李 巧，王宇昊，夏一凡，張玉東*

1南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院放射科，2泌尿外科，江蘇 南京 210029

透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）是腎細(xì)胞癌最常見(jiàn)的類(lèi)型［1-2］，相比乳頭狀和嫌色細(xì)胞亞型，更容易進(jìn)展、轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差［3-4］?；颊郀顟B(tài)、腫瘤分期、細(xì)胞核分級(jí)等是臨床實(shí)踐中常用的預(yù)后指標(biāo)。然而，隨著ccRCC 個(gè)體化治療的不斷發(fā)展，特別是晚期腎癌，免疫治療僅對(duì)20%～30%的患者有效，目前尚無(wú)有效靶標(biāo)對(duì)患者進(jìn)行篩選和療效預(yù)測(cè)［5］。

腫瘤微環(huán)境包括細(xì)胞外基質(zhì)、可溶性分子和腫瘤基質(zhì)細(xì)胞，對(duì)腫瘤患者的免疫治療療效及預(yù)后影響重大［6-7］。腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutational burden，TMB）即每個(gè)腫瘤基因組編碼區(qū)域的突變總數(shù)，是免疫治療的生物標(biāo)志物，TMB越高的腫瘤患者免疫治療效果往往越好［8-9］。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability，MSI）即重復(fù)DNA 束中核苷酸的自發(fā)丟失或獲得，可以輔助診斷胃腸道、子宮內(nèi)膜和結(jié)直腸腫瘤的表型，為各種癌癥提供治療決策信息［10-11］。基于機(jī)器學(xué)習(xí)（machine learning，ML）的CT影像組學(xué)分析可捕獲肉眼無(wú)法識(shí)別的圖像特征，并揭示病理生理相關(guān)的潛在生物醫(yī)學(xué)圖像變化，預(yù)測(cè)治療反應(yīng)和生存期［11-13］。

因此，本研究利用集成ML算法，將ccRCC影像組學(xué)特征與腫瘤免疫微環(huán)境表達(dá)相關(guān)聯(lián)，建立多模通道的免疫影像（immuno-radiomics，ImRad）分型，并進(jìn)一步研究該表型對(duì)患者術(shù)后生存的預(yù)測(cè)價(jià)值。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象

納入南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院經(jīng)手術(shù)病理證實(shí)為ccRCC、術(shù)前行腎臟CT增強(qiáng)掃描且具有完整臨床病理及免疫基因資料的患者113 例。其中，男77 例，女36例，年齡（59.4±12.9）歲（26～88歲）；AJCC分期68.1%為T(mén)1～2 期，31.9%為T(mén)3～4 期；41.6%為低級(jí)別細(xì)胞核分級(jí)，58.4%為高級(jí)別。113例患者均有標(biāo)準(zhǔn)隨訪結(jié)果，隨訪內(nèi)容包括治療后有無(wú)復(fù)發(fā)及總生存時(shí)間（overall survival，OS），隨訪時(shí)間為1～86 個(gè)月，刪失病例OS 按最長(zhǎng)隨訪時(shí)間計(jì)算。中位OS 為31（10～54）個(gè)月。

患者臨床、影像數(shù)據(jù)從公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)癌癥影像檔案（the cancer imaging archive，TCIA）下載（http：//www.cancerimagingarchive.net），對(duì)應(yīng)免疫、基因數(shù)據(jù)從癌癥基因圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）庫(kù)中獲得（https：//portal.gdc.cancer.gov）［14］。利用癌癥樣本轉(zhuǎn)錄譜的特性來(lái)推斷腫瘤細(xì)胞以及浸潤(rùn)的各種正常細(xì)胞含量，獲得3 個(gè)CD8+T 浸潤(rùn)評(píng)分、TMB、MSI、4 種免疫耗竭相關(guān)基因（LAG3、CD244、PDCD1及TIGIT）［15］以及21 種免疫細(xì)胞得分（使用R 語(yǔ)言estimate 包中的ESTIMATE 算法），根據(jù)得分中位數(shù)分為高、低表達(dá)兩組。

