李哲 周珊珊 王好學(xué) 王嘉浩 陳璐 徐開達(dá)

(浙江省海洋水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部重點(diǎn)漁場(chǎng)漁業(yè)資源科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站,浙江省海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江舟山 316021)

運(yùn)輸是魚類人工增殖放流過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]。不適宜的運(yùn)輸條件,如過(guò)高的運(yùn)輸密度和過(guò)長(zhǎng)的運(yùn)輸時(shí)間等,容易引發(fā)運(yùn)輸脅迫,導(dǎo)致魚苗產(chǎn)生生理應(yīng)激,降低其免疫力甚至造成死亡[2-6]。在運(yùn)輸過(guò)程中水體的振蕩無(wú)法避免,而水體振蕩也會(huì)引起魚類的運(yùn)輸脅迫[7-10]。目前,水體振蕩引發(fā)的運(yùn)輸脅迫在活魚運(yùn)輸研究中尚未受到充分重視。

運(yùn)輸振蕩一般以“振蕩頻率”來(lái)表示其強(qiáng)度[8-9]。振蕩對(duì)魚類的皮質(zhì)醇、糖原、乳酸含量以及免疫酶活性等生理及生化指標(biāo)有顯著影響[7-8,11]。當(dāng)魚類面臨應(yīng)激脅迫時(shí),其皮質(zhì)醇、血糖、乳酸含量顯著升高[12-14],代謝速率加快,耗氧量和代謝廢物排泄量增加,從而導(dǎo)致水體溶解氧和pH降低[15-17]、氨氮濃度升高[16,18],運(yùn)輸水質(zhì)惡化[19]。因此,在探究運(yùn)輸振蕩對(duì)魚類生理應(yīng)激的影響時(shí),可以根據(jù)相關(guān)血液和水質(zhì)指標(biāo)來(lái)判斷魚類的應(yīng)激水平。

條石鯛(Oplegnathusfasciatus)屬島礁性魚類,廣泛分布于中國(guó)沿海水域,是重要的增殖放流種類。目前,對(duì)條石鯛的研究主要集中在早期發(fā)育[20-22]、繁育技術(shù)[23-25]、生理生化[26-27]以及分子生物學(xué)[28-30]等領(lǐng)域,對(duì)其放流技術(shù)的關(guān)注則較少,而這可能會(huì)影響苗種的增殖放流效果。本研究主要探究了振蕩頻率對(duì)條石鯛幼魚生理應(yīng)激水平的影響,選取血清和肌肉中的皮質(zhì)醇、糖原、乳酸水平作為雙重評(píng)價(jià)指標(biāo),探索條石鯛幼魚可適應(yīng)的振蕩頻率范圍,以期為優(yōu)化條石鯛和其他魚類苗種的運(yùn)輸技術(shù)提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用魚為浙江省海洋水產(chǎn)研究所人工培育的條石鯛幼魚,平均體長(zhǎng)為(118.9±8.1)mm,平均體質(zhì)量為(39.6±8.4)g。試驗(yàn)前,將條石鯛幼魚移入循環(huán)水水池(容積500 L,3口)暫養(yǎng)1周,暫養(yǎng)期間24 h連續(xù)充氣,每天定時(shí)投喂2次配合飼料。試驗(yàn)前24 h停止喂食。養(yǎng)殖試驗(yàn)用水為經(jīng)過(guò)砂濾的海水,循環(huán)使用,水溫為(20.3±0.3)℃,鹽度為25.0±0.6。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)開始后,將條石鯛幼魚從暫養(yǎng)池移入直徑為20 cm、容積為5 L的半透明塑料水桶內(nèi),每桶放入5尾幼魚,桶內(nèi)預(yù)先套入雙層聚乙烯運(yùn)輸袋并加入與暫養(yǎng)水池相同的海水3 L。將水桶平放在可調(diào)速多功能振蕩器(力辰科技,HY-4A)上并加以固定。

本研究共設(shè)置0、60、100、140、180 r/min 共5種振蕩頻率,每種振蕩頻率設(shè)置4個(gè)平行組,模擬運(yùn)輸試驗(yàn)持續(xù)24 h。運(yùn)輸試驗(yàn)期間,使用氣泵向運(yùn)輸袋內(nèi)持續(xù)充氣,并用橡皮筋扎緊運(yùn)輸袋封口以減少海水溢出。

