劉 毅,倪 榮

(湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院婦產(chǎn)科,湖北 恩施 445000)

宮頸癌是常見的婦科腫瘤之一,尤其對(duì)發(fā)展中國(guó)家而言,其發(fā)病率顯著高于發(fā)達(dá)國(guó)家[1]。臨床試驗(yàn)結(jié)果表明宮頸癌早期診斷會(huì)顯著提高患者的生存質(zhì)量,所以選擇有效的分子標(biāo)志物尤為重要。環(huán)狀RNA(circRNAs)是一類具有調(diào)控潛能的非編碼RNA,廣泛表達(dá)于各細(xì)胞和組織中,已發(fā)現(xiàn)多個(gè)circRNA的豐度超過線性RNA的10倍[2]。多個(gè)研究證明circRNA在包括膽管癌[3]、胃癌[4]、肺癌[5]和結(jié)腸癌[6]在內(nèi)的多種腫瘤發(fā)生發(fā)展中起調(diào)節(jié)作用,且部分circRNA作為促癌因子促進(jìn)腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移,另外部分circRNA作為抑癌基因抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展。hsa_circRNA_ATAD1位于chr10:89536077-89544427,剪接序列長(zhǎng)度為308nt?；蚪M結(jié)構(gòu)表明hsa_circRNA_100641被ATAD1基因的3和4個(gè)外顯子環(huán)化[7]。其在腫瘤中的應(yīng)用也有報(bào)道,有研究發(fā)現(xiàn)circRNA-ATAD1可以促進(jìn)胃癌的發(fā)生發(fā)展,但是其在宮頸癌中的作用如何尚未發(fā)現(xiàn)有研究,所以本次試驗(yàn)探究circRNA-ATAD1在宮頸癌組織中的表達(dá)情況及其對(duì)宮頸癌的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

將2020年1月至2021年6月在湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院進(jìn)行宮頸癌治療的110例患者作為實(shí)驗(yàn)組,另選擇同院同期進(jìn)行良性腫瘤切除術(shù)的78例患者作為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組納入標(biāo)準(zhǔn):①術(shù)后病理學(xué)確診為宮頸癌;②臨床病理資料完整;③入院前未接受過放化療治療,并且術(shù)前半年內(nèi)未服用激素類藥物;④術(shù)前HPV16/18陽(yáng)性。排除標(biāo)準(zhǔn):①合并嚴(yán)重肝腎肺功能障礙或免疫功能障礙者;②合并其他惡性腫瘤者;③半年內(nèi)使用免疫抑制劑者;④合并嚴(yán)重血液傳染性疾病者。對(duì)照組患者納入標(biāo)準(zhǔn):術(shù)后確診為女性生殖系統(tǒng)良性腫瘤,主要包括子宮肌瘤、宮頸肌瘤、宮頸囊腫等;術(shù)前HPV16/18陰性,病理資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):合并其余惡性腫瘤,合并嚴(yán)重肝腎肺功能障礙或免疫功能疾病及血液傳染病者。所有受試者均簽署知情同意書并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

實(shí)驗(yàn)組年齡26～77歲,平均年齡(54.38±12.95)歲;對(duì)照組年齡24～78歲,平均年齡(52.73±16.85)歲。不同組患者年齡(t=2.121,P=0.061)、絕經(jīng)比例(χ2=1.025,P=0.085)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,有可比性。宮頸癌患者病理學(xué)分類按照2018版國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics, FIGO)分期標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行[8]。

1.2 circRNA-ATAD1的檢測(cè)方法

宮頸癌患者接受根治性子宮全切術(shù)+盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù),獲取腫瘤組織及距腫瘤組織邊緣2～3cm并經(jīng)病理學(xué)鑒定為正常宮頸組織的癌旁組織。對(duì)照組良性腫瘤患者行子宮切除術(shù)、子宮肌瘤切除術(shù)或?qū)m頸活檢。所有患者皆由經(jīng)驗(yàn)豐富的同組醫(yī)師完成手術(shù),獲取組織后立即置于液氮或-80℃冰箱中保存。將組織標(biāo)本采用液氮研磨后,采用TRIzol試劑(賽默飛,美國(guó))提取組織總RNA,通過瓊脂糖凝膠電泳或分光光度計(jì)測(cè)定濃度和純度后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn);取1μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA(circRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒,廣州吉賽生物科技股份有限公司,中國(guó));實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)檢測(cè)circRNA的表達(dá),嚴(yán)格按照試劑盒(circRNA qRT-PCR試劑盒,廣州銳博生物有限公司,中國(guó))步驟操作;引物序列由廣州銳博設(shè)計(jì)并合成,內(nèi)參為β-actin。擴(kuò)增程序?yàn)?95℃預(yù)變性5min,95℃變性15s,60℃退火30s,72℃延伸30s,進(jìn)行40個(gè)循環(huán),每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置5個(gè)復(fù)孔,反應(yīng)結(jié)束后采用2-ΔΔCt計(jì)算circRNA-ATAD1的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組患者腫瘤組織中circRNA-ATAD1表達(dá)情況

circRNA-ATAD1在實(shí)驗(yàn)組患者腫瘤組織的相對(duì)表達(dá)量為(2.34±0.55),在對(duì)照組中的相對(duì)表達(dá)量為(1.48±0.47),實(shí)驗(yàn)組患者腫瘤組織中circRNA-ATAD1表達(dá)量高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.931,P<0.001),見圖1。