1.2 方法

1.2.1 CT圖像勾畫(huà)和特征提取

使用國(guó)內(nèi)開(kāi)發(fā)的軟件SRhythm Multi Label 和Oncology Imaging Analysis（OCIA，上海師范大學(xué)上海磁共振重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室），分別由1名具有3年腹部影像診斷經(jīng)驗(yàn)的放射科醫(yī)師和1名具有6年臨床手術(shù)經(jīng)驗(yàn)的泌尿外科醫(yī)生在CT 皮質(zhì)期軸位圖像上對(duì)病灶邊緣進(jìn)行逐層勾畫(huà)，然后融合成三維感興趣區(qū)（region of interest，ROI）；每一次勾畫(huà)均由另1 名具有15 年腹部影像診斷經(jīng)驗(yàn)的放射科醫(yī)師進(jìn)行校對(duì)。校準(zhǔn)完畢后利用Pyradiomics 軟件包提取腫瘤影像組學(xué)特征，包括14 個(gè)形狀特征、18 個(gè)一階直方圖特征以及75個(gè)紋理特征、24個(gè)灰度共生矩陣（gray level co-occurrence matrix，GLCM）特征、16個(gè)灰度游程矩陣（gray level run-length matrix，GLRLM）特征、16 個(gè)灰度區(qū)域大小矩陣（gray level size zone matrix，GLSZM）特征、5 個(gè)鄰域灰度差分矩陣（neighborhood gray-tone difference matrix，NGTDM）特征、14個(gè)灰度相關(guān)矩陣（gray level dependence matrix，GLDM）特征［16］。

1.2.2 模型構(gòu)建

構(gòu)建腫瘤ImRad：①降維及特征篩選?？紤]高維數(shù)據(jù)ML 建模產(chǎn)生的過(guò)擬合風(fēng)險(xiǎn)，首先采用4種特征篩選算法，即信息增益（information gain，Info.gain）、增益率（gain ratio）、基尼系數(shù)下降（gini decrease，Gini）、快速相關(guān)濾波器（fast correlation based filter，F(xiàn)CBF），分別對(duì)影像組學(xué)特征降維篩選。②集成ML 建模。利用隨機(jī)森林（random forest，RF）、梯度增強(qiáng)（gradient boosting，GDBT）、邏輯回歸（logistic regression，LR）、支持向量機(jī)（support vector machines，SVM）、樸素貝葉斯（naive bayes，NB）、k 最近鄰（k-nearest neighbor，kNN）、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（neural network，NN）及堆疊式集成學(xué)習(xí)（stacking learning）8 種算法在經(jīng)篩選后的20 個(gè)組學(xué)特征上建立二分類(lèi)預(yù)測(cè)模型［17］，預(yù)測(cè)目標(biāo)包含3個(gè)CD8+T浸潤(rùn)評(píng)分、1個(gè)TMB 表達(dá)、1 個(gè)MSI 表達(dá)、4 個(gè)免疫耗竭相關(guān)基因及21 種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)表達(dá)結(jié)果，共建立30 個(gè)ImRad表型。多種分類(lèi)器算法的消融實(shí)驗(yàn)以獲得最優(yōu)算法，五折法用于小樣本數(shù)據(jù)下模型的準(zhǔn)確性驗(yàn)證。

生存分析：納入指標(biāo)包括患者性別、年齡、AJCC TNM 分期、細(xì)胞核分化程度、ImRad分型、3個(gè)CD8+T浸潤(rùn)評(píng)分、TMB、MSI、4種免疫耗竭關(guān)鍵基因及21種免疫細(xì)胞表達(dá)。對(duì)于維度較多的臨床-病理-免疫影像（clinicopathologic-immuno-radiomics，Clinic-Pt-ImRad）融合模型，利用Lasso-Cox 回歸將不相關(guān)特征的回歸系數(shù)縮小到零，得到系數(shù)不為零的特征。使用最大相關(guān)最小冗余法（mRMRe）基于有無(wú)腫瘤復(fù)發(fā)對(duì)851個(gè)組學(xué)特征進(jìn)行降維，獲取30個(gè)關(guān)鍵特征構(gòu)建影像組學(xué)（radiomics，Rad）預(yù)后模型。

