王新宇,陳紫薇,劉江騰,黎蔚欣,彭慧,張新悅,杜琳

(北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院,北京 100010)

胃潰瘍是常見(jiàn)的消化系統(tǒng)疾病,慢性、周期性(飯后30 min)、節(jié)律性的上腹痛是其典型的臨床表現(xiàn)。本病易反復(fù)發(fā)作,若未及時(shí)診治,可導(dǎo)致胃出血、胃穿孔、幽門(mén)梗阻等并發(fā)癥,甚至發(fā)生腸上皮化生,增加患者胃上皮組織惡變幾率,嚴(yán)重影響患者生命健康及生活質(zhì)量[1]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,歐美地區(qū)消化道潰瘍患病率為6%～15%,國(guó)內(nèi)患病率為13.83%～19.72%,其中胃潰瘍患病率占消化道潰瘍的30%左右[2-6]。胃潰瘍發(fā)病機(jī)制尚不明確,目前被廣泛認(rèn)同的有攻擊因子說(shuō)和防御因子失衡說(shuō)。攻擊因子增強(qiáng)或防御因子的破壞,均可導(dǎo)致黏膜的屏障功能損傷,繼而發(fā)生潰瘍[7]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)胃潰瘍的治療以緩解癥狀、促進(jìn)潰瘍愈合、防止并發(fā)癥和預(yù)防復(fù)發(fā)為目的,具體可通過(guò)降低胃酸、保護(hù)胃黏膜、根除Hp 等來(lái)實(shí)現(xiàn)。雖然治療效果較為顯著,但仍然存在復(fù)發(fā)率高、不良反應(yīng)大等問(wèn)題[1]。

胃潰瘍尚無(wú)明確的中醫(yī)學(xué)病名。根據(jù)其典型癥狀,可將其歸類(lèi)于“胃痛”“痞滿(mǎn)”等范疇。現(xiàn)代研究表明,中藥、針灸等中醫(yī)療法對(duì)胃潰瘍能起到很好的治療作用。大量的基礎(chǔ)、臨床研究表明,針刺治療消化道潰瘍療效確切。動(dòng)物研究顯示胃潰瘍大鼠在電針治療4 d后潰瘍面可基本愈合[8];呂顯威等[9]認(rèn)為針灸可改善胃潰瘍患者胃小凹及微血管形態(tài),提高潰瘍愈合質(zhì)量;一項(xiàng)2017 年的系統(tǒng)評(píng)價(jià)結(jié)果顯示,針刺和西藥對(duì)消化道潰瘍都能起到良好的效果,但針刺可以顯著降低消化道潰瘍的復(fù)發(fā)率[10]。針刺防治胃潰瘍的療效顯著,但其機(jī)制尚未闡明。本文基于現(xiàn)代研究,試從生物信息學(xué)、網(wǎng)絡(luò)拓?fù)洳呗訹11]等方面,探究針刺治療胃潰瘍的主要作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 文獻(xiàn)檢索

本文通過(guò)中國(guó)知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫(kù)、萬(wàn)方數(shù)據(jù)庫(kù)和維普數(shù)據(jù)中文期刊數(shù)據(jù)庫(kù)系統(tǒng)檢索相關(guān)文獻(xiàn),檢索時(shí)限為2001 年8 月—2021 年8 月。檢索方式為主題詞檢索。檢索詞為“針刺”“針灸”“體針”“電針”“胃潰瘍”“消化道疾病”。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

以毫針或電針治療胃潰瘍的實(shí)驗(yàn)研究文獻(xiàn);隨機(jī)對(duì)照的人類(lèi)試驗(yàn)或動(dòng)物實(shí)驗(yàn),以及非隨機(jī)的比較試驗(yàn)(前瞻性和回顧性);對(duì)照干預(yù)可采取安慰劑針灸、假針灸、不治療、另一種積極治療或藥物治療的形式;所選取的腧穴有具體定位及歸經(jīng);感興趣的結(jié)果。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)

使用其他形式刺激的研究,包括無(wú)針穴位按壓、艾灸、經(jīng)皮電刺激;在干預(yù)前后評(píng)估結(jié)果的單組觀(guān)察性研究;僅比較不同針灸形式的研究;以痛點(diǎn)、敏感點(diǎn)為進(jìn)針點(diǎn)的研究。

1.4 文獻(xiàn)篩選

兩名研究人員使用預(yù)先設(shè)定的納入和排除標(biāo)準(zhǔn),獨(dú)立檢索數(shù)據(jù)庫(kù),選擇合適的全文版本文獻(xiàn)。研究人員的爭(zhēng)議通過(guò)協(xié)商解決,若未達(dá)成共識(shí),則由第三位研究員解決爭(zhēng)議。

