曹 輝，余 正，范一純，林雨欣，王 軍，高 蓉，蔣 雷

1南京市棲霞區(qū)疾病預(yù)防控制中心檢驗科，江蘇 南京 210046；2南京醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生檢驗學(xué)系，3衛(wèi)生毒理學(xué)系，江蘇 南京 211166；4南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)中心，江蘇 南京 210029

雙酚A（bisphenol A，BPA）在工業(yè)上被廣泛用來合成聚碳酸酯和環(huán)氧樹脂等材料，隨著BPA毒性被不斷揭示、相關(guān)不良事件被曝光，全球許多國家和地區(qū)紛紛出臺法律法規(guī)限制BPA的使用［1］。為應(yīng)對監(jiān)管措施，近年來一些雙酚類化合物（bisphenol，BP），如雙酚F（bisphenol F，BPF）、雙酚S（bisphenol S，BPS）和雙酚AF（bisphenol AF，BPAF）作為BPA的替代品逐漸被大量生產(chǎn)和使用［2］，因此，其安全性的研究尤為重要。近年來，作為最廣泛使用的BPA替代物BPF，其潛在的健康危害逐漸被人們認識。研究顯示，BPF具有典型的內(nèi)分泌干擾作用，不僅可引起胰島素分泌異常，引發(fā)外周胰島素抵抗，導(dǎo)致非酒精性脂肪肝樣改變［3］，同時亦可產(chǎn)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性，引起認知損傷［4］。這些結(jié)果為外周系統(tǒng)紊亂引發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷提供了合理解釋。近年來，環(huán)境內(nèi)分泌干擾物暴露與精神性疾病發(fā)生的關(guān)聯(lián)引發(fā)了人們的高度關(guān)注，既往研究顯示，BPA 暴露可引發(fā)抑郁樣改變［5］，但其機制仍不清楚。因而，基于BPF與BPA結(jié)構(gòu)的相似性，本研究系統(tǒng)探討了肝臟這一最大的外周代謝器官在BPF 暴露后神經(jīng)遞質(zhì)代謝的改變情況，以期為后續(xù)可能引發(fā)的精神性及肝臟性疾病提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

SPF 級C57BL/6J 雄性小鼠（6 周齡）購自南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)藥實驗動物中心。小鼠在具有適宜溫度（22±1）℃與濕度（55±5）%的屏障環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)，光照12 h，黑暗12 h，并自由進食、進水。適應(yīng)1 周后，行BPF 灌胃染毒，分為對照組和40、400、4 000 μg/（kg·d）BPF 處理組，每組8 只，連續(xù)灌胃30 d 后，取其肝臟，進行后續(xù)檢測。

色氨酸（tryptophan，TRP）、5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、3-羥基犬尿氨酸（3-hydroxycaninuric acid，3-HK）、3-羥基鄰氨基苯甲酸（3-hydroxyanthranilic acid，3-HAA）、5-羥基吲哚乙酸（5-hydroxyindoleacetic acid，5-HIAA）、N-乙酰-5-羥色胺（N-acetyl serotonin，NAS）、褪黑素（melatonin，MLT）、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）、谷氨酸（glutamate，GLU）、甘氨酸（glycine，GLY）、酪氨酸（tyrosine，TYR）、左旋多巴（levodopa，L-DOPA）、去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）、腎上腺素（adrenaline，E）、高香草酸（homovanillic acid，HVA）、3，4-二羥基3-苯乙酸（3，4-dihydroxyphenylacetic acid，DOPAC）、3-甲氧基-4-羥苯乙二醇（3-methoxy-4-hydroxyphenylglycol，MHPG）、犬尿氨酸（kynurenine，KYN）、天冬氨酸（aspartic acid，ASP）等標準品（Sigma Aldich 公司，美國），丹磺酰氯（Tokyo Chemical Industry 公司，日本）。Ultimate 3000超高效液相色譜儀系統(tǒng)、Q Exac-tive 四級桿軌道阱高分辨質(zhì)譜儀（賽默飛世爾科技公司，美國），低溫離心濃縮富集系統(tǒng)（Labconco公司，美國），組織研磨儀TissueLyser Ⅱ（Dusseldorf 公司，德國），生物樣品均質(zhì)儀（杭州奧盛），微量加樣器（RAININ公司，瑞士）。