進(jìn)一步多因素Cox 回歸分析，最終構(gòu)建如下預(yù)后模型：①Rad 及ImRad 模型；②臨床-病理-免疫（clinicopathologic immune，Clinic-Pt-Im）模型；③Clinic-Pt-ImRad模型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線和ROC 曲線下面積（area under curve，AUC）評(píng)價(jià)分類(lèi)器效能。多因素Cox回歸分析計(jì)算各模型中預(yù)測(cè)因子高、低表達(dá)組間OS的風(fēng)險(xiǎn)比（hazards ratio，HR）及其95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）。C-index 評(píng)價(jià)模型預(yù)測(cè)效能。采用Kaplan-Meier 生存曲線分析獨(dú)立預(yù)測(cè)因子的生存影響并進(jìn)行Log-Rank 檢驗(yàn)。采用SPSS 26、R3.6.1 和MeCalc19.9.4 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。雙尾P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ImRad免疫影像表型構(gòu)建

在兩步驟算法的32 種組合中（4 種特征篩選×8 種ML 分類(lèi)器算法），NB 算法較其他分類(lèi)器建模有更好的分類(lèi)效能（AUC：0.717～0.956，表1）。基于NB 算法構(gòu)建的ImRad 表型能夠有效監(jiān)測(cè)腫瘤組織記憶B 細(xì)胞（AUC=0.954）、靜息態(tài)記憶CD4+T 細(xì)胞（AUC=0.942）、激活態(tài)自然殺傷細(xì)胞（AUC=0.931）、嗜酸性粒細(xì)胞（AUC=0.956）和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（AUC=0.908）浸潤(rùn)（P＜0.05）。

表1 集成機(jī)器學(xué)習(xí)構(gòu)建免疫影像ImRad表型及其AUCTable 1 ImRad and AUC constructed by ensemble machine learning algorithms

2.2 多模組學(xué)融合預(yù)測(cè)OS效能

分別對(duì)比分析Rad、ImRad、Clinic-Pt-Im、Clinic-Pt-ImRad對(duì)OS的預(yù)測(cè)效能。

采用梯度提升樹(shù)算法（gradient boosting machine，GBM-Cox）對(duì)Rad 預(yù)測(cè)因子建模，獲取1 年、3 年、5 年OS 的校準(zhǔn)曲線圖（圖1）。30 個(gè)經(jīng)mRMRe降維后的關(guān)鍵Rad特征中，wavelet-LLL_glcm_Imc1、wavelet -LHL_ngtdm_Strength、wavelet_HHH_glrlm_Long Run Low Gray Level Emphasis為獨(dú)立預(yù)測(cè)因子（表2），Rad模型預(yù)測(cè)OS的C-index為0.756（95%CI：0.636～0.876）。

圖1 Rad模型預(yù)測(cè)1年、3年、5年生存期的校準(zhǔn)曲線圖Figure 1 Calibration curve of Rad on predicting 1-year，3-year，5-year survival period

表2 Rad、ImRad及Clinc-Pt-Im模型多因素Cox分析Table 2 Multivariate Cox analysis of Rad，ImRad and Clinc-Pt-Im models

30 個(gè)基于獨(dú)立預(yù)測(cè)因子建立ImRad 預(yù)后指數(shù)（表2，圖2A），其預(yù)測(cè)OS的C-index為0.857（95%CI：0.787～0.927），優(yōu)于Rad 模型。Clinic-Pt-Im 指標(biāo)中，AJCC 分期、TMB、初始B細(xì)胞等11個(gè)指標(biāo)是患者OS的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，Clinic-Pt-Im模型預(yù)測(cè)OS的C-index為0.924（95%CI：0.872～0.976），優(yōu)于Rad 和ImRad（表2，圖2B）。

