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        先天性巨結(jié)腸家系EDNRB基因重復(fù)突變1例報(bào)道并文獻(xiàn)復(fù)習(xí)

        2023-09-20 07:30:24丁輝陽雷雯許露肖尚杰周佳亮原麗科黃蓉張亮朱小春
        關(guān)鍵詞:雜合家系甲基化

        丁輝陽 雷雯 許露 肖尚杰 周佳亮 原麗科 黃蓉 張亮 朱小春

        1廣東省婦幼保健院新生兒外科,廣州 511400;2廣東省婦幼保健院婦幼研究所,廣州 511400

        先天性巨結(jié)腸(Hirschsprung's disease,HSCR,OMIM 142623)是一種先天性疾病,其特征是缺乏腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞,導(dǎo)致胃腸動力障礙,是新生兒功能性腸梗阻的主要原因,其發(fā)病率為1/4 000~1/5 000,男女發(fā)病率比為4∶1。目前普遍認(rèn)為,HSCR主要發(fā)病機(jī)制與腸神經(jīng)嵴細(xì)胞的正常遷移、增殖、分化和存活異常有關(guān),以及與腸祖細(xì)胞壁的相互作用受損,這個(gè)過程對于腸神經(jīng)系統(tǒng)(enteric nervous system,ENS)的正常發(fā)育至關(guān)重要。ENS是一個(gè)十分復(fù)雜的過程,受其自身各種基因與環(huán)境中各種調(diào)控因子的影響和精確調(diào)節(jié)。許多報(bào)道已經(jīng)研究了HSCR可能的遺傳原因,據(jù)報(bào)道超過24個(gè)基因和7個(gè)染色體位點(diǎn)在HSCR的發(fā)展中起著重要作用,其中配體酪氨酸蛋白激酶受體(RET)和內(nèi)皮素受體B(EDNRB)作為與HSCR疾病相關(guān)的主要基因在多個(gè)病例中被檢測到[1-3]。RET基因突變占散發(fā)病例的20%和家族性病例的50%[2]。EDNRB基因突變占所有HSCR病例的5%~10%[3]。對東亞人群中的短段型HSCR(short-segment HSCR,S-HSCR)病例進(jìn)行全外顯子組測序(WES)分析,EDNRB基因突變總體風(fēng)險(xiǎn)高于RET[4]。當(dāng)家族中出現(xiàn)HSCR復(fù)發(fā)時(shí),子代患病的風(fēng)險(xiǎn)會增加200倍[5-6],即使在具有明顯單基因遺傳的家系中,家系內(nèi)和家系間表現(xiàn)出不完全外顯率和表型嚴(yán)重程度不一致的情況,這可能推論出其他一些因素參與到HSCR形成過程,例如基因修飾、隨機(jī)表達(dá)、環(huán)境因素等[7]。

        資料與方法

        1.臨床資料

        患者1:母親(Ⅱ2)被診斷為HSCR(具體病情不詳)并在3歲時(shí)接受手術(shù),術(shù)后未發(fā)生并發(fā)癥,此后也未出現(xiàn)腸道相關(guān)問題。

        患者2:患者1的女兒(Ⅲ1),通過輔助生殖技術(shù)孕2產(chǎn)1,在妊娠40周后于2021年4月14日出生,出生體質(zhì)量為3 150 g。出生后當(dāng)天患兒進(jìn)食后出現(xiàn)腹脹,伴嘔吐綠色胃液,未自行排胎便,無嘔血、發(fā)熱、發(fā)紺等異常,予灌腸后可見較多墨綠色胎糞,腹部平片提示腸管積氣并明顯擴(kuò)張,灌腸造影顯示直腸段及乙狀結(jié)腸遠(yuǎn)端狹窄,直腸壺段呈“S”形,降橫結(jié)腸明顯擴(kuò)張,回盲部結(jié)構(gòu)未見異常。該患兒被診斷為HSCR常見型,并在出生84 d時(shí)接受了外科手術(shù)。

        本研究經(jīng)廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批通過(202001101),已簽署知情同意書。

        2.WES和Sanger測序

        2.1.樣品和DNA提取 該患兒家屬簽訂知情同意書后,收集了該家庭成員的外周血樣本。獲得母親的兄弟和他女兒的口腔拭子用于測序驗(yàn)證?;蚪MDNA提取使用RelaxGene血液DNA試劑盒(中國北京天根生物科技有限公司)從300 μl外周血樣本或口腔拭子中獲得。提取的DNA于-20 ℃保存,為測序做準(zhǔn)備。

        2.2.WES檢測 使用Agilent SureSelect Human All Exon Kit v6(Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USA)進(jìn)行基因組DNA雜交;使用Illumina HiSeq X Ten 平臺(Illumina,Inc., San Diego,美國加利福尼亞州)測序及文庫構(gòu)建。

