鄧 惠，陳格格，徐 莉，賈新顏，施菊妹，4*

1安徽醫(yī)科大學(xué)上海臨床學(xué)院，上海 200072；2上海市東方醫(yī)院血液科，上海 200120；3安徽醫(yī)科大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院，安徽合肥 230032；4同濟(jì)大學(xué)附屬上海第十人民醫(yī)院血液科，上海 200072

急性淋巴細(xì)胞白血病是一種侵襲性腫瘤，包括急性B 淋巴細(xì)胞白血病和急性T 淋巴細(xì)胞白血病。雖然T 淋巴細(xì)胞白血病5 年生存率超過(guò)85%，但疾病復(fù)發(fā)率與死亡率仍非常高［1-2］。目前迫切需要開發(fā)多藥化療的藥物譜，針對(duì)性地殺傷腫瘤細(xì)胞，提高治療效果。對(duì)于T淋巴細(xì)胞白血病或其他惡性腫瘤，細(xì)胞異常增殖是常見的特征［3-4］。在特定的細(xì)胞類型中干擾這一過(guò)程可能會(huì)提供潛在的治療方法。在細(xì)胞增殖過(guò)程中，DNA損傷修復(fù)是細(xì)胞正常運(yùn)行的保證。因此，DNA損傷修復(fù)異常成為惡性腫瘤轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。無(wú)數(shù)新藥通過(guò)阻斷DNA損傷修復(fù)來(lái)干擾異常增殖，從而在抗腫瘤方面取得了驚人效果［5-7］。

在DNA復(fù)制和損傷修復(fù)的過(guò)程中，核糖核苷酸還原酶（ribonucleic reductase，RNR）是催化核糖核苷二磷酸合成脫氧核糖核苷酸的關(guān)鍵酶［8-9］。RNR的上調(diào)和激活，可導(dǎo)致腎上腺皮質(zhì)癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、肝細(xì)胞癌等惡性腫瘤的發(fā)生，提示RNR可能是腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)［10-13］?；赗NR 的抗癌藥物或小分子藥物有吉西他濱、氯法拉濱、羥基脲、曲平等［14-16］。而4-羥基水楊酰苯胺（4-hydroxysalicylaniline，HDS）已被證明，可通過(guò)與酶活性位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合而抑制RNR酶活性，這也提示HDS 可能是一種治療某些癌癥的潛在藥物［14，17］。事實(shí)上，HDS 已被用于治療多種腫瘤，如肝細(xì)胞癌和多發(fā)性骨髓瘤［14］。但HDS在T淋巴細(xì)胞白血病中的作用及其機(jī)制尚不清楚。

鑒于HDS 的臨床優(yōu)勢(shì)及其通過(guò)抑制細(xì)胞增殖對(duì)多種癌癥的療效，本研究在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中觀察了HDS 對(duì)T 淋巴細(xì)胞白血病的療效，為開發(fā)HDS 作為潛在的抗T淋巴細(xì)胞白血病藥物提供了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

人源細(xì)胞株Jurkat、Hut-78細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC（American Type Culture Collection）。HDS 由上海中科院藥物所惠贈(zèng)，用二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）配成40 mmol/L 的溶液儲(chǔ)存于-20 ℃?zhèn)溆谩? 周齡雄性BALB/c 裸鼠購(gòu)自江蘇華創(chuàng)信諾醫(yī)藥科技有限公司。培養(yǎng)基RPMI-1640、DMSO（Gibco公司，美國(guó)），胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，Hyclone 公司，美國(guó)）；一抗Cdc25A、CyclinA2、CDK2、GAPDH、Bad、Bax、Bcl-XL、Bcl-2、γ-H2AX、CHK1、p-CHK1、CHK2、p-CHK2、Ki-67抗體，HRP標(biāo)記的二抗，R488 標(biāo)記的熒光二抗（Abcam 公司，美國(guó)）；PI/RNase細(xì)胞周期染色液和Annexin-V-FITC/PI試劑盒、流式細(xì)胞分析儀（BD 公司，美國(guó)）；Synergy H4多功能酶標(biāo)儀（BioTek公司，美國(guó)）；Leica正置熒光顯微鏡、Zeiss LSM710共聚焦顯微鏡（Leica 公司，德國(guó)）。本研究經(jīng)過(guò)同濟(jì)大學(xué)附屬上海第十人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)［SYXK（滬）2021-0012］。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

