腎纖維化相關(guān)蛋白Western Blot電泳條帶圖Figure 2 Western Blot banding of renal fibrosisassociated proteins

與正常組比較，模型組的FN 表達水平顯著升高（P＜0.05），其他各組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；益腎方低、高劑量組及洛汀新組FN 表達水平與模型組比較，差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

各組間α-SMA 表達水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

與正常組比較，模型組、益腎方低劑量組的E-cad 表達水平顯著降低（P＜0.01 或P＜0.001），益腎方高劑量組、洛汀新組的E-cad 表達水平降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組比較，益腎方低、高劑量組及洛汀新組的E-cad表達水平升高（P＜0.05 或P＜0.01）；益腎方高劑量組的E-cad 表達水平高于益腎方低劑量組（P＜0.05）；益腎方高劑量組E-cad 表達水平與洛汀新組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 腎臟病理結(jié)果圖3 結(jié)果顯示：模型組小鼠腎小球基底膜增厚，系膜區(qū)無細胞結(jié)構(gòu)樣增生明顯，可見部分球囊粘連，腎間質(zhì)出現(xiàn)纖維化；與模型組比較，洛汀新組基底膜厚度無明顯差異，可見節(jié)段性球囊粘連現(xiàn)象，但系膜區(qū)增寬現(xiàn)象減輕，腎間質(zhì)纖維化減輕；與洛汀新組比較，益腎方低劑量組基底膜厚度增生情況無顯著性差異，但未出現(xiàn)節(jié)段硬化及球囊粘連現(xiàn)象，未出現(xiàn)球袢缺血皺縮現(xiàn)象，系膜區(qū)增生現(xiàn)象稍減輕，腎間質(zhì)未見纖維化；與洛汀新組比較，益腎方高劑量組基底膜厚度增生情況減輕，未出現(xiàn)節(jié)段硬化及球囊粘連現(xiàn)象，未出現(xiàn)球袢缺血皺縮現(xiàn)象，系膜區(qū)增生現(xiàn)象進一步減輕，腎間質(zhì)未見纖維化。

圖3 各組小鼠腎小球HE及PAS染色結(jié)果（×400）Figure 3 Results of HE and PAS staining of glomeruli among each group of mice（×400）

2.4 差異分析結(jié)果獲得mRNA、miRNA 表達矩陣后，分別進行樣品主成分分析，發(fā)現(xiàn)正常組有1 個離群樣本（見圖4-A），將其剔除后重新進行主成分分析，發(fā)現(xiàn)各樣本基本聚集在一起（見圖4-B）；miRNA 表達矩陣進行主成分分析，未發(fā)現(xiàn)明顯離群樣本（見圖4-C）。

圖4 PCA圖Figure 4 PCA diagram

剔除離群樣本后進行差異性分析，如圖5 所示：正常組與模型組對比共發(fā)現(xiàn)293個差異表達基因，上調(diào)基因217 個，下調(diào)基因76 個；正常組與益腎方治療組之間共有101 個差異表達基因，其中，上調(diào)基因39 個，下調(diào)基因62 個；模型組與益腎方治療組之間共有10 個差異表達基因，其中，上調(diào)基因1 個，下調(diào)基因9 個；正常組與模型組共有6個差異miRNA，其他組未發(fā)現(xiàn)差異miRNA。