1.4.1 針刺后機(jī)體產(chǎn)生活性成分的蛋白靶點(diǎn)篩選

STITCH 是一個(gè)包含43 萬(wàn)種化學(xué)品的聚合數(shù)據(jù)庫(kù),鏈接到一個(gè)易于使用的資源,旨在促進(jìn)蛋白質(zhì)和化學(xué)品之間相互作用的研究。Swiss Target Prediction是一個(gè)基于二維和三維相似性度量和已知配體結(jié)合的web 服務(wù)器,可以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)生物活性分子靶標(biāo)。從STITCH 和Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得與褪黑素、生長(zhǎng)抑素(somatostatin, SS)、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)、P 物質(zhì)(substance P,sp)、前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)和神經(jīng)降壓素高結(jié)合親和力(Posibility＞0.1)的靶標(biāo)。合并上述2 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索結(jié)果后去除重復(fù)值,得到活性化合物作用的靶點(diǎn)。

1.4.2 胃潰瘍潛在治療靶點(diǎn)的篩選

GeneCards 是人類(lèi)基因的綜合數(shù)據(jù)庫(kù),包含所有已注釋和可預(yù)測(cè)的基因信息,整合了約150 個(gè)基因數(shù)據(jù)庫(kù)資源,包括基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、遺傳、臨床和功能信息等。本研究以“gastric ulcer”為關(guān)鍵詞檢索了GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù),得到胃潰瘍的相關(guān)靶點(diǎn)。

1.4.3 針刺抗胃潰瘍相關(guān)靶點(diǎn)的篩選

將所得兩組靶點(diǎn)用Venn 工具(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny)進(jìn)行分析。通過(guò)維恩圖將針灸相關(guān)活性成分靶點(diǎn)與胃潰瘍靶點(diǎn)之間的重疊量可視化,重疊部分即為針灸治療胃潰瘍的核心靶點(diǎn)。為明確針刺產(chǎn)生的活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)之間的關(guān)系,運(yùn)用Cytoscape3.8.2 軟件繪制網(wǎng)絡(luò)圖,展示活性成分-靶點(diǎn)的關(guān)系。

1.4.4 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

運(yùn)用STRING11.5(https://string-db.org/cgi/input.pl)構(gòu)建蛋白-蛋白互作(protein-protein interaction networks, PPI)網(wǎng)絡(luò)。將針灸治療胃潰瘍的可能靶點(diǎn)上傳到搜索工具(STRING11.5)中,選擇人類(lèi)作為物種檢索相互作用的基因/蛋白質(zhì)。為明確活性化合物與關(guān)鍵靶點(diǎn)之間的關(guān)系,將檢索結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape3.8.2 軟件,運(yùn)用Network Analyzer 插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩苑治?度值(Degree)越高,與其他節(jié)點(diǎn)的連線(xiàn)越多,說(shuō)明該節(jié)點(diǎn)起到的作用越關(guān)鍵。

1.4.5 基因本體論與京都基因組百科全書(shū)的富集分析

富集分析采用基因本體(gene ontology, GO)富集分析和京都基因組百科全書(shū)(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG),繼而通過(guò)DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david. ncifcrf.gov/home.jsp)繪制和可視化效應(yīng)器靶標(biāo),為進(jìn)一步的功能研究提供依據(jù)。

2 結(jié)果

通過(guò)檢索數(shù)據(jù)庫(kù),共納入36 篇?jiǎng)游镌囼?yàn)及臨床試驗(yàn)文獻(xiàn),篩選出22 個(gè)相關(guān)的活性物質(zhì),其中褪黑素、SS、5-HT、SP、PGE2、神經(jīng)降壓素出現(xiàn)頻次最高,可能對(duì)胃潰瘍有效[12-16]。