1.2 方法

1.2.1 樣本前處理與檢測

稱取約10 mg 肝臟樣本于1.5 mL 離心管中，加入500 μL 冰萃取液（甲醇∶水體積比為3∶1），50 μL混合內(nèi)標溶液及不銹鋼珠（直徑=3 mm），于組織勻漿儀TissueLyser Ⅱ中進行均質(zhì)化，持續(xù)15 min，重復(fù)2 次，加入50 μL 混合內(nèi)標溶液和400 μL 甲醇，渦旋1 min 后18 000 r/min、4 ℃高速離心10 min，充分沉淀蛋白。后將上清轉(zhuǎn)移至另一1.5 mL 離心管中并置于低溫真空離心濃縮富集系統(tǒng)中揮干。揮干后加入50 μL 丹磺酰氯溶液（2 mg/mL，溶于丙酮）和50 μL 碳酸氫鈉溶液（pH=11、2 mol/L），充分渦旋后置于60 ℃水浴鍋中進行衍生化反應(yīng)8 min，隨后18 000 r/min、4 ℃高速離心10 min，取60 μL 上清液于棕色進樣小瓶中，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra-high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UHPLC-MS/MS）檢測時進樣量為5 μL。

1.2.2 色譜與質(zhì)譜儀器檢測條件

儀器檢測系統(tǒng)由Ultimate 3000超高效液相色譜儀串聯(lián)Q Exactive四級桿軌道阱高分辨質(zhì)譜儀組成，選用Acquity BEH-C18 色譜柱（100.0 mm×2.1 mm，1.7 μm），柱溫為35 ℃。使用流動相A（乙腈+0.1%甲酸）和B（水+0.1%甲酸）進行梯度洗脫，流速為0.25 mL/min。質(zhì)譜采用加熱電噴霧電離源進行離子化，利用平行反應(yīng)監(jiān)測模式進行定量分析。儀器控制、數(shù)據(jù)采集與分析使用XCalibur 2.2。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 20.0 軟件進行實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析，GraphPad Prism 7.0進行統(tǒng)計圖的繪制。符合正態(tài)分布的定量資料表示為均數(shù)±標準差（）。多組間定量資料比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用LSD 法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BPF 暴露對小鼠肝臟TRP 來源5-HT 途徑神經(jīng)遞質(zhì)代謝的影響

5-HT代謝是TRP代謝的重要通路，其紊亂可導(dǎo)致外周及中樞多種疾病的發(fā)生［6-7］。不同濃度的BPF［0、40、400、4 000 μg/（kg·d）］暴露后，與對照組比較，低、中、高濃度BPF暴露組小鼠肝臟中的TRP濃度均顯著下降；進一步檢測其下游代謝產(chǎn)物5-HT，發(fā)現(xiàn)低濃度BPF暴露組中5-HT顯著下降，中濃度BPF暴露組5-HT 有下降的趨勢，但未呈現(xiàn)明顯差異；對5-HT 下游代謝產(chǎn)物深入探討，發(fā)現(xiàn)與對照組比較，BPF 暴露組5-HIAA、NAS、MLT 等5-HT 代謝產(chǎn)物差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（圖1）。

圖1 不同濃度BPF暴露對小鼠肝臟中5-HT代謝途徑的影響Figure 1 Effects of BPF exposure with varied concentrations on hepatic 5-HT metabolic pathway

2.2 BPF 暴露對小鼠肝臟TRP 來源KYN 途徑神經(jīng)遞質(zhì)代謝的影響

進一步，對TRP另一關(guān)鍵代謝通路KYN進行檢測［8］，結(jié)果顯示，與對照組比較，KYN 在BPF 暴露后明顯上升，且隨BPF 暴露水平的增高而升高。對其下游代謝產(chǎn)物深入分析發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，盡管BPF 暴露組3-HK 及3-HAA 的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但有上升趨勢（圖2），說明BPF暴露后，TRP代謝途徑引起在KYN這一層面積聚。

圖2 不同濃度BPF暴露對小鼠肝臟中KYN代謝途徑的影響Figure 2 Effects of BPF exposure with varied concentrations on hepatic KYN metabolic pathway

2.3 BPF 暴露對小鼠肝臟TYR 來源多巴胺（dopamine，DA）途徑神經(jīng)遞質(zhì)代謝的影響

DA 代謝通路是TYR 代謝的重要途徑，在精神性、中樞性疾病中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用［9］。本研究發(fā)現(xiàn)，BPF 連續(xù)暴露30 d 后，與對照組比較，TYR 在低濃度BPF 暴露組中的濃度明顯下降，在中、高濃度BPF暴露組呈現(xiàn)下降趨勢；與對照組比較，DA在低、中濃度BPF 暴露組中呈現(xiàn)明顯下降作用；TYR 代謝產(chǎn)物L(fēng)-DOPA 雖未出現(xiàn)顯著性差異，但均表現(xiàn)出上升趨勢；DA的代謝產(chǎn)物DOPAC在低、中濃度BPF暴露組表現(xiàn)為下降趨勢，而HVA 在BPF 暴露組中，均出現(xiàn)上升趨勢（圖3）。上述結(jié)果表明，BPF 暴露導(dǎo)致小鼠肝臟中TYR來源DA代謝途徑的紊亂。