        2.3.數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)分析結(jié)果進(jìn)行分析和注釋,生成的bam文件由SAMtools進(jìn)行排序?;蚪M分析工具包(GATK;https://software.broadinstitute.org/gatk/)用于檢測SNV和插入缺失(<50 bp),并應(yīng)用CNVki(t17)檢測拷貝數(shù)變異(CNV)。為了使用SNV數(shù)據(jù)計(jì)算純合子比率,采用了以下規(guī)則:(1)去除了深度<20x的SNP;(2)只有變異等位基因頻率在0.2和0.8之間的SNP被認(rèn)為是雜合。

        2.4.EDNRB基因外顯子2測序 通過PCR擴(kuò)增EDNRB基因的外顯子2。正向(F)和反向(R)引物序列如下:EDNRB(F)5'-CAGAGATAATGACGCCACCC-3'和(R)5'-CGATCAAGATATTGGGACCG-3',擴(kuò)增程序包括95 ℃變性步驟(10 min),95 ℃(30 s)、52 ℃(20 s)和72 ℃(40 s)40個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物用正向引物測序。

        3.文獻(xiàn)檢索

        檢索萬方、維普、中國知網(wǎng)、PubMed、Medline數(shù)據(jù)庫,搜索關(guān)鍵詞“:先天性巨結(jié)腸(Hirschsprung's disease)“”EDNRB基因(EDNRB gene)”,檢索2022年10月前公開發(fā)表的文獻(xiàn)。剔除標(biāo)準(zhǔn):(1)剔除無法獲得全文資料的文獻(xiàn);(2)對同一作者、醫(yī)院、研究所、數(shù)據(jù)庫重復(fù)報(bào)道突變予以剔除。檢索到15篇相關(guān)文獻(xiàn)(共報(bào)道26個(gè)可能致病的突變位點(diǎn))。

        結(jié)果

        1.基因分析

        WES和Sanger測序在4個(gè)家系成員中鑒定出1個(gè)新的EDNRB基因重復(fù)突變c.367delinsTT(p.L123Fter32),該突變會導(dǎo)致基因移碼,32個(gè)核苷酸的變化(c.123_155ter),使155位的氨基酸過早產(chǎn)生終止密碼子,從而生成功能區(qū)完全缺失的蛋白質(zhì)(圖1、2)。外婆和母親的染色3inv(3)(p11.2p23)和染色體9inv(9)(p12q13)均出現(xiàn)倒置。該家系的RET基因未檢測到突變。4名家系成員均是EDNRB雜合突變攜帶者,其中母親和女兒患病通過手術(shù)治療成功,外婆和舅舅并未表現(xiàn)出巨結(jié)腸的臨床癥狀,見表1。該雜合突變在家系中的外顯率為50%。

        表1 4例EDNRB基因雜合突變攜帶者的臨床資料

        圖1 三代家族系譜(Ⅰ~Ⅲ)

        圖2 經(jīng)Sanger測序驗(yàn)證的二代測序結(jié)果。Z001:患者1(母親),Z002:患者2(女兒),Z003:外婆,Z004:父親,Z005:母親的弟弟,Z006:弟弟的女兒

        2.文獻(xiàn)分析

        以“EDNRB基因”“HSCR”中英文為關(guān)鍵詞,檢索萬方、維普、中國知網(wǎng)、PubMed、Medline數(shù)據(jù)庫。在HSCR患者中報(bào)道了EDNRB基因的多種突變,包括缺失/插入突變、無義突變、剪接突變和幾種錯(cuò)義突變。EDNRB基因突變被發(fā)現(xiàn)存在于幾種臨床癥狀中,最常見的是在HSCR和Shah-Waardenburg綜合征(WS4)[8],或者HSCR合并唐氏綜合征[9],HSCR合并多發(fā)性硬化癥(MS)[10],這些報(bào)道表明EDNRB基因位于多個(gè)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中并影響早期胚胎發(fā)育。EDNRB遺傳風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測具有輔助診斷、提供遺傳咨詢、告知治療方案的潛在臨床應(yīng)用價(jià)值。與HSCR致病相關(guān)的EDNRB變異位點(diǎn),包括我們在研究中發(fā)現(xiàn)的位點(diǎn),如表2所示。

        表2 目前已報(bào)道的EDNRB基因變異位點(diǎn)