2.1 針刺治療胃潰瘍的靶點(diǎn)篩查

應(yīng)用STITCH和Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù),得出與針刺后活性成分所作用的基因 60 個(gè);從GeneCard 數(shù)據(jù)庫(kù)中收集胃潰瘍相關(guān)基因4 980 個(gè)。將兩份原始文件中的人類(lèi)基因名稱(chēng)標(biāo)準(zhǔn)化后匹配,繪制60 個(gè)針灸活性成分的相關(guān)靶點(diǎn)和4 980 個(gè)胃潰瘍相關(guān)的靶點(diǎn)的韋恩圖,得出了交集靶點(diǎn)(圖1),即37 個(gè)潛在的胃潰瘍治療靶點(diǎn)。“針灸-活性成分-靶點(diǎn)-疾病”互作網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖2,橘色菱形代表活性成分,粉色圓形代表60 個(gè)潛在靶點(diǎn),紅色八邊形代表針刺治療,黃色六邊形代表胃潰瘍,產(chǎn)生連接越多的節(jié)點(diǎn)相應(yīng)的圖形面積越大,在治療中發(fā)揮的作用越明顯,其中褪黑素、5-HT和PGE2在治療過(guò)程中可能起到關(guān)鍵作用。

圖1 交集靶點(diǎn)

圖2 活性成分-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.2 PPI 網(wǎng)絡(luò)的建立與分析

基于STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò),經(jīng)過(guò)拓?fù)浞治龊?通過(guò) Cytoscape 可視化,顯示 88 個(gè)節(jié)點(diǎn)?！癉egree”為網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的連接數(shù),可以反映節(jié)點(diǎn)之間的交互程度,Degree 值越大表示節(jié)點(diǎn)的重要性越大。POMC 最大(15),其次是SST(14)、TAC1(12)、SLC6A4(12)、HTR3A(11)和SLC6A3(10)。詳見(jiàn)圖3。Top20 核心靶點(diǎn)按程度排序如表1 所示,確定為針刺治療胃潰瘍的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

2.3 GO 和KEGG 富集分析

GO 分析可以從3 個(gè)方面反映靶標(biāo)功能,分別為細(xì)胞成分(cellular component, CC) 、 分子功能(molecular function, MF)和生物過(guò)程(biological process, BP)。GO 分析結(jié)果顯示得到476 條生物學(xué)過(guò)程,其中396 條BP、25 條CC、55 條MF,分別取前20列表。

其中在BP 層面(圖4),預(yù)測(cè)靶點(diǎn)主要參與環(huán)核苷酸第二信使偶聯(lián)的 G 蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路(G protein-coupled receptor signaling pathway,coupled to cyclic nucleotide second messenger)、腺苷酸環(huán)化酶抑制G 蛋白偶聯(lián)乙酰膽堿受體信號(hào)通路(adenylate cyclase-modulating G protein-coupled receptor signaling pathway)、平滑肌收縮(smooth muscle contraction)等生物過(guò)程具有顯著意義;在CC層面,神經(jīng)元胞體(neuronal cell body)、突觸后膜整體成分(integral component of postsynaptic membrane)其所占比例較大;在MF 層面,與前列腺素受體活性(prostaglandin receptor activity)、二十醛類(lèi)受體活性(icosanoid receptor activity)、神經(jīng)肽受體活性(neuropeptide receptor activity)等關(guān)系密切。

圖3 針刺治療胃潰瘍潛在靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

表1 與針刺治療胃潰瘍相關(guān)的靶點(diǎn)(按“Degree”排序)

圖4 GO-BP 生物學(xué)功能分析

共富集得到KEGG 生物學(xué)過(guò)程7 條。圖5 列出了潛在靶點(diǎn)的KEGG 富集結(jié)果。KEGG 信號(hào)通路涉及神經(jīng)活性配體- 受體相互作用(neuroactive ligandreceptor interaction) 、 cAMP 信號(hào)通路(cAMP signaling pathway)、鈣離子信號(hào)通路(calcium signaling pathway)、5-羥色胺能突觸(serotonergic synapse)、生長(zhǎng)激素合成分泌作用通路(growth hormone synthesis, secretion and action)、色氨酸代謝(tryptophan metabolism)和PPAR 信號(hào)通路(PPAR signaling pathway)。KEGG 通路分析結(jié)果顯示,針刺能通過(guò)多種信號(hào)通路及代謝通路發(fā)揮治療胃潰瘍的作用。圖6 總結(jié)了潛在靶點(diǎn)在cAMP 通路中的作用。

圖5 KEGG 通路富集分析

圖6 潛在靶點(diǎn)在cAMP 通路中的作用

3 討論

本文基于生物信息學(xué)篩選潛在活性成分及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn),預(yù)測(cè)針灸治療胃潰瘍、預(yù)防復(fù)發(fā)的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)及信號(hào)通路。