1.3 樣品采集

模擬運(yùn)輸試驗(yàn)結(jié)束后,從每個(gè)平行組隨機(jī)撈取3尾幼魚,用丁香酚麻醉后,取尾靜脈血和背部肌肉。離心血樣所得血清和背部肌肉分別于-80 ℃和-20 ℃凍存待測(cè)。血清和肌肉皮質(zhì)醇、糖原和乳酸含量的測(cè)定均采用酶聯(lián)免疫法,試劑盒為上海酶聯(lián)生物科技有限公司的海水魚類ELISA試劑盒。運(yùn)輸試驗(yàn)過(guò)程中,每4 h取水樣50 mL,采用次溴酸鈉氧化法測(cè)定水體的總氨氮含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)EXCEL 2016軟件處理后,使用R語(yǔ)言4.1.0對(duì)條石鯛幼魚血清和肌肉的皮質(zhì)醇、糖原、乳酸含量等生理指標(biāo),以及各取樣時(shí)間點(diǎn)水質(zhì)樣品中的總氨氮含量進(jìn)行單因素非參數(shù)Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn),多重比較采用Dunn檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)結(jié)果以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)表示,設(shè)P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 生理應(yīng)激指標(biāo)分析

2.1.1 皮質(zhì)醇

模擬運(yùn)輸24 h后,各試驗(yàn)組條石鯛幼魚血清和肌肉中的皮質(zhì)醇水平見圖1。隨著振蕩頻率的提高,條石鯛幼魚血清和肌肉中的皮質(zhì)醇水平均呈升高的趨勢(shì)。其中血清皮質(zhì)醇水平在振蕩頻率為0～140 r/min時(shí)沒(méi)有顯著差異(P>0.05),而肌肉皮質(zhì)醇水平在振蕩頻率100r/min以上時(shí)顯著升高(P<0.05)。結(jié)果表明,當(dāng)振蕩頻率保持在100 r/min以下時(shí),條石鯛幼魚血清和肌肉中的皮質(zhì)醇可維持在較低水平。

注:數(shù)據(jù)柱頂部字母不同代表組間差異顯著(P<0.05)。

2.1.2 糖原

模擬運(yùn)輸24 h后,條石鯛幼魚的血糖水平隨著振蕩頻率的提高呈逐漸升高的趨勢(shì)(見圖2-a),且在振蕩頻率100 r/min及以上時(shí)顯著升高(P<0.05);肌糖原水平則隨著振蕩頻率的提高有逐漸下降的趨勢(shì)(見圖2-b),并且在100 r/min以上時(shí)顯著降低(P<0.05)。結(jié)果表明,當(dāng)振蕩頻率保持在100 r/min以下時(shí),幼魚血清和肌肉中的糖原可分別維持在較低和較高的水平。

注:數(shù)據(jù)柱頂部字母不同代表組間差異顯著(P<0.05)。

2.1.3 乳酸

模擬運(yùn)輸24 h后,條石鯛幼魚血清和肌肉中的乳酸水平隨著振蕩頻率的提高而表現(xiàn)出升高的趨勢(shì)(見圖3)。但當(dāng)振蕩頻率在100 r/min及以下時(shí),幼魚血清和肌肉中的乳酸含量均維持在較低水平。

注:數(shù)據(jù)柱頂部字母不同代表組間差異顯著(P<0.05)。

2.2 水體總氨氮含量的變化

模擬運(yùn)輸試驗(yàn)8 h后,不同振蕩頻率試驗(yàn)組水體的總氨氮含量開始表現(xiàn)出差異,其中振蕩頻率140 r/min組的水體總氨氮含量明顯升高(P<0.05);當(dāng)運(yùn)輸時(shí)間超過(guò)12 h以后,振蕩頻率在100 r/min以上試驗(yàn)組的水體總氨氮含量升高較快,基本上均顯著高于對(duì)照組(見圖4)。