圖5 差異基因火山圖Figure 5 Differential genetic volcano map

2.5 GO與KEGG分析結(jié)果

2.5.1 差異表達mRNA 的GO 與KEGG 分析 本研究選擇GO、KEGG 富集分析中調(diào)整后P值最低的前10 個條目進行可視化展示。正常組與模型組的差異表達mRNA 進行GO 分析獲得的條目與免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、蛋白質(zhì)活性、脂肪酸代謝、細胞外基質(zhì)沉積等相關(guān)；主要條目有細胞外基質(zhì)（extracellular matrix）、 免疫球蛋白復(fù)合物（immunoglobulin complex）、脂蛋白顆粒（lipoprotein particle）、 高密度脂蛋白顆粒（high- density lipoprotein particle）、 體液免疫反應(yīng)（humoral immune response）、 髓系白細胞遷移（myeloid leukocyte migration） 、 細 胞 趨 化 性（cell chemotaxis）、白細胞趨化性（leukocyte chemotaxis）、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)（regulation of inflammatory response）、 細胞活化的正向調(diào)節(jié)（positive regulation of cell activation）、免疫球蛋白受體結(jié)合（immunoglobulin receptor binding）、積極調(diào)節(jié)防御反應(yīng)（positive regulation of defense response）、糖胺聚糖結(jié)合（glycosaminoglycan binding）、抗原結(jié)合（antigen binding）、長鏈脂肪酸結(jié)合（long-chain fatty acid binding）等。見圖6-A GO結(jié)果。

圖6 mRNA的GO、KEGG富集分析圖Figure 6 GO and KEGG enrichment analysis map of mRNA

正常組與益腎方治療組的差異表達mRNA 的GO 富集條目則涉及膽固醇代謝、脂肪酸代謝、免疫反應(yīng)等。包括：細胞外基質(zhì)（extracellular matrix）、膠原蛋白三聚體（collagen trimer）、脂肪酸代謝過程（fatty acid metabolic process）、類固醇代謝過程（steroid metabolic process）、體液免疫反應(yīng)（humoral immune response）、調(diào)節(jié)膽固醇儲存（regulation of cholesterol storage）、類固醇脫氫酶活性（steroid dehydrogenase activity）、長鏈脂肪酸結(jié)合（long- chain fatty acid binding）、 單羧酸結(jié)合（monocarboxylic acid binding）等。見圖6-B GO結(jié)果。

模型組與益腎方治療組的差異表達mRNA 的GO富集條目有：膠原蛋白三聚體（collagen trimer）、吞噬細胞囊泡膜（phagocytic vesicle membrane）、原代溶酶體（primary lysosome）、含膠原蛋白的細胞外基質(zhì)（collagen-containing extracellular matrix）、細胞外基質(zhì)（extracellular matrix）、免疫球蛋白生產(chǎn)（immunoglobulin production）、產(chǎn)生免疫反應(yīng)分子介質(zhì)（production of molecular mediator of immune response）、清道夫受體活性（scavenger receptor activity）、細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分（extracellular matrix structural constituent）、過氧化物酶活性（peroxidase activity）等。見圖6-C GO結(jié)果。

將各組組間差異顯著的mRNA 用R 包clusterProfiler 進行KEGG 富集分析，正常組與模型組KEGG 富集通路有細胞因子-細胞因子受體相互作用（cytokine-cytokine receptor interaction）、IL-17信號通路（IL-17 signaling pathway）、TNF 信號通路（TNF signaling pathway）、趨化因子信號通路（chemokine signaling pathway）、NF-κB 信號通路（NF-kappa B signaling pathway）、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）。見圖6-A KEGG結(jié)果。

以正常組與益腎方治療組差異基因進行KEGG富集分析所得到的通路較正常組與模型組有部分相同，如：IL-17 信號通路、TNF 信號通路；而其特有的富集通路與膽固醇代謝、脂肪酸代謝、炎癥反應(yīng)相關(guān)，如：類醛固酮的合成和分泌（aldosterone synthesis and secretion）、膽固醇代謝（cholesterol metabolism）、PPAR 信號通路（PPAR signaling pathway）等。見圖6-B KEGG結(jié)果。

模型組與益腎方治療組的差異基因KEGG 分析未獲得有意義的生物信號通路。見圖6-C KEGG結(jié)果。

2.5.2 差異表達miRNA 的GO 與KEGG 分析 將正常組與模型組共有6 個差異miRNA 上傳至DIANA-miRPath 網(wǎng)站，設(shè)置相關(guān)參數(shù)后進行GO 和KEGG 富集分析，所獲得GO 條目有離子結(jié)合（ion binding）、 解剖結(jié)構(gòu)發(fā)展（anatomical structure development）、細胞內(nèi)溶質(zhì)（intracellular）。見圖7-A GO結(jié)果。

