閆瑾, 鄔海艷, 任玉欣, 鄒宜芯, 李慧

(天津農(nóng)學(xué)院 園藝園林學(xué)院,天津 300392)

青花菜(BrassicaoleraceaL. var.italica)屬十字花科蕓薹屬植物,為甘藍(lán)的一個(gè)變種,是餐桌上常見的綠色蔬菜之一,其食用部分主要是脆嫩的花莖和短縮肥嫩的花薹及密集群集成球狀的花蕾。作為歐洲傳統(tǒng)作物,青花菜原產(chǎn)于地中海沿岸,是近年來在亞洲廣泛種植的作物[1]。青花菜不僅擁有豐富的營養(yǎng)成分和良好的口感,還具有抗氧化和抗癌特性,對人體有多種益處[2]。目前,我國青花菜研究領(lǐng)域主要在選育新品種、創(chuàng)新栽培模式、分析營養(yǎng)成分及挖掘功能基因等方面[3]。但由于青花菜在我國栽培年限不長,因此對其育種研究起步晚,導(dǎo)致我國青花菜種質(zhì)資源匱乏,種子價(jià)格昂貴[4]。因此,提高青花菜育種水平、創(chuàng)新種質(zhì)資源迫在眉睫。

秋水仙素作為一種化學(xué)誘變劑,被廣泛應(yīng)用于植物多倍體育種研究中,其能抑制有絲分裂,破壞紡錘體,使染色體停滯在分裂中期,不能形成兩個(gè)子細(xì)胞,從而使染色體數(shù)目加倍。影響秋水仙素對植物細(xì)胞作用的因素主要有處理方法、處理時(shí)間、處理濃度、處理材料和處理溫度等。已有研究表明秋水仙素處理會(huì)使植物產(chǎn)生一些有利的經(jīng)濟(jì)性狀,如提高植物產(chǎn)量、增大葉片表面積和增強(qiáng)抗逆性等[5-8]。對二倍體不結(jié)球白菜和經(jīng)秋水仙素誘導(dǎo)產(chǎn)生的四倍體白菜進(jìn)行夏季抗熱性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),四倍體白菜的抗熱性增強(qiáng),且表現(xiàn)出極好的豐產(chǎn)性[9]。

目前,全球鹽漬化現(xiàn)象成為一大生態(tài)難題,土壤鹽堿化程度加深嚴(yán)重影響農(nóng)業(yè)的發(fā)展。土壤鹽分過高容易造成土壤板結(jié)化問題,植物根系無法均勻分布于土壤中,生長所需的有效成分不能被植物高效利用吸收從而影響植物生長及產(chǎn)量[10]。在高鹽環(huán)境下,植物細(xì)胞離子失衡,膜質(zhì)滲透調(diào)節(jié)功能損傷,生理生化特性受到抑制或增強(qiáng),從而導(dǎo)致植物萎蔫,嚴(yán)重時(shí)可造成植物死亡[11-15]。因此,系統(tǒng)開展耐鹽青花菜品種的選育及青花菜耐鹽能力的提升研究,對我國鹽堿化地區(qū)青花菜產(chǎn)業(yè)化穩(wěn)步發(fā)展具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

本試驗(yàn)以青花菜種子為材料,采用不同濃度秋水仙素處理青花菜種子不同時(shí)間,生長7 d后,以200 mmol/L的NaCl溶液模擬高鹽環(huán)境,研究測定青花菜在鹽脅迫下的生理生化特性變化,探究秋水仙素處理對提高青花菜耐鹽性的影響,旨在為創(chuàng)制耐鹽青花菜品種、提高青花菜耐鹽性奠定重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