圖1 不同組患者腫瘤組織中circRNA-ATAD1的表達(dá)差異

2.2 宮頸癌組織與癌旁組織circRNA-ATAD1表達(dá)情況

circRNA-ATAD1在腫瘤組織的相對(duì)表達(dá)量為(2.34±0.55),在癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)量為(1.32±0.38),腫瘤組織中circRNA-ATAD1的相對(duì)表達(dá)量高于癌旁組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.347,P<0.001),見圖2。

圖2 腫瘤組織與癌旁組織circRNA-ATAD1的表達(dá)差異

2.3 circRNA-ATAD1與宮頸癌患者臨床病理參數(shù)關(guān)聯(lián)性

按照circRNA-ATAD1相對(duì)表達(dá)的中位數(shù)(2.36)將circRNA-ATAD1分為circRNA-ATAD1低表達(dá)組(n=51)和circRNA-ATAD1高表達(dá)組(n=59),結(jié)果顯示circRNA-ATAD1高表達(dá)組宮頸癌患者組織分化程度較低、FIGO分期多在Ⅲ～Ⅳ期、多有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為9.132、7.847、6.178,P<0.05);兩組年齡、腫瘤大小之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表1。

表1 circRNA-ATAD1與宮頸癌患者臨床病理參數(shù)關(guān)聯(lián)性 [n(%)]

2.4 評(píng)估circRNA-ATAD1對(duì)宮頸癌診斷的ROC曲線

ROC曲線評(píng)估circRNA-ATAD1對(duì)宮頸癌的診斷價(jià)值,結(jié)果顯示ROC曲線下面積為0.877,95%CI為0.824～0.930,P<0.001;敏感度為89.10%,特異度為78.20%,約登指數(shù)為0.67,截?cái)嘀禐?.73,見圖3。

圖3 circRNA-ATAD1對(duì)宮頸癌診斷的ROC曲線

3 討論

3.1 circRNA在腫瘤中的表達(dá)及其對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響

宮頸癌每年的新發(fā)病例占所有新發(fā)癌癥的5%,并且每年約20萬(wàn)婦女由于宮頸癌死亡,嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量。目前對(duì)宮頸癌進(jìn)行早期診斷,進(jìn)而選擇適合的治療策略是改善患者預(yù)后的重要手段之一。選擇合適的分子診斷標(biāo)志物對(duì)于宮頸癌的治療非常重要,目前已知的分子標(biāo)志物包括多種微小RNA(microRNA,miRNA)、長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)和circRNA[9-11]。

環(huán)狀RNA是一類具有普遍性、保守性、組織特異性和穩(wěn)定性的內(nèi)源性非編碼RNA,不含5′帽子和3′poly(A)尾,形成共價(jià)結(jié)合的單鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu),比線性RNA更穩(wěn)定,且對(duì)核酸外切酶R的抵抗力更強(qiáng)[12-13]。研究發(fā)現(xiàn)位于細(xì)胞核內(nèi)的circRNA通過RNA聚合酶Ⅱ調(diào)節(jié)其親本基因的轉(zhuǎn)錄水平[14]。circRNA在腫瘤的發(fā)生中起重要作用,沈重飛等[15]發(fā)現(xiàn)circ_0005692在前列腺癌中顯著下調(diào),并且細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其能顯著抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖、遷移。另外有實(shí)驗(yàn)表明hsa_circRNA_103809可作為miR-377-3p的“分子海綿”,介導(dǎo)GOT1通路調(diào)節(jié)非小細(xì)胞肺癌中的順鉑耐藥性[16]。不同的circRNA在不同的腫瘤中差異表達(dá),可作為腫瘤診斷的潛在分子標(biāo)志物,其作用機(jī)制包括以下幾個(gè)方面:作為miRNA的“分子海綿”,競(jìng)爭(zhēng)性抑制miRNA表達(dá),進(jìn)而影響miRNA靶基因的表達(dá)水平,通過circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)而影響疾病進(jìn)展;circRNA通過介導(dǎo)不同細(xì)胞信號(hào)通路,調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡及遷移而影響腫瘤轉(zhuǎn)移等;circRNA還可協(xié)同炎性因子水平,影響機(jī)體免疫系統(tǒng)而調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展[17]。

3.2 circRNA-ATAD1在不同腫瘤組織的表達(dá)及其作用機(jī)制

在本次試驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)與良性腫瘤組織及癌旁組織相比,宮頸癌組織中circRNA-ATAD1表達(dá)顯著上調(diào),診斷宮頸癌的ROC曲線下面積AUC為0.877,敏感度為89.10%,特異度為78.20%,并且ATAD1表達(dá)情況與組織分化程度、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。Zhang等[7]發(fā)現(xiàn)circRNA-ATAD1在胃癌組織中高表達(dá),與組織分化程度、腫瘤分期相關(guān),并且可以作為胃癌預(yù)后的預(yù)測(cè)因素。另有研究表明circRNA-ATAD1在子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)顯著下調(diào),并且可以通過甲基化下調(diào)miR-10a來(lái)抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞侵襲和遷移[18]。以上結(jié)果表明circRNA-ATAD1在不同的腫瘤組織中表達(dá)有差異,其對(duì)疾病的影響也不盡相同。研究發(fā)現(xiàn)circRNA-ATAD1主要定位于細(xì)胞質(zhì)而不是細(xì)胞核,表明其機(jī)制在轉(zhuǎn)錄后水平起作用。circRNA可以作為miRNA的分子海綿以抑制miRNA的生物學(xué)功能[19]。所以我們也需進(jìn)一步探究circRNA的分子靶標(biāo),探究其circRNA-ATAD1在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。

綜上,circRNA-ATAD1在宮頸癌組織中表達(dá)顯著上調(diào),對(duì)于宮頸癌的診斷有一定效能,可以作為宮頸癌診斷的潛在分子標(biāo)志物。