圖7 miRNA 的GO（A）、KEGG（B）富集分析圖Figure 7 GO（A）and KEGG（B）enrichment analysis of miRNA

KEGG 富集得到的通路有：NF-κB、Hippo 信號通路、細胞外基質(zhì)受體作用通路（ECM-receptor interaction） 、 類 固 醇 生 物 合 成（steroid biosynthesis）、 細胞黏附分子（cell adhesion molecules）、 N- 甘氨酸生物合成（N- Glycan biosynthesis）等。見圖7-B KEGG結(jié)果。

3 討論

隨著生活水平的改善，全球成年人的糖尿病患病率從1980 年的4.7%上升到2014 年的8.5%[9]，據(jù)預(yù)測，到2035 年全球糖尿病患病人數(shù)可能將近6 億[10]。糖尿病腎病（DKD）是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一。DKD 發(fā)病機制復(fù)雜，涉及晚期糖化終產(chǎn)物堆積、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、脂代謝紊亂、血流動力學(xué)改變、遺傳因素等[11]，治療DKD的方案仍以保守治療為主，包括控制血壓血糖、應(yīng)用腎素-血管緊張素系統(tǒng)阻滯劑降尿蛋白、優(yōu)質(zhì)低蛋白飲食以及降脂藥物等，尚缺乏阻斷DKD 進展的治療方案。

DKD 根據(jù)其臨床表現(xiàn)不同可歸屬于中醫(yī)學(xué)“消渴”“水腫”等范疇。DM 基本病機為陰虛燥熱[12]，因病情長期調(diào)治不當(dāng)逐漸累及中、下二焦，導(dǎo)致脾腎虧虛，脾虛固攝無力，腎虛失于封藏，導(dǎo)致精微物質(zhì)隨尿液下泄，而正氣耗損，行血無力，運化不及，血脈不利，則瘀血、痰濕、濁毒內(nèi)生，導(dǎo)致虛實夾雜之證[13]。故DKD 以脾腎兩虛為基本病機，兼夾痰、濕、瘀。 益腎方基于“脾腎兩虛，絡(luò)脈郁滯”病機，方中：黃芪為君藥，補益肺、脾、腎之陽氣，脾能攝、腎能固，則精微下泄能止；山茱萸、菟絲子益陰固精為臣，配合黃芪，一陰一陽，相互促進，相互轉(zhuǎn)化，發(fā)揮溫腎健脾、止漏濁之功；佐以當(dāng)歸，可行血生血，補而不滯；僵蠶取其清揚之性，透表利于外邪之疏散，疏泄利于濕毒之蠲除，與柴胡共為使藥，輕清升散，疏利三焦，使邪有出路，樞機運轉(zhuǎn)，有利于脾腎同補。全方共奏益腎健脾、通利活血之功。

db/db 小鼠為Lepr 基因缺陷導(dǎo)致的先天肥胖2 型糖尿?。═2DM）小鼠，發(fā)病過程與人T2DM 非常相似，是目前常用的T2DM 動物模型之一。其由于瘦素缺陷導(dǎo)致其功能缺失，在出生后2周內(nèi)就發(fā)生高胰島素血癥，3 ～4周內(nèi)發(fā)展為肥胖，8 ～10周就發(fā)展為糖尿病，可發(fā)生明顯的DKD，是DKD 理想的動物模型。本研究通過db/db小鼠構(gòu)建DKD 模型，觀察益腎方對db/db 小鼠的療效，結(jié)果顯示，低、高劑量益腎方及洛汀新干預(yù)均能有效降低DKD 小鼠體質(zhì)量，改善UACR、MAU 和Cys-C 等生化指標，且并不依賴于降低血糖實現(xiàn)。在降低UACR 方面，益腎方高劑量組優(yōu)于低劑量組及洛汀新組，益腎方低、高劑量組的Cys-C下降幅度大于洛汀新組，但未提示劑量依賴性。以上結(jié)果表明益腎方改善腎功能指標的效果不亞于洛汀新。