青花菜(BrassicaoleraceaL. var.italica)種子為天津科潤蔬菜研究所江漢民博士惠贈(zèng),品種為KJ-18。

1.2 試驗(yàn)方法

設(shè)置0.10%(A1)、0.20%(A2)、0.30%(A3)、0.40%(A4)4個(gè)秋水仙素處理濃度,12 h(B1)和24 h(B2)2個(gè)處理時(shí)間,以蒸餾水浸種12 h為對照(CK)。每個(gè)處理組合選取60粒飽滿種子,重復(fù)3次。用2%次氯酸鈉溶液將青花菜種子消毒10 min,期間搖晃3次,蒸餾水水洗6次,2 min/次。用濾紙將種子表面水分吸干后進(jìn)行秋水仙素處理。將種子裝入5 mL離心管中,加入相應(yīng)濃度的秋水仙素溶液3 mL,用錫紙包裹放于恒溫振蕩器上,轉(zhuǎn)速為200 r/min,溫度為25～27 ℃。處理結(jié)束后,蒸餾水水洗6次,3～5 min/次。將種子分別放在鋪有兩層濕潤濾紙的玻璃培養(yǎng)皿中,置于恒溫光照培養(yǎng)箱中,在溫度(25±2)℃、濕度60%、光強(qiáng)4000 lx條件下培養(yǎng)。定時(shí)噴水保持濕潤。7 d后將青花菜幼苗均勻擺放在鋪有兩層濾紙的培養(yǎng)皿中,隨后分別加入200 mmol/L NaCl溶液10 mL至濾紙完全濕潤,處理0 h、3 h、6 h后取樣。

1.3 生理生化指標(biāo)測定方法

測定青花菜各項(xiàng)生理生化指標(biāo)。葉綠素含量使用LYS-A型葉綠素測定儀進(jìn)行測定;SOD、POD、CAT活性分別采用氮藍(lán)四唑光還原法、愈創(chuàng)木酚法、紫外吸收法進(jìn)行測定[11-15];MDA含量測定采用硫代巴比妥酸比色法[16];可溶性糖、可溶性蛋白、游離脯氨酸含量分別采用蒽酮比色法、考馬斯亮藍(lán)G-250法、酸性茚三酮比色法進(jìn)行測定[17];硫苷含量采用氯化鈀比色法測定[18]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理;應(yīng)用SPSS 20進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,采用Duncan’s法進(jìn)行顯著性分析;應(yīng)用Origin 2021進(jìn)行作圖;采用隸屬函數(shù)分析法進(jìn)行綜合分析。

隸屬函數(shù)值計(jì)算公式:

反隸屬函數(shù)值計(jì)算公式:

Xi:生理指標(biāo)測定值;Xmin、Xmax:所有處理某一指標(biāo)的最小值和最大值。

2 結(jié)果與分析

2.1 秋水仙素處理對鹽脅迫下青花菜幼苗葉片SPAD值的影響

由圖1可知,與CK相比,鹽脅迫3 h時(shí),除A4處理組外,其余秋水仙素處理組的青花菜幼苗SPAD值均顯著增加;鹽脅迫6 h時(shí),A1B1、A2B1、A2B2、A4B2秋水仙素處理的SPAD值均顯著降低。相同處理下,鹽脅迫后秋水仙素處理組的SPAD值均顯著降低。

圖1 秋水仙素處理對鹽脅迫下青花菜幼苗葉片SPAD值的影響Figure 1 Effect of colchicine treatment on SPAD value of broccoli leaves under salt stress注:不同小寫字母表示相同脅迫時(shí)間不同濃度秋水仙素處理間差異顯著(P<0.05);不同大寫字母表示相同濃度秋水仙素處理不同脅迫時(shí)間處理間差異顯著(P<0.05)。下同。

2.2 秋水仙素處理對鹽脅迫下青花菜幼苗抗氧化酶活性的影響

由圖2A可知,鹽脅迫3 h時(shí),所有秋水仙素處理的青花菜幼苗SOD活性均顯著高于CK;A1B1處理的SOD活性最高,較CK增加87.31%。鹽脅迫6 h時(shí),除A1B2、A3B2外,其余秋水仙素處理的SOD活性均顯著高于CK;A2B2處理的SOD活性最高,較CK增加72.09%。相同處理下,除A1B2和A3B2外,其余處理鹽脅迫后的SOD活性均顯著高于鹽脅迫0 h。除A2B1、A2B2外,其余處理的SOD活性隨脅迫時(shí)間的增長呈先增加后降低的趨勢。

圖2 秋水仙素處理對鹽脅迫下青花菜幼苗抗氧化酶活性的影響A:秋水仙素處理對鹽脅迫下青花菜幼苗SOD活性的影響;B:秋水仙素處理對鹽脅迫下青花菜幼苗POD活性的影響;C:秋水仙素處理對鹽脅迫下青花菜幼苗CAT活性的影響Figure 2 Effect of colchicine treatment on antioxidant enzyme activity of broccoli leaves under salt stress