圖2 ImRad（A）、Clinic-Pt-Im（B）和Clinic-Pt-ImRad（C）的森林圖Figure 2 Forest maps of ImRad（A），Clinic-Pt-Im（B），and Clinic-Pt-ImRad（C）models

融合模型Clinic-Pt-ImRad 預(yù)測(cè)OS的C-index 為0.938（95%CI：0.902～0.974），優(yōu)于Rad、ImRad 和Clinic-Pt-Im模型（表3，圖2C）。

表3 Clinic-Pt-ImRad的LASSO-Cox回歸模型Table 3 LASSO-Cox regression of Clinic-Pt-ImRad model

各獨(dú)立預(yù)測(cè)因子的生存分析中，Rad-靜息態(tài)樹(shù)突狀細(xì)胞、Rad-激活態(tài)肥大細(xì)胞及Rad-M1巨噬細(xì)胞3個(gè)免疫影像特征的Kaplan-Meier曲線在高、低表達(dá)組間存在顯著差異（P＜0.05）。AJCC分期越早預(yù)后越好；激活態(tài)肥大細(xì)胞及MSI 高表達(dá)均提示預(yù)后不佳，而靜息態(tài)樹(shù)突狀細(xì)胞高浸潤(rùn)提示預(yù)后良好，其高、低表達(dá)組間生存曲線均存在顯著差異（P＜0.05，圖3）。

圖3 部分獨(dú)立預(yù)測(cè)因子的Kaplan-Meier生存曲線Figure 3 Kaplan-Meier survival curves of partial independent predictors

3 討論

ccRCC 多位于腎皮質(zhì)，單發(fā)多見(jiàn)，通常大小不一，圓形或橢圓形，和周?chē)I實(shí)質(zhì)分界較清晰，可有假包膜，常有鈣化、出血、壞死及囊變。顯微鏡下腫瘤細(xì)胞體積較大，圓形或多邊形，胞質(zhì)豐富，透明或顆粒狀，間質(zhì)具有豐富的毛細(xì)血管和血竇。CT平掃表現(xiàn)主要取決于腫瘤本身的成分和血供的差異，以及腫瘤內(nèi)有無(wú)出血、壞死、囊變、鈣化等。通常CT平掃時(shí)密度與周?chē)I實(shí)質(zhì)呈等或略低密度，體積較小的腫瘤密度多均勻，而體積較大者密度多不均勻，與瘤體內(nèi)容易出血有關(guān)。絕大多數(shù)ccRCC 為富血供腫瘤，增強(qiáng)掃描動(dòng)脈期多明顯不均勻或條紋狀強(qiáng)化，強(qiáng)化程度多與鄰近腎皮質(zhì)相仿，甚至略高，靜脈期及延遲期強(qiáng)化程度較周?chē)I實(shí)質(zhì)減低，多呈“快進(jìn)快出”的特點(diǎn)。病理研究顯示其早期高強(qiáng)化與透明細(xì)胞的小泡狀結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。本研究基于CT 增強(qiáng)圖像及集成ML 構(gòu)建ccRCC 的免疫影像表型，并探討其對(duì)患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值。

目前基于全腫瘤影像組學(xué)特征分析主要用于腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性研究［12］，而本研究通過(guò)集成ML 及全腫瘤ROI 影像組學(xué)特征分析，構(gòu)建ccRCC 的多重免疫影像分型，在技術(shù)方法及臨床應(yīng)用方面具有一定探索性。本研究通過(guò)影像-免疫關(guān)聯(lián)，構(gòu)建了30個(gè)ImRad 免疫影像分型，其中8 個(gè)ImRad 分型與患者OS獨(dú)立相關(guān)，基于ImRad分型構(gòu)建的Cox模型對(duì)OS的預(yù)測(cè)效能優(yōu)于傳統(tǒng)方法。而且發(fā)現(xiàn)Rad-靜息態(tài)樹(shù)突狀細(xì)胞、Rad-M1巨噬細(xì)胞及Rad-激活態(tài)肥大細(xì)胞3個(gè)ImRad標(biāo)志物表達(dá)水平不同，其OS存在顯著差異，提示免疫影像分型對(duì)患者臨床預(yù)后具有較好的預(yù)測(cè)價(jià)值，從而為優(yōu)化臨床治療方案提供重要參考依據(jù)。