腎間質(zhì)纖維化（RIF）是終末期腎病（ESRD）最具特征性的表現(xiàn)，也是各種腎臟疾病進展至ESRD的共同通路。肌成纖維細胞的活化、增殖及細胞外基質(zhì)（ECM）的過度沉積是RIF的主要特征，可致瘢痕形成和腎功能的進行性喪失[14]。肌成纖維細胞有多種細胞來源，其中，腎小管上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）被認為是肌成纖維細胞最重要的來源之一，是RIF 發(fā)生的重要機制[15]。EMT是指上皮細胞轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細胞的生物學(xué)過程，表現(xiàn)為細胞間緊密連接變?nèi)?、極性消失和黏附性降低，伴有N-cad、FN、α-SMA表達上調(diào)和E-cad 表達下調(diào)，通過檢測腎臟組織這4 種蛋白表達可提示RIF程度。E-cad 是一種跨膜糖蛋白，在形態(tài)發(fā)生和傷口愈合中起重要作用，并以鈣依賴性方式參與細胞間粘附。在上皮細胞中，E-cad 與連環(huán)蛋白形成復(fù)合物以穩(wěn)定細胞間粘附并保持上皮細胞的完整性，它不僅參與細胞-細胞粘附，還與多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相互作用并進行調(diào)節(jié)，在發(fā)生EMT 的多種組織中E-cad 的表達受到抑制[16]。在EMT 過程中，上皮細胞粘附連接的蛋白被能提供更大連接靈活性的蛋白N-cad取代，從而導(dǎo)致細胞分離和細胞運動性增強[17]。FN 是主要的細胞黏附分子之一，在許多重要的生理過程中起著關(guān)鍵性作用，如胚胎生成、傷口愈合、止血和血栓形成等。FN表達的改變、降解以及組合與多種病理發(fā)生密切相關(guān)，包括癌癥和纖維化[18]。α-SMA 作為成纖維細胞的標志物早已被證實，RIF 過程中涉及多種因子，它們誘導(dǎo)腎小球系膜細胞、腎小管上皮細胞或腎間質(zhì)成纖維細胞等腎臟固有細胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，使之轉(zhuǎn)化為α-SMA 陽性的肌成纖維細胞，α-SMA 在腎纖維化研究中是理想的檢測指標[19]。本研究采用Western Blot 法檢測腎纖維化相關(guān)蛋白的表達情況以及應(yīng)用光鏡觀察比較各組小鼠腎臟的病理變化，結(jié)果提示：益腎方和洛汀新可以提高db/db小鼠腎臟組織E-cad的表達、降低FN的表達水平，且益腎方高劑量的作用效果不亞于洛汀新，兩者的作用效果都優(yōu)于低劑量益腎方；雖然在降低N-cad、α-SMA 水平方面，益腎方低、高劑量組及洛汀新組的作用效果與模型組相比無統(tǒng)計學(xué)差異，但是從柱狀圖上仍可以看出存在下降趨勢。由此可見，益腎方可能通過抑制EMT 進程來減緩DKD 進展。從病理結(jié)果看，益腎方干預(yù)的小鼠腎小球基底膜增厚、系膜增寬、球囊粘連等現(xiàn)象較模型組明顯減輕。