由圖2B可知,鹽脅迫3 h時(shí),除A1B2、A4B1、A4B2外,其余秋水仙素處理的青花菜幼苗POD活性均顯著高于CK;A3B1處理的POD活性最高,較CK增加36.29%。鹽脅迫6 h時(shí),除A4B1、A4B2外,其余秋水仙素處理的POD活性均顯著高于CK;A2B2處理的POD活性最高,較CK增加103.28%。相同處理下,鹽脅迫后的幼苗POD活性顯著高于鹽脅迫0 h,但A4處理組的POD活性較鹽脅迫0 h無顯著差異。

由圖2C可知,鹽脅迫3 h時(shí),除A1B1、A4B2外,其余秋水仙素處理的青花菜幼苗CAT活性均顯著高于CK;A3B2處理的CAT活性最高,較CK增加389.00%。鹽脅迫6 h時(shí),除A1B1、A1B2、A4B2外,其余秋水仙素處理的CAT活性均顯著高于CK;A2B1處理的CAT活性最高,較CK增加400.00%。相同處理下,鹽脅迫后A3B2處理的CAT活性顯著低于鹽脅迫0 h,其余處理的CAT活性不隨脅迫時(shí)間的增長而發(fā)生顯著變化。

2.3 秋水仙素處理對鹽脅迫下青花菜幼苗MDA含量的影響

由圖3可知,鹽脅迫3 h時(shí),A1B1和A3B2處理的青花菜幼苗MDA含量顯著高于CK;A1B1處理的MDA含量最高,較CK增加8.71%。鹽脅迫6 h時(shí),A1B1和A4B2處理的MDA含量顯著低于CK,其余處理的MDA含量較CK無顯著差異;A4B2處理的MDA含量最低,較CK降低34.73%。相同處理下,鹽脅迫后A4B2處理的MDA含量降低,A2B1處理的MDA含量無顯著變化。

圖3 秋水仙素處理對鹽脅迫下青花菜幼苗MDA含量的影響Figure 3 Effect of colchicine treatment on MDA content of broccoli leaves under salt stress

2.4 秋水仙素處理對鹽脅迫下青花菜幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

由圖4A可知,鹽脅迫3 h時(shí),A1B1、A3B1、A3B2處理的青花菜幼苗可溶性糖含量均顯著高于CK;A3B2處理的可溶性糖含量最高,較CK增加29.89%。鹽脅迫6 h時(shí),A1B2、A2B2、A3B1處理的可溶性糖含量與CK相比無顯著差異,其余處理均顯著降低。相同處理下,A1B1、A2B1、A2B2處理均是鹽脅迫后的可溶性糖含量顯著低于鹽脅迫0 h,其余處理均是鹽脅迫后的可溶性糖含量顯著高于鹽脅迫0 h。

圖4 秋水仙素處理對鹽脅迫下青花菜幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響A:秋水仙素處理對鹽脅迫下青花菜幼苗可溶性糖含量的影響;B:秋水仙素處理對鹽脅迫下青花菜幼苗可溶性蛋白含量的影響;C:秋水仙素處理對鹽脅迫下青花菜幼苗脯氨酸含量的影響Figure 4 Effect of colchicine treatment on the content of osmotic regulatory substances in broccoli leaves under salt stress

由圖4B可知,與CK相比,鹽脅迫3 h時(shí),除A1B1、A3B2、A4B1外,其余秋水仙素處理的青花菜幼苗可溶性蛋白含量均顯著增加;鹽脅迫6 h時(shí),A1B1、A2B1、A2B2處理的可溶性蛋白含量顯著增加。鹽脅迫3 h和6 h時(shí),A2B2處理的可溶性蛋白含量均最高,分別較CK增加166.67%和48.78%。相同處理下,除A4B1外,其余處理的可溶性蛋白含量均是鹽脅迫后的顯著高于鹽脅迫0 h。

由圖4C可知,鹽脅迫3 h時(shí),除A4B1、A4B2外,其余秋水仙素處理的青花菜幼苗脯氨酸含量均顯著高于CK;A3B1處理的脯氨酸含量最高,較CK增加188.05%。鹽脅迫6 h時(shí),除A1B1、A4B1、A4B2外,其余秋水仙素處理的脯氨酸含量顯著高于CK;A2B2處理的脯氨酸含量最高,較CK增加73.02%。相同處理下,除CK、A2B2、A4B1、A4B2外,其余處理均是鹽脅迫后的可溶性含量顯著高于鹽脅迫0 h。