        討論

        在此研究中,我們調(diào)查了1個(gè)患有HSCR疾病的家系,并發(fā)現(xiàn)了1個(gè)新的EDNRB突變。其中4個(gè)家系成員中攜帶1個(gè)新的 c.367delinsTT(p.L123Fter32) EDNRB雜合突變。該突變導(dǎo)致155位的氨基酸過早形成終止密碼子,產(chǎn)生功能區(qū)完全缺失的蛋白質(zhì)。我們得出結(jié)論,EDNRB基因c.367delinsTT(p.L123Fter32)突變可能對HSCR具有致病性。EDNRB(Chr 14位置103814625-103844173 bp)被確定為HSCR的潛在候選基因。人類基因組包含EDNRB基因的單個(gè)拷貝,該基因長度24 kb,包含7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子,編碼442個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)[25-26]。EDNRB是黑色素母細(xì)胞和腸神經(jīng)母細(xì)胞遷移所必需的,通過EDNRB的信號傳導(dǎo)對于ENS的發(fā)育至關(guān)重要,EDNRB基因的突變導(dǎo)致人類HSCR神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺乏癥。Shin等[27]確定EDNRB在胚胎第10天和第12.5天之間的神經(jīng)嵴發(fā)育期內(nèi)是必需的。Lee等[28]研究表明,EDNRB蛋白及其配體edn3在小鼠的腸神經(jīng)嵴細(xì)胞系及人黑色素瘤細(xì)胞系的發(fā)育及分化過程中起至關(guān)重要的作用。EDNRB基因點(diǎn)突變的小鼠模型表現(xiàn)出HSCR表型。

        患兒雜合突變基因遺傳自她健康的外婆,這一事實(shí)表明其他未鑒定的基因區(qū)域(內(nèi)含子和啟動子)或其他因素可能導(dǎo)致該家系中HSCR疾病的發(fā)生。表觀遺傳變異在人類疾病的發(fā)展過程中起著重要作用。啟動子甲基化引起的轉(zhuǎn)錄沉默已被認(rèn)為是抑癌基因失活的一種常見機(jī)制[29]。EDNRB的5’端含有大量的CpG重復(fù)序列,這些CpG位點(diǎn)的甲基化可以調(diào)節(jié)基因表達(dá)[30]。啟動子甲基化可引起基因表達(dá)的沉默,異常甲基化與mRNA轉(zhuǎn)錄減少有關(guān)[30]。Eberle等[30]檢測到在HSCR中EDNRB基因低甲基化水平高于對照組,EDNRB表達(dá)的調(diào)節(jié)可能是由于在HSCR中檢測到的異常甲基化引起的。本家系中HSCR疾病的外顯率為50%,我們推測EDNRB基因啟動子區(qū)域的不同甲基化方式使外婆和舅舅不患病,而母親和女兒表現(xiàn)HSCR癥狀。

        HSCR中EDNRB異常表達(dá)的可能有至少兩種機(jī)制:基因突變和異常啟動子甲基化[31]。該突變對劑量敏感,純合子和雜合子發(fā)生HSCR的風(fēng)險(xiǎn)分別為74%和21%[22]。本研究中EDNRB基因雜合突變的風(fēng)險(xiǎn)為50%,高于常見的雜合突變。臨床觀察男性的巨結(jié)腸發(fā)生率顯著高于女性,而該家系未出現(xiàn)男性患病情況。目前,對于HSCR的發(fā)病機(jī)制沒有統(tǒng)一的定論,基因突變也只能解釋70%左右的病例,說明HSCR是一種具有復(fù)雜遺傳模式的多基因遺傳?。?2]。任何影響ENS發(fā)育過程的調(diào)控因子出現(xiàn)異常,這些調(diào)控基因均可能成為HSCR致病基因。

        我們研究了患有HSCR家系中EDNRB突變的遺傳原因,4名成員是EDNRB雜合子突變攜帶者,2名患病成員有明顯HSCR癥狀,而其他人則表現(xiàn)健康。我們假設(shè)新的EDNRB(L123Fter32)突變只是致病因素之一。WES會忽略內(nèi)含子區(qū)域和啟動子區(qū)域甲基化程度。EDNRB基因的啟動子區(qū)低甲基化可能在HSCR的發(fā)生發(fā)展中起作用。啟動子甲基化對突變基因的致病外顯率影響需要更多HSCR病例進(jìn)行基因修飾分析來證實(shí)。外婆和母親均有倒置染色體3inv(3)(p11.2p23)和染色體9inv(9)(p12q13),但與疾病無相關(guān)性。

        利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

        作者貢獻(xiàn)聲明丁輝陽:醞釀和設(shè)計(jì)試驗(yàn),實(shí)施研究,采集、分析/解釋數(shù)據(jù),起草文章,獲取研究經(jīng)費(fèi);雷雯:醞釀和設(shè)計(jì)試驗(yàn),實(shí)施研究,采集、分析/解釋數(shù)據(jù),起草文章,統(tǒng)計(jì)分析;許露:醞釀和設(shè)計(jì)試驗(yàn),對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱,指導(dǎo);肖尚杰、周佳亮、原麗科、黃蓉:對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱,指導(dǎo),支持性貢獻(xiàn);張亮:醞釀和設(shè)計(jì)試驗(yàn),實(shí)施研究,分析/解釋數(shù)據(jù),對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱,統(tǒng)計(jì)分析,行政、技術(shù)或材料支持,指導(dǎo),支持性貢獻(xiàn);朱小春:醞釀和設(shè)計(jì)試驗(yàn),實(shí)施研究,采集數(shù)據(jù),對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱,獲取研究經(jīng)費(fèi),行政、技術(shù)或材料支持,指導(dǎo),支持性貢獻(xiàn)

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