Jurkat 和Hut-78 細(xì)胞用含10% FBS 和1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中，每2～3 d更換1次細(xì)胞培養(yǎng)液，以維持細(xì)胞培養(yǎng)所需條件。

1.2.2 細(xì)胞CCK-8實(shí)驗(yàn)

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Jurkat 和Hut-78 細(xì)胞，以2×105～3×105個(gè)/mL的密度接種于96孔板，HDS按梯度稀釋后加入對(duì)應(yīng)96孔板中，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 h 后，于檢測(cè)前2 h 向每孔加入10 μL 的CCK-8 試劑，繼續(xù)避光放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育，酶標(biāo)儀波長(zhǎng)在450 nm下測(cè)量每孔吸光度值，計(jì)算細(xì)胞存活率，用CalcuSyn軟件計(jì)算HDS對(duì)細(xì)胞的半數(shù)致死量（IC50）。

1.2.3 軟瓊脂糖克隆形成實(shí)驗(yàn)

配制3.5%和1.66%瓊脂糖液，高壓滅菌后置于42 ℃水浴鍋備用；配制含20%血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液備用；將3.5%的瓊脂糖液和20%的RPMI-1640培養(yǎng)液按1∶5 比例混合，在12 孔板中制備下層膠（每孔1 mL）；收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Jurkat 和Hut-78 細(xì)胞，配制密度為4×103～5×103個(gè)/mL 細(xì)胞懸液，根據(jù)濃度加入相應(yīng)體積的HDS母液；將1.66%瓊脂糖與細(xì)胞懸液按1∶5的比例混合配制上層膠（每孔700 μL），室溫凝固后將12 孔板置于培養(yǎng)箱中，每5～7 d 補(bǔ)充1 次培養(yǎng)液，集落形成后每孔加入0.005%的龍膽紫染液1 mL，室溫避光染色1 h后吸走殘余染液，拍照并計(jì)算克隆形成數(shù)。

1.2.4 細(xì)胞周期檢測(cè)

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Jurkat 和Hut-78 細(xì)胞，配成密度為2×105～3×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，按每孔1 mL接種至24 孔板中，用不同濃度的HDS 藥物處理，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)；至處理時(shí)間點(diǎn)時(shí)收集細(xì)胞至流式管中，按照“先慢后快”的原則，逐滴向每管加入1 mL預(yù)冷（-20 ℃）的70%乙醇，-20 ℃固定至少12 h，檢測(cè)當(dāng)天離心并用PBS 清洗1 遍后，每管加300 μL 的細(xì)胞周期檢測(cè)試劑PI/RNase，室溫避光孵育30 min后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Jurkat 和Hut-78 細(xì)胞，配成密度為2×105～3×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，按每孔1 mL接種至24孔板中，每孔按不同濃度加入HDS藥物處理，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)；至處理時(shí)間點(diǎn)時(shí)收集細(xì)胞至流式管中，每管加入2.5 μL Annexin-V-FITC 和50 μL 1× Binding Buffer，室溫避光染色15 min；每管加入5 μL PI 和250 μL 1×Binding Buffer，室溫避光染色5 min 后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。讀取數(shù)據(jù)，計(jì)算細(xì)胞凋亡百分比。

1.2.6 Western blot檢測(cè)

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Jurkat 和Hut-78 細(xì)胞，配成密度為2×105～3×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，按不同濃度加入HDS 藥物處理48 h 后，用RIPA 蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白并進(jìn)行蛋白定量，加入SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液，取20 μL 蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 電泳后轉(zhuǎn)移于硝化纖維素（NC）微孔濾膜，5%BSA 封閉1 h 后進(jìn)行抗體孵育（4 ℃冰箱過(guò)夜）。次日用PBST清洗NC 膜3 遍以后，根據(jù)一抗種屬進(jìn)行二抗孵育（室溫，1 h），再用PBST清洗3遍。Amersham Imager 600 自動(dòng)化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀曝光檢測(cè)并保存圖片，用Image J軟件對(duì)圖片進(jìn)行分析。

1.2.7 γ-H2AX免疫熒光法

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Jurkat 和Hut-78 細(xì)胞，配成密度為2×105～3×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，按不同濃度加入HDS藥物處理48 h后，用PBS清洗1次，按細(xì)胞沉淀∶PBS=1∶20（體積比）的比例加入適量PBS重懸細(xì)胞，混勻后每個(gè)樣品取50 μL 均勻涂片于正電荷黏附防脫載玻片上（涂片面積約為1 cm×1 cm），經(jīng)4%多聚甲醛固定、0.5% Triton X-100 破膜、0.5%BSA 封閉、一抗γ-H2AX 抗體孵育（4 ℃冰箱過(guò)夜）、R488標(biāo)記的二抗孵育（室溫，1 h）、DAPI孵育10 min、防熒光淬滅劑封片后，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察γ-H2AX陽(yáng)性細(xì)胞，并拍照。