圖3 不同濃度BPF暴露對小鼠肝臟中DA代謝途徑的影響Figure 3 Effects of BPF exposure with varied concentrations on hepatic DA metabolic pathway

2.4 BPF暴露對小鼠肝臟TYR來源NE途徑神經(jīng)遞質(zhì)代謝的影響

進一步，針對TYR 代謝的另一關(guān)鍵通路NE 進行探索，發(fā)現(xiàn)BPF暴露后，與對照組比較，BPF暴露的各組小鼠肝臟中的下游代謝產(chǎn)物如NE、E 及MHPG均顯示下降趨勢（圖4），說明BPF 暴露后，NE 代謝途徑可能被抑制。

圖4 不同濃度BPF暴露對小鼠肝臟中NE代謝途徑的影響Figure 4 Effects of BPF exposure with varied concentrations on hepatic NE metabolic pathway

2.5 BPF 暴露對小鼠肝臟興奮性神經(jīng)遞質(zhì)代謝的影響

興奮性神經(jīng)遞質(zhì)在調(diào)節(jié)個體情緒及精神性疾病中發(fā)揮重要作用。既往研究顯示，BPA 暴露引起小鼠抑郁樣改變［5］。因此，該研究觀察了不同濃度BPF 暴露后，神經(jīng)遞質(zhì)GLU、GABA、GLY 和ASP 水平的變化。與對照組比較，BPF 暴露能顯著降低興奮性神經(jīng)遞質(zhì)在小鼠肝臟中的水平，GLU 含量降低，其下游代謝產(chǎn)物GABA 同樣顯示出與GLU 代謝完全一致的趨勢，表現(xiàn)為在各BPF 濃度暴露組中水平的降低；此外，作為NMDA受體重要的調(diào)節(jié)因子，BPF 暴露引發(fā)GLY 濃度降低，另一重要的興奮性中樞神經(jīng)遞質(zhì)ASP 在BPF 的暴露下也有明顯下降（圖5），提示BPF 亞急性暴露對于興奮性神經(jīng)遞質(zhì)具有明顯的抑制作用。

圖5 不同濃度BPF暴露對小鼠肝臟中多種興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的影響Figure 5 Effects of BPF exposure with varied concentrations on the excitatory neurotransmitters in mouse liver

3 討論

美國疾病預(yù)防控制中心環(huán)境健康部門的一項針對616 例普通人群在2000—2014 年中BPA 及其替代物在該人群暴露的前瞻性研究顯示，74%～99%的尿液樣本中可檢測到BPA，42%～88%的人群中可檢測出BPF，而19%～74%的人群中可檢測出BPS。值得關(guān)注的是，BPA 在該人群中的暴露水平隨年份呈下降趨勢，而2010年后BPS和BPF的暴露水平呈明顯上升趨勢［10］。本課題組前期針對水體及空氣灰塵，對12 種雙酚類化學(xué)物進行外暴露水平的評估，發(fā)現(xiàn)BPF 無論在水體還是空氣灰塵中的含量均超過了BPA［11］。因此，BPF 暴露可能帶來潛在健康危害亟需大量證據(jù)的支持。雙酚類化學(xué)物的劑量-效應(yīng)關(guān)系并不遵循線性關(guān)系，在劑量選擇中，本研究參考了美國國家環(huán)境保護局確立的BPA 安全劑量［50 μg/（kg·d）］［12］，選擇了與該劑量同一量級的40 μg/（kg·d）為最低劑量，同時設(shè)定中劑量和高劑量組，旨在了解BPF 暴露引起神經(jīng)遞質(zhì)紊亂的劑量。本研究發(fā)現(xiàn)與BPA 類似，BPF 引起的神經(jīng)遞質(zhì)改變多表現(xiàn)為低、高劑量引起的較為典型的U 型效應(yīng)關(guān)系，這與BPF 暴露水平與女童及青少年女性游離雄激素水平呈現(xiàn)U型劑量關(guān)系［13］以及母親BPF孕期暴露水平與女性胎兒出生體長、生長呈非線性關(guān)系的現(xiàn)象一致［14］。