注:數(shù)據(jù)柱頂部字母不同代表組間差異顯著(P<0.05)。

3 討論

在活魚運(yùn)輸過(guò)程中,振蕩無(wú)法避免并且可能會(huì)引發(fā)運(yùn)輸脅迫。本研究主要探究了振蕩頻率對(duì)條石鯛幼魚生理應(yīng)激的影響,包括血清和肌肉中的皮質(zhì)醇、糖原、乳酸水平的差異,以及不同振蕩條件下運(yùn)輸水體水質(zhì)的差異。這些生理和水質(zhì)指標(biāo)差異反映了魚類的應(yīng)激程度,因而可用于推測(cè)適宜運(yùn)輸條石鯛幼魚的振蕩頻率上限。

3.1 皮質(zhì)醇水平的變化

皮質(zhì)醇水平變化屬于原發(fā)性應(yīng)激,是反映魚類生理應(yīng)激程度的重要指標(biāo)[31]。有研究表明[4,32-33],運(yùn)輸脅迫會(huì)促使魚類皮質(zhì)醇水平顯著升高。本研究中,條石鯛幼魚血清和肌肉中的皮質(zhì)醇水平基本上隨著振蕩頻率的提高而逐漸升高,表明隨著振蕩頻率提高,條石鯛幼魚的生理應(yīng)激水平在升高。在較高的運(yùn)輸振蕩頻率下,條石鯛幼魚為了維持魚體穩(wěn)定狀態(tài)所需消耗的能量也會(huì)相應(yīng)增加,而皮質(zhì)醇的主要作用之一是調(diào)動(dòng)能量[34-36],因此皮質(zhì)醇水平升高也說(shuō)明條石鯛幼魚能量消耗的增加。在60～140 r/min的振蕩頻率下,模擬運(yùn)輸24 h后,幼魚的血清皮質(zhì)醇水平與對(duì)照組(0 r/min)差異不顯著,其肌肉皮質(zhì)醇水平則在100 r/min及以下的振蕩頻率下與對(duì)照組差異不顯著。結(jié)果表明,振蕩頻率越高,幼魚的應(yīng)激程度越高,這與模擬運(yùn)輸后大口黑鱸(Micropterussalmoides)幼魚的應(yīng)激反應(yīng)類似[8]。在本試驗(yàn)條件下,從皮質(zhì)醇水平的角度,將振蕩頻率保持在100 r/min及以下,條石鯛幼魚的應(yīng)激水平較低。

3.2 血糖水平的變化

魚類繼發(fā)性應(yīng)激反應(yīng)的主要表現(xiàn)之一是血糖水平升高和組織(肌肉和肝臟等)糖原含量降低[37-38],反映了魚類在應(yīng)激狀態(tài)下對(duì)能量需求的增加[19,36]。本研究中條石鯛幼魚血糖水平和肌糖原水平的變化符合上述表現(xiàn),并可能與皮質(zhì)類固醇的升高相關(guān)[13,39-40],表明提高振蕩頻率促進(jìn)了條石鯛幼魚的能量消耗。運(yùn)輸24 h后,條石鯛幼魚肌糖原水平差異的結(jié)果與黑鯛(Acanthopagrusschlegelii)幼魚運(yùn)輸振蕩的結(jié)果[9]類似。由于在運(yùn)輸前對(duì)幼魚進(jìn)行了停食處理,如果運(yùn)輸過(guò)程中振蕩頻率過(guò)高導(dǎo)致能量消耗過(guò)多,放流后因能量匱乏,幼魚的捕食與反捕食行為易產(chǎn)生缺陷,從而可能降低其在自然生境中的生存能力[41],幼魚可能因此而面臨更高的死亡風(fēng)險(xiǎn)。在本試驗(yàn)條件下,當(dāng)振蕩頻率達(dá)到100 r/min及以上時(shí),試驗(yàn)魚的血糖水平與肌糖原水平分別顯著升高和降低,說(shuō)明在此條件下幼魚的能量消耗增加了。因此,從能量消耗的角度,振蕩頻率應(yīng)保持在100 r/min以下,這樣苗種的應(yīng)激程度和能量消耗可保持在較低水平。