2.5 秋水仙素處理對鹽脅迫下青花菜幼苗硫苷含量的影響

由圖5可知,鹽脅迫3 h時(shí),除A4B1、A4B2外,其余秋水仙素處理的青花菜幼苗硫苷含量均顯著高于CK;A2B1處理的硫苷含量最高,較CK增加620.38%。鹽脅迫6 h時(shí),除A1B1、A2B1、A2B2外,其余秋水仙素處理的硫苷含量均顯著高于CK;A3B1處理的硫苷含量最高,較CK增加76.56%。相同處理下,除A1B1和A4B2外,其余秋水仙素處理組的青花菜幼苗硫苷含量隨脅迫時(shí)間的增長呈先升高后降低的趨勢。

圖5 秋水仙素處理對鹽脅迫下青花菜幼苗硫苷含量的影響Figure 5 Effect of colchicine treatment on glucosinolate content of broccoli leaves under salt stress

2.6 秋水仙素處理對鹽脅迫下青花菜幼苗生理生化指標(biāo)的隸屬函數(shù)分析

隸屬函數(shù)法是通過采用綜合各項(xiàng)指標(biāo)對植物進(jìn)行綜合性評價(jià),比單一指標(biāo)能夠更真實(shí)全面地反映出植物的綜合能力。通過隸屬函數(shù)分析秋水仙素處理對鹽脅迫下的青花菜的影響(表1、表2)。不同秋水仙素處理對鹽脅迫下青花菜幼苗生理生化指標(biāo)的綜合評價(jià)結(jié)果顯示:鹽脅迫處理3 h時(shí),A3B1>A1B1>A3B2>A2B1>A2B2>A1B2>CK>A4B1>A4B2;鹽脅迫處理6 h時(shí),A3B1>A2B2>A1B2>A3B2>A2B1>CK>A1B1>A4B1>A4B2,均為A3B1處理排名第一。此結(jié)果表明,A3B1處理的青花菜在鹽脅迫下的抗氧化、滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)、硫苷含量、抗逆性等方面表現(xiàn)優(yōu)良,綜合能力最好。

表1 秋水仙素處理對鹽脅迫3 h下青花菜幼苗生理生化指標(biāo)的隸屬函數(shù)分析Table 1 Membership function analysis of physiological and biochemical indexes of broccoli leaves under salt stress for 3 hours after colchicine treatment

3 討論與結(jié)論

經(jīng)秋水仙素處理后的植物可能會(huì)產(chǎn)生一些有利性狀,如抗逆性增強(qiáng)、產(chǎn)量提高、植株呈巨大性等。秋水仙素具有一定毒性,不同植物受到的毒害作用程度不同,但嚴(yán)重時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致植物死亡。其毒害作用的強(qiáng)弱主要受植株材料、秋水仙素處理濃度、秋水仙素處理時(shí)間的影響。因此,篩選出適宜青花菜生長的秋水仙素處理時(shí)間和處理濃度十分重要。本試驗(yàn)采用不同濃度秋水仙素處理青花菜種子不同時(shí)間,探究經(jīng)秋水仙素處理后青花菜幼苗的耐鹽性能否提高,為提高青花菜耐鹽性提供試驗(yàn)依據(jù)。

根據(jù)植物種類或鹽濃度的不同,鹽度可以降低植物生長速度,延緩植物成熟。高濃度的Na+或Cl-使細(xì)胞內(nèi)水分可利用性降低、鈉離子積累和礦物質(zhì)失衡,導(dǎo)致細(xì)胞和分子損傷。此外,陽離子或陰離子之間的競爭效應(yīng),還可能導(dǎo)致離子毒害或營養(yǎng)缺乏。但不同的植物有不同的適應(yīng)鹽脅迫的機(jī)制,例如,通過脯氨酸的積累調(diào)節(jié)滲透壓,或利用質(zhì)膜上的Na+/H+離子通道將細(xì)胞內(nèi)Na+運(yùn)送到細(xì)胞外環(huán)境,從而防止細(xì)胞損傷。

李悅等[19]研究表明,秋水仙素處理可以延緩干旱脅迫下紫花苜蓿葉片葉綠素含量的下降速度。本試驗(yàn)結(jié)果與前人研究結(jié)果一致,鹽脅迫下,對照組青花菜幼苗葉片SPAD值隨鹽脅迫時(shí)間的增加呈先降低后升高的趨勢,而秋水仙素處理組的青花菜葉片SPAD值仍高于對照組,這表明鹽脅迫嚴(yán)重影響青花菜葉綠素的生物合成,促進(jìn)其加速分解,從而使植物葉片葉綠素含量降低,而秋水仙素處理可以緩解鹽脅迫對青花菜植株光合作用的損傷。