近期，有學(xué)者對來自美國國家健康與營養(yǎng)調(diào)查數(shù)據(jù)進行分析，發(fā)現(xiàn)尿液中雙酚系化學(xué)物的外暴露水平與抑郁的發(fā)生呈正相關(guān)［15］；在動物層面，BPF 孕期暴露后，其子代成年后表現(xiàn)出明顯的抑郁焦慮樣改變［16］，然而其機制仍不清楚。研究顯示，神經(jīng)遞質(zhì)失調(diào)是精神性疾病如抑郁、焦慮發(fā)生的重要原因，目前針對抑郁的治療更是立足神經(jīng)遞質(zhì)的干預(yù)，采用5-HT、NE 等再攝取抑制劑，進而提高突觸間隙5-HT 及NE 的水平，達到治療的目的［17-18］。既往對神經(jīng)遞質(zhì)的研究多數(shù)集中于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，近期，外周神經(jīng)遞質(zhì)紊亂引發(fā)的疾病越來越受到關(guān)注。最近研究發(fā)現(xiàn)，KYN作為TRP代謝的下游關(guān)鍵通路，炎性因子激活KYN 生成關(guān)鍵酶IDO-1 后，可引發(fā)非酒精性脂肪肝樣改變［19］；此外，KYN 在血清中升高被證明與抑郁發(fā)生密切相關(guān)，該過程通過IDO-1 或TDO 關(guān)鍵酶的高表達或激活，實現(xiàn)TRP 從5-HT 向KYN 代謝的轉(zhuǎn)化（圖6）。有意思的是，80%的KYN 均來自肝臟，而腦中60%以上的KYN 來自外周［20］，因此，BPF 暴露對肝臟KYN 水平的影響尤為重要。本研究結(jié)果顯示，BPF 暴露后小鼠肝臟中TRP 水平顯著下降，5-HT 水平下降，尤其在低濃度BPF 暴露后，這可能與雙酚類化學(xué)物暴露后產(chǎn)生U型反應(yīng)相關(guān)，提示在較低濃度作用下，即可產(chǎn)生較明顯的損傷效應(yīng)［21］。值得關(guān)注的是，BPF暴露后，肝臟中的KYN水平明顯增加，提示BPF促進了TRP從5-HT 代謝途徑向KYN 代謝途徑的轉(zhuǎn)化，可能導(dǎo)致外周KYN 水平升高；針對TYR 代謝途徑，本研究發(fā)現(xiàn)BPF 暴露后，肝臟中TYR 含量降低，其下游關(guān)鍵代謝產(chǎn)物DA 水平顯著下調(diào)，本研究結(jié)果與BPA 暴露后DA下降導(dǎo)致的抑郁等精神性疾病及帕金森樣改變的結(jié)果一致［22-23］。與5-HT、DA 等關(guān)鍵神經(jīng)遞質(zhì)一致的是，肝臟中NE及E的含量亦表現(xiàn)出下降趨勢，這為雙酚類化學(xué)物暴露作為精神性疾病發(fā)生的環(huán)境危險因素提供了部分解釋。值得一提的是，BPF 暴露降低了肝臟中興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的代謝水平，表現(xiàn)為GLU、GABA、GLY 及ASP 4 種神經(jīng)遞質(zhì)同時下降。研究顯示，GLU、GABA、GLY 及ASP 與N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）等受體結(jié)合，在維持神經(jīng)興奮性方面發(fā)揮極為重要的作用，抑郁自殺患者尸檢的腦組織中的GABA水平明顯降低［24］；此外，D-環(huán)絲氨酸與GLY 共同激活NMDA 受體發(fā)揮抑郁癥強化治療作用［25］，而嚴重抑郁癥采用氯胺酮的治療則基于其增強谷氨酸能活性［26］，這些研究均顯示，興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的干預(yù)可作為臨床抑郁或其他精神性疾病的潛在干預(yù)方案，同時亦證明了BPF 長期暴露通過抑制興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的水平引發(fā)精神類疾病的可能。值得注意的是，本研究亦有一些不足之處，如BPF暴露引起的神經(jīng)遞質(zhì)改變會引發(fā)何種下游生物學(xué)效應(yīng)？同時，BPF引起的神經(jīng)遞質(zhì)改變未能通過藥理學(xué)或敲除動物進一步驗證，導(dǎo)致BPF引起神經(jīng)遞質(zhì)改變的因果關(guān)系還不夠明確，后期將借助腺相關(guān)病毒或敲除小鼠模型探討關(guān)鍵代謝酶在BPF引起神經(jīng)遞質(zhì)改變中的作用。

圖6 TRP、TYR及興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的代謝圖Figure 6 Metabolic profiles of TRP，TYR and excitatory neurotransmitters

總之，本研究系統(tǒng)觀察到BPF 亞急性暴露引起肝臟中神經(jīng)遞質(zhì)代謝紊亂。肝臟作為最重要的代謝器官之一，其神經(jīng)遞質(zhì)代謝異?？蔀橥庵苌窠?jīng)遞質(zhì)紊亂引發(fā)精神性疾病提供解釋，同時提示了BPF暴露引發(fā)精神疾病的風(fēng)險，后續(xù)將圍繞“肝-腦軸”，進一步揭示BPF暴露引起外周神經(jīng)遞質(zhì)紊亂對中樞神經(jīng)遞質(zhì)的影響及引起潛在精神性疾病的作用及機制。