與既往研究對(duì)比，本研究有以下創(chuàng)新：首先，通過(guò)泌尿?qū)I(yè)及影像專(zhuān)業(yè)醫(yī)生雙盲參與腫瘤ROI 勾畫(huà)，對(duì)于形態(tài)不規(guī)則的腫瘤，結(jié)合臨床和影像的經(jīng)驗(yàn)，如強(qiáng)化環(huán)、腫瘤包膜隆突等，從而提高勾畫(huà)精準(zhǔn)性，并由經(jīng)驗(yàn)更豐富的高年資醫(yī)師進(jìn)行校準(zhǔn)。其次，本研究在技術(shù)上進(jìn)行了多重算法對(duì)比及集成，并通過(guò)消融實(shí)驗(yàn)獲得最優(yōu)參數(shù)配置，提升了模型的魯棒性，五折法用于小樣本數(shù)據(jù)模型的準(zhǔn)確性驗(yàn)證，所構(gòu)建的30 個(gè)ImRad 分型中，基于貝葉斯算法的模型表現(xiàn)最佳，在多重驗(yàn)證中均取得比較可靠的結(jié)果。另外，在Cox 回歸分析中，通過(guò)Rad、ImRad、Clinic-Pt-Im 以及Clinic-Pt-ImRad 多重對(duì)比，證實(shí)基于影像免疫關(guān)聯(lián)的ImRad 模型優(yōu)于單純Rad 模型，Clinic-Pt-ImRad 優(yōu)于Clinic-Pt-Im 模型。該結(jié)果提示，多重免疫與高通量影像特征具有微觀-宏觀上的關(guān)聯(lián)性，通過(guò)構(gòu)建免疫影像分型，有望為臨床提供一種可靠的無(wú)創(chuàng)性影像檢查方法來(lái)預(yù)測(cè)腫瘤免疫微環(huán)境狀態(tài)，從而為提高患者免疫治療效果提供可靠依據(jù)。以往研究發(fā)現(xiàn)TMB 可用于預(yù)測(cè)肺癌、膀胱癌、黑色素瘤及結(jié)直腸癌等實(shí)體腫瘤的免疫治療療效［18］，MSI 決定了胃腸癌患者對(duì)免疫治療的反應(yīng)［10-11］，筆者首次將TMB 和MSI 應(yīng)用于ccRCC 中，其對(duì)患者術(shù)后預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值在Clinic-Pt-Im 和Clinic-Pt-ImRad 模型中均得到驗(yàn)證，高M(jìn)SI 和TMB預(yù)示著復(fù)發(fā)死亡風(fēng)險(xiǎn)更高，集成ML 構(gòu)建Rad-TMB和Rad-MSI的AUC、精確度及準(zhǔn)確度均＞0.70，揭示腫瘤TMB 及MSI 表型與影像組學(xué)特征具有一定關(guān)聯(lián)性。