“針刺-胃潰瘍”共同靶點(diǎn)PPI 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)結(jié)果表明,針刺干預(yù)胃潰瘍與37 個(gè)靶點(diǎn)相關(guān),其中POMC、SST、TAC1、SLC6A4、HTR3A、SLC6A3、HTR1A 等蛋白交互作用相對(duì)較強(qiáng)。POMC 基因編碼一種前蛋白,這種前蛋白經(jīng)過(guò)加工可產(chǎn)生多種生物活性肽,如促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotropin hormone, ACTH)、β-內(nèi)啡肽(鎮(zhèn)痛物質(zhì))和促黑激素等,這些活性肽在許多重要的信號(hào)通路中參與。同時(shí)POMC 的異常表達(dá)還與抑郁癥、雙相情感障礙等精神心理疾病密切相關(guān)[17]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,胃黏膜應(yīng)激性損傷會(huì)伴隨ACTH、β-內(nèi)啡肽的升高,而藥物干預(yù)可減輕粘膜損傷程度,同時(shí)使ACTH、β-內(nèi)啡肽水平降低[18-19]。促黑激素則被證明可通過(guò)促進(jìn)SS 表達(dá)對(duì)乙醇誘導(dǎo)的大鼠胃潰瘍產(chǎn)生保護(hù)作用[20]。以上實(shí)驗(yàn)均體現(xiàn)了POMC 下游產(chǎn)物對(duì)胃潰瘍的影響,但目前仍缺乏對(duì)POMC 于胃潰瘍聯(lián)系的直接探究。SST 的表達(dá)產(chǎn)生SS,在結(jié)合高親和力G 蛋白偶聯(lián)的SS 受體后,可抑制多種次級(jí)激素的釋放;與胃腸道大多數(shù)的激素存在相互作用,從而抑制胃消化間期肌電復(fù)合波和胃排空、抑制回腸和膽囊收縮、抑制腸道內(nèi)容物轉(zhuǎn)運(yùn)[21]。若SST 表達(dá)受到抑制,SS 分泌減少會(huì)使胃酸分泌增加、胃十二指腸黏膜的防御功能降低,從而增加了消化性潰瘍的發(fā)生幾率[22]。研究發(fā)現(xiàn)針刺可通過(guò)提高SS 水平來(lái)達(dá)到促進(jìn)胃潰瘍恢復(fù)的目的[14]。TAC1編碼速激肽激素家族的4 種產(chǎn)物,SP、神經(jīng)激肽A、神經(jīng)肽K 和神經(jīng)肽γ。這些神經(jīng)遞質(zhì)可與神經(jīng)受體和平滑肌細(xì)胞作用,起到血管擴(kuò)張劑和促分泌劑的作用。研究發(fā)現(xiàn)SP 可以通過(guò)調(diào)節(jié)Akt/eNOS/NO 信號(hào)通路,避免炎癥損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞[23]。大量研究結(jié)果表明,SP 可以顯著促進(jìn)傷口愈合,對(duì)慢性傷口也有較好的效果[24]。而在結(jié)構(gòu)上,SP 與天然抗菌肽結(jié)構(gòu)相似[25],可能對(duì)幽門(mén)螺旋桿菌感染起到一定的防御作用,但目前尚無(wú)實(shí)驗(yàn)研究其對(duì)幽門(mén)螺旋桿菌抗菌活性的強(qiáng)弱。與此同時(shí),腦下行的和脊髓固有的SP 神經(jīng)元釋放阿片肽后,可以起到鎮(zhèn)痛作用[26]。由此可見(jiàn),TAC1 的表達(dá)可從病因、病理機(jī)制和癥狀3 個(gè)方面對(duì)胃潰瘍起到治療作用。SLC6A4、SLC6A3、HTR3A、HTR1A 均是5-HT 相關(guān)的基因。研究發(fā)現(xiàn)5-HT 信號(hào)系統(tǒng)在胃腸道功能性疾病中扮演了重要角色,該信號(hào)通路的異常可引發(fā)胃腸道動(dòng)力及分泌功能異常和內(nèi)臟高敏感性[27]。此外,這些基因的異常表達(dá)還常見(jiàn)于精神、心理疾病。總的來(lái)說(shuō),這些基因聯(lián)系緊密,在針刺促進(jìn)胃潰瘍修復(fù)的進(jìn)程中相互影響,但目前的研究多著眼于單個(gè)基因某個(gè)下游產(chǎn)物對(duì)胃潰瘍的作用機(jī)制,未針對(duì)全部下游產(chǎn)物逐個(gè)挖掘,且缺乏胃潰瘍修復(fù)過(guò)程中多基因協(xié)作機(jī)制的研究。