植物體內(nèi)通過多種抗氧化酶系統(tǒng)來降低鹽脅迫對細(xì)胞的損傷,如SOD、POD、CAT等?？寡趸赶到y(tǒng)可以清除植物受到鹽脅迫后體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧自由基[20],以此來減輕鹽脅迫帶來的損傷[21-22]。何笑蕾[23]研究發(fā)現(xiàn),高溫脅迫下,金蓮花二倍體和經(jīng)秋水仙素處理得到的多倍體植株抗氧化酶活性變化趨勢大致相同,但多倍體植株變化幅度較大。本試驗(yàn)結(jié)果與前人研究結(jié)果相似,鹽脅迫下,對照組青花菜幼苗SOD和POD活性隨鹽脅迫時(shí)間的增加均先升高后降低,而CAT活性則是逐漸降低;而秋水仙素處理組的青花菜幼苗體內(nèi)SOD、POD和CAT等酶活性高于對照,進(jìn)一步增強(qiáng)了其清除細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基的能力。

生物膜中不飽和脂肪酸分解會(huì)產(chǎn)生MDA,MDA含量是判斷膜受損程度的重要指標(biāo),而鹽脅迫會(huì)使植物中MDA含量升高[23]。任威威[25]研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)秋水仙素處理的花生植株在干旱脅迫時(shí)葉片內(nèi)并未發(fā)現(xiàn)有過量的MDA含量積累,其含量維持在合理范圍內(nèi)。本試驗(yàn)結(jié)果與前人研究結(jié)果相似,鹽脅迫下,對照組青花菜幼苗MDA含量隨鹽脅迫時(shí)間的增加先升高后降低;而秋水仙素處理使鹽脅迫下青花菜幼苗MDA含量低于對照,表明秋水仙素處理能夠降低鹽脅迫給青花菜細(xì)胞膜帶來的損傷。

滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可以通過降低植物在逆境脅迫下的細(xì)胞質(zhì)滲透勢來提高細(xì)胞含水量,保持膨壓,減輕逆境脅迫帶來的危害[26-27]。滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)主要包括可溶性糖、可溶性蛋白和游離脯氨酸,這些物質(zhì)在植物逆境脅迫下起著重要的保護(hù)作用[28]。已有研究結(jié)果表明,高溫脅迫后,經(jīng)秋水仙素處理得到的金蓮花多倍體植株的各滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的增幅大于二倍體植株的增幅[23]。本試驗(yàn)結(jié)果與前人研究結(jié)果相似,與對照相比,秋水仙素處理使鹽脅迫下青花菜幼苗中各滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量存在不同程度的增加,表明秋水仙素處理對鹽脅迫下青花菜幼苗的滲透調(diào)節(jié)具有改善作用,促進(jìn)了滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累,緩解氧化損傷。

硫苷是十字花科植物特有的富含硫的次級代謝物,硫苷及其分解物在植物抗逆過程中發(fā)揮重要作用[29]。其含量受多種外源物質(zhì)調(diào)控,如NaCl處理會(huì)對植物種硫苷含量產(chǎn)生影響[30]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,鹽脅迫下,對照組青花菜幼苗硫苷含量隨鹽脅迫時(shí)間的增加先升高后降低;而秋水仙素處理使鹽脅迫下青花菜幼苗硫苷含量顯著高于對照,表明秋水仙素處理能夠提高鹽脅迫下青花菜幼苗硫苷含量,為高含量蘿卜硫素提取提供條件。

植物在鹽脅迫下的生理響應(yīng)十分復(fù)雜,很難靠單一指標(biāo)精準(zhǔn)評價(jià)其抗鹽能力。因此,隸屬函數(shù)分析被廣泛應(yīng)用于對植物抗鹽性評價(jià)中。本試驗(yàn)對9個(gè)生理生化指標(biāo)的相對值進(jìn)行隸屬函數(shù)分析發(fā)現(xiàn),0.30%秋水仙素處理12 h的青花菜幼苗在鹽脅迫下的抗氧化、滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)、硫苷含量、抗逆性等方面表現(xiàn)優(yōu)良,綜合能力最好。