3.3 乳酸水平的變化

乳酸水平變化也是魚類繼發(fā)性應(yīng)激反應(yīng)之一,是供氧不足時(shí)有機(jī)體無(wú)氧代謝的產(chǎn)物。根據(jù)本試驗(yàn)中幼魚的乳酸水平差異,當(dāng)振蕩頻率保持在100 r/min及以下時(shí),無(wú)論是血清乳酸還是肌肉乳酸均處于較低的水平,表明其應(yīng)激和無(wú)氧代謝程度較低。雖然在試驗(yàn)過(guò)程中持續(xù)充氣,但條石鯛幼魚肌肉和血清中的乳酸含量均隨著振蕩頻率的提高而升高,其原因可能是較高的振蕩頻率導(dǎo)致較高強(qiáng)度的物理運(yùn)動(dòng)[13],造成條石鯛幼魚對(duì)氧的需求程度超過(guò)了供氧水平,即無(wú)氧代謝程度在較高的振蕩頻率下也較高,從而導(dǎo)致幼魚乳酸水平的差異。在圓口銅魚(Coreiusguichenoti)[42]和銀鯧(Pampusargenteus)[13]的運(yùn)輸研究中也檢測(cè)到試驗(yàn)魚血液和肌肉中的乳酸水平升高了,但是,鯉(Cyprinuscarpio)[43]運(yùn)輸12 h后,其血液中的乳酸水平卻出現(xiàn)了下降。由此可見,乳酸水平作為活魚運(yùn)輸研究中的應(yīng)激指標(biāo),其變化情況應(yīng)根據(jù)魚種以及運(yùn)輸條件予以具體評(píng)估。

3.4 水體總氨氮濃度的變化

活魚運(yùn)輸過(guò)程中,氨氮作為代謝產(chǎn)物迅速溶于水體,對(duì)魚類具有顯著的毒理作用[44-45],因此,氨氮濃度升高是水質(zhì)惡化的主要表現(xiàn)之一[18,45]。本研究選取水體總氨氮含量作為水質(zhì)評(píng)價(jià)指標(biāo),發(fā)現(xiàn)在運(yùn)輸12 h后,振蕩頻率在100 r/min及以上的試驗(yàn)組水體的總氨氮含量升高較快。有研究表明,模擬運(yùn)輸黑鯛幼魚24 h后,在振蕩頻率105 r/min下,水體的總氨氮含量升高較快,約為20.0 mg/L[9]。本研究中,在振蕩頻率100 r/min條件下,模擬運(yùn)輸24 h后,水體總氨氮含量達(dá)到了39.8 mg/L。若不考慮種間差異,較高的運(yùn)輸密度可能是導(dǎo)致本研究中水體總氨氮含量較高的原因[2,18]:黑鯛幼魚的運(yùn)輸密度為21.75 g/L,本研究的運(yùn)輸密度為66 g/L,達(dá)到其3倍以上。盡管在相似條件下本研究中水體的總氨氮含量更高,但并未如李佩等[2,18]的研究結(jié)果,即振蕩頻率在140 r/min以上會(huì)出現(xiàn)魚死亡現(xiàn)象,說(shuō)明本研究中的條石鯛幼魚對(duì)較高的振蕩頻率有一定的適應(yīng)能力。當(dāng)水體中氨氮含量升高到一定程度,會(huì)抑制魚體內(nèi)的氨排泄,導(dǎo)致血液中的氨氮含量繼續(xù)升高、攜氧能力下降[46],從而帶來(lái)缺氧死亡風(fēng)險(xiǎn)[12]。因此,基于本研究的水體總氨氮含量變化結(jié)果,建議振蕩頻率不高于100 r/min。同時(shí),建議在今后的運(yùn)輸振蕩研究中應(yīng)測(cè)試更多的水質(zhì)指標(biāo),如pH、溶解氧、無(wú)機(jī)鹽離子濃度[16]等。

4 結(jié)論

本研究在實(shí)驗(yàn)室控制條件下,探究了體長(zhǎng)10 cm左右的條石鯛幼魚對(duì)振蕩頻率的生理應(yīng)激。結(jié)果表明,高于100 r/min的振蕩頻率雖未導(dǎo)致條石鯛幼魚死亡,但加劇了幼魚的生理應(yīng)激水平,并加快了運(yùn)輸水質(zhì)的惡化。建議在實(shí)際生產(chǎn)運(yùn)輸中,應(yīng)選擇相對(duì)平坦的道路或避開海浪較強(qiáng)的日期,保持振蕩頻率不超過(guò)100 r/min,盡量減少運(yùn)輸后條石鯛幼魚的生理應(yīng)激,降低運(yùn)輸水質(zhì)的惡化程度。