GO 分析結(jié)果表明,針刺治療胃潰瘍的作用機(jī)制是多靶點(diǎn)、多層次的,由多種生物學(xué)過(guò)程共同參與而成,KEGG 通路分析結(jié)果將靶點(diǎn)富集的生物過(guò)程展示出來(lái)。首先,BP 層面涉及G 蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路、平滑肌收縮,這與Ca2﹢信號(hào)通路密切相關(guān)。興奮-收縮偶聯(lián)時(shí),膜去極化誘導(dǎo)電壓門(mén)控Ca2﹢通道打開(kāi),胞內(nèi)Ca2﹢濃度增加,激活RyR 開(kāi)放,觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)局部釋放Ca2﹢,導(dǎo)致肌肉收縮[28]。SERCA 是存在于肌漿網(wǎng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,主要功能是將胞漿內(nèi)的Ca2﹢轉(zhuǎn)運(yùn)到肌漿網(wǎng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,維持細(xì)胞內(nèi)的Ca2﹢穩(wěn)態(tài)[29]。針刺可以通過(guò)促進(jìn)GPCR 的表達(dá),增加PLN 磷酸化,減少PLN 對(duì)SERCA 的抑制,促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)攝取Ca2﹢,胞質(zhì)中Ca2﹢濃度下降,促進(jìn)肌肉舒張;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2﹢儲(chǔ)存量增加,可進(jìn)一步激活RyR 開(kāi)放,促進(jìn)肌肉收縮。PKA 是抗抑郁藥物的靶點(diǎn)之一,抗抑郁藥物可以通過(guò)增強(qiáng)大腦特定部位PKA 的活力來(lái)達(dá)到治療目的[30]。如圖6,GPCR 載體在GPCR-cAMP-PKA 信號(hào)通路中也起到了作用,ATCH 和SST均可以作用于GPCR,從而起到上調(diào)PKA 表達(dá)的作用,現(xiàn)代研究結(jié)果提示電針可以通過(guò)該通路起到抗抑郁的作用[31]。在GO-CC 層面涉及神經(jīng)元胞體、突觸后膜整體成分,其中KEGG 結(jié)果提示,5-HT 能突觸起到重要作用。針刺產(chǎn)生的活性物質(zhì)5-HT 可以通過(guò)激活膠質(zhì)細(xì)胞上的5-HT2A和SERT 促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放Ca2﹢、促進(jìn)胞外Ca2﹢內(nèi)流,提高胞內(nèi)Ca2﹢水平,從而促進(jìn)平滑肌收縮。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),5-HT 收縮胃底平滑肌與PKC 有關(guān),這與KEGG 富集結(jié)果也是一致的[32]。此外5-HT 還可以激活5-HT4,6,7通路,通過(guò)AC5 上調(diào)cAMP 通路,起到調(diào)整抑郁狀態(tài)的作用。

綜上,本研究預(yù)測(cè)針灸可能通過(guò)POMC、SST、TAC1、SLC6A4、HTR3A 等關(guān)鍵靶點(diǎn)來(lái)調(diào)節(jié)cAMP 信號(hào)通路、鈣離子信號(hào)通路、5-HT 能突觸等,從而促進(jìn)平滑肌收縮、保護(hù)血管內(nèi)皮、防御幽門(mén)螺旋桿菌、鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)抑郁狀態(tài),從緩解癥狀、促進(jìn)愈合、去除誘發(fā)因素等不同層面達(dá)到治療胃潰瘍的目的。大量現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),不良情緒與消化道疾病關(guān)系密切[33]。通過(guò)本次研究可推測(cè),針刺治療伴發(fā)情緒障礙的胃潰瘍可取得較好的療效,而改善患者情緒也可以起到預(yù)防胃潰瘍等消化道疾病復(fù)發(fā)的作用。

本研究只納入了針刺治療后人體產(chǎn)生的6 種具有代表性的活性物質(zhì),其他活性物質(zhì)仍需進(jìn)一步數(shù)據(jù)挖掘和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,未對(duì)針灸處方、治療時(shí)長(zhǎng)和頻率等針灸治療的重要參數(shù)進(jìn)行分析,并缺乏對(duì)研究結(jié)果的驗(yàn)證。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,人體自身是一個(gè)有機(jī)整體。針刺可以通過(guò)穴位刺激,多靶點(diǎn)、多層次地調(diào)控人體網(wǎng)絡(luò),從而起到治療作用。筆者基于文獻(xiàn)研究,借助生物信息學(xué)和網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)方法,研究針刺治療胃潰瘍的生物學(xué)機(jī)制,為針刺治療胃潰瘍的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究提供了理論依據(jù)。