同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)，高AJCC 分期（Ⅲ和Ⅳ）是不良預(yù)后的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素，這與既往研究一致［3-4］。另外對(duì)CD8+T 細(xì)胞浸潤(rùn)的3 個(gè)關(guān)鍵評(píng)分分析，發(fā)現(xiàn)高Rad-腫瘤基質(zhì)評(píng)分及腫瘤純度評(píng)分提示預(yù)后良好，可能因?yàn)槊庖哐装Y型（具有密集的CD8+T 細(xì)胞浸潤(rùn)）腫瘤免疫微環(huán)境具有較好的免疫原性和對(duì)免疫治療的應(yīng)答性，從而提高患者遠(yuǎn)期生存率［19］。21種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)表達(dá)及其ImRad 分型中，Rad-靜息態(tài)樹(shù)突狀細(xì)胞及靜息態(tài)樹(shù)突狀細(xì)胞浸潤(rùn)均提示預(yù)后良好，其OS曲線在高、低表達(dá)組間均存在顯著差異；Rad-M1 巨噬細(xì)胞及M1 巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)提示預(yù)后良好，Rad-M1 巨噬細(xì)胞的生存曲線在高、低表達(dá)組間存在顯著差異，說(shuō)明影像免疫分型有預(yù)測(cè)免疫細(xì)胞活性的能力；Rad-漿細(xì)胞高表達(dá)提示預(yù)后良好，但漿細(xì)胞浸潤(rùn)預(yù)后不良，這可能與小樣本數(shù)據(jù)分布不均有關(guān)；高Rad-激活態(tài)肥大細(xì)胞及激活態(tài)肥大細(xì)胞患者預(yù)后不良，其生存曲線高、低表達(dá)組間均存在顯著差異；高Rad-嗜酸性粒細(xì)胞表達(dá)的患者預(yù)后不良，高Rad-激活態(tài)樹(shù)突狀細(xì)胞的患者預(yù)后良好而激活態(tài)樹(shù)突狀細(xì)胞浸潤(rùn)對(duì)預(yù)后無(wú)影響，既往研究表明嗜酸性粒細(xì)胞同時(shí)有促腫瘤和抗腫瘤功能［20］，但具體截?cái)嘀涤写M(jìn)一步研究。樹(shù)突狀細(xì)胞介導(dǎo)的抗原特異性T細(xì)胞抗癌免疫治療在臨床上取得了巨大成功［21］。另外，靜息態(tài)自然殺傷細(xì)胞、M0巨噬細(xì)胞、M2 巨噬細(xì)胞高表達(dá)是預(yù)后良好的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。4 種免疫耗竭關(guān)鍵基因中（LAG3、CD244、PDCD1、TIGIT），Rad-PDCD1 是ccRCC 患者術(shù)后復(fù)發(fā)死亡的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，高Rad-PDCD1表達(dá)預(yù)后良好，這與Miao 等［22］研究結(jié)果稍有不同，兩組結(jié)果差異的原因有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量研究。

本研究存在局限性，第一，來(lái)自公共數(shù)據(jù)集的圖像質(zhì)量存在較大差異，掃描參數(shù)不盡相同，這可能會(huì)影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。第二，本研究是回顧性研究，存在樣本選擇偏倚的風(fēng)險(xiǎn)。第三，研究樣本量有限，將113例ccRCC進(jìn)行五折交叉驗(yàn)證以保證預(yù)測(cè)模型的過(guò)擬合風(fēng)險(xiǎn)，準(zhǔn)確性及可重復(fù)性需要在獨(dú)立驗(yàn)證集中進(jìn)一步評(píng)估。此外，陽(yáng)性表達(dá)記憶B細(xì)胞、漿細(xì)胞、靜息態(tài)記憶CD4+T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、激活態(tài)自然殺傷細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的患者數(shù)量較少，可能會(huì)導(dǎo)致測(cè)量偏倚，這也是其他組學(xué)研究中常面臨的技術(shù)問(wèn)題［23］。因此，在臨床應(yīng)用之前，基于有限數(shù)據(jù)集的研究結(jié)果需要通過(guò)多中心和大規(guī)模的研究進(jìn)行前瞻性驗(yàn)證。

總之，本研究通過(guò)影像-免疫表達(dá)關(guān)聯(lián)，證實(shí)增強(qiáng)CT 影像組學(xué)特征在預(yù)測(cè)ccRCC 患者的腫瘤免疫微環(huán)境和TMB方面具有良好的臨床應(yīng)用潛力，構(gòu)建的ImRad免疫影像分型可用于ccRCC患者的術(shù)后生存預(yù)測(cè)，將有助于臨床醫(yī)生對(duì)ccRCC 患者進(jìn)行更好的風(fēng)險(xiǎn)分層和臨床治療。