目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)大量具有潛在重要生物學(xué)功能的轉(zhuǎn)錄本（mRNA 和miRNA），可能對db/db 小鼠疾病表達起重要調(diào)控作用。本研究對各組小鼠腎臟組織進行了mRNA 轉(zhuǎn)錄組及miRNA 測序并進行差異基因分析，結(jié)果顯示，正常組與模型組的差異基因數(shù)量顯著多于正常組與益腎方治療組，說明益腎方干預(yù)能在一定程度上減輕DKD 對腎臟的影響。對差異表達mRNA 根據(jù)分子功能、細胞組分和生物學(xué)過程篩選出顯著富集的GO 條目，正常組比對模型組與正常組比對益腎方治療組差異mRNA均主要富集與炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、脂肪酸代謝相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，正常組與益腎方治療組差異mRNA 主要富集在PPAR 信號通路、IL-17 信號通路等。有研究表明，PPAR 家族是核受體超家族的配體激活轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)細胞的代謝穩(wěn)態(tài)，在脂質(zhì)的儲存和動員，葡萄糖代謝，形態(tài)發(fā)生和炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[20]，配體激活的PPARγ 通過與維甲酸X 受體（RXR）形成異源二聚體來調(diào)控靶基因[21]。PPARγ 基因的突變與脂糖平衡失調(diào)有關(guān)，可導(dǎo)致肥胖和T2DM[22]。而PPARγ 表達上調(diào)通過增加肌肉和脂肪細胞表面的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白的表達，促進葡萄糖轉(zhuǎn)運至組織細胞內(nèi)，還能改善機體的胰島素抵抗，從而降低血糖[23-24]。PPARγ 對炎癥反應(yīng)也有抑制作用，它可以競爭性結(jié)合信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子1（STAT1），抑制JAK-STAT信號通路激活，減輕該通路上相關(guān)炎癥因子生成[25]，還可以抑制p65 的磷酸化及核易位，從而抑制NF-κB 表達[26]。本研究中，正常組與模型組差異miRNA 的KEGG 富集分析也驗證了NF-κB 在DKD中扮演重要角色。既往有研究[27]表明，黃芪甲苷可以激活PPARγ，降低NF-κB 磷酸化水平，從而減少NLPRP3等炎癥小體釋放。肥胖和高脂血癥是CKD 最普遍的獨立危險因素[28]，柴胡皂苷a可以激活PPARα，抑制胰島素抵抗，從而改善大鼠內(nèi)臟脂肪變程度[29]。故推測益腎方可通過PPAR 信號通路調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、脂代謝，進而改善DKD預(yù)后。

IL-17 家族由6 種結(jié)構(gòu)相關(guān)的細胞因子IL-17A（IL-17）、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E（IL-25）和IL-17F 組成，IL-17A 和IL-17F 關(guān)系最密切，大部分由輔助性T細胞17（Th17）產(chǎn)生[30]，而IL-17 是其中最主要的細胞因子。IL-17 信號通路激活可以促進炎癥反應(yīng)，與慢性炎癥、自身免疫性疾病和癌癥進展有關(guān)[31]。IL-17 介導(dǎo)的慢性炎癥在腎小管間質(zhì)纖維化發(fā)生和進展中起著重要的作用，炎癥反應(yīng)在腎臟病變早期賦予損傷后初始保護性作用，但是持續(xù)的炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致ECM 蛋白在腎小管間隙中過度沉積[32-33]。有研究[34]表明，抑制IL-17受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)能有效改善自身免疫性腎小球腎炎小鼠的腎臟病理。梁文林等[35]檢測系膜增生性腎小球腎炎小鼠腎臟組織IL-17的含量，發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷干預(yù)可以降低IL-17表達水平，從而減輕小鼠腎臟病理損傷；黃芪的另一種有效成分黃芪多糖也能有效降低組織中IL-17 的水平[36]。柴胡中的活性成分柴胡皂苷d 可以通過調(diào)節(jié)IL-17 的表達改善自身免疫性肝炎小鼠的炎癥反應(yīng)[37]。菟絲子也能抑制Th17 細胞的過表達，降低IL-17、TGF-β 和IL-23 的表達，從而降低炎癥損傷的風(fēng)險[38]。結(jié)合GO 注釋結(jié)果，本研究發(fā)現(xiàn)相關(guān)差異基因富集在炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)等生物過程中。因此，推測益腎方能調(diào)節(jié)IL-17 介導(dǎo)的炎癥和免疫反應(yīng)，延緩DKD疾病進展。

綜上所述，益腎方干預(yù)可顯著改善DKD 小鼠腎功能，減輕小鼠體質(zhì)量，改善UACR、MAU、Cys-C 水平，且療效不依賴于血糖水平；益腎方可以上調(diào)E-cad、N-cad 的表達，有效延緩腎纖維化；益腎方的腎臟保護作用可能是通過激活PPAR信號通路，抑制IL-17、NF-κB 信號通路，從而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、脂代謝、免疫反應(yīng)來實現(xiàn)的，但仍需要更有針對性的實驗進行驗證。