1.2.8 裸鼠移植瘤與HDS的抗腫瘤活性檢測(cè)

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Jurkat 細(xì)胞，無(wú)菌PBS 清洗2 次并用其配成密度為2×107個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液，與基質(zhì)膠按體積比1∶1混勻置于冰上備用。裸鼠注射部位消毒后，用1 mL 注射器抽取細(xì)胞懸液，皮下注射100 μL，定期觀察裸鼠情況。待移植瘤長(zhǎng)至約0.5 cm×0.5 cm時(shí)，將裸鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和HDS處理組。HDS處理組腹腔注射HDS 100 mg/（kg·d），對(duì)照組注射同體積的溶劑DMSO。每日記錄裸鼠移植瘤的大小，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，裸鼠安樂(lè)死后，剝離皮下腫瘤組織，并收集裸鼠心臟、肝臟和腎臟組織，在4%多聚甲醛中固定備用。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示；實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間比較采用Student’st檢驗(yàn)；多組比較采用單因素方差分析（oneway ANOVA），各組之間的兩兩比較采用SNK 法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HDS 可抑制T 淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的增殖和克隆形成

HDS 是一種臨床批準(zhǔn)的藥物，其相對(duì)分子量為229.24 Da（圖1A）。為了確定HDS 是否具有抗T 淋巴細(xì)胞白血病腫瘤的能力，將不同濃度的HDS（0、25、50、75、100、150、200、300、400 μmol/L）分別作用于T 淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株Jurkat 和Hut-78 細(xì)胞24、48、72 h。HDS對(duì)T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株有細(xì)胞毒性，且表現(xiàn)出劑量和時(shí)間依賴性（圖1B、C）。HDS作用48 h后，Jurkat和Hut-78細(xì)胞半數(shù)抑制濃度（IC50值）分別為151.18 μmol/L 和173.67 μmol/L。瓊脂集落形成法檢測(cè)不同濃度的HDS 對(duì)Jurkat 和Hut-78 細(xì)胞集落形成能力的影響。結(jié)果顯示，HDS可顯著抑制兩種細(xì)胞系的集落形成，且集落形成數(shù)與藥物濃度呈負(fù)相關(guān)（圖1D、E）。

圖1 HDS可抑制T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的增殖和克隆形成Figure 1 HDS can inhibit the proliferation and colony formation of T-lymphoblastic leukemia cells

2.2 HDS 可誘導(dǎo)T 淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞停滯于細(xì)胞周期S期

為探討HDS對(duì)T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞細(xì)胞周期的影響，用不同濃度的HDS 作用于Jurkat 和Hut-78細(xì)胞（0、100、300 μmol/L）48 h，然后用碘化丙啶（PI）染色和流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期。結(jié)果顯示，處于S期的Jurkat（圖2A）和Hut-78（圖2B）細(xì)胞群比例逐漸增高，且呈濃度依賴性（圖2C、D）。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，經(jīng)HDS處理，Jurkat和Hut-78細(xì)胞的Cdc25A、CDK2、Cyclin A2 表達(dá)水平明顯下調(diào)（圖2E～G）。綜上所述，HDS通過(guò)抑制Cdc25A、CDK2和Cyclin A2 等細(xì)胞周期S 期相關(guān)蛋白的表達(dá)，使T 淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞停滯于細(xì)胞周期S期。

圖2 HDS可誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞停滯于細(xì)胞周期S期Figure 2 HDS can induce cell cycle arrest at S phase of T-lymphoblastic leukemia cells

2.3 HDS可誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞凋亡

為了進(jìn)一步探討HDS對(duì)T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的影響，并確定T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的增殖抑制是否是通過(guò)誘導(dǎo)凋亡而引起，用不同濃度的HDS（0、25、50、100、300 μmol/L）處理Jurkat 和Hut-78 細(xì)胞48 h（圖3A、B）。細(xì)胞流式結(jié)果表明，HDS 可顯著促進(jìn)Jurkat 和Hut-78 細(xì)胞的凋亡，且呈濃度依賴性（圖3C、D）。同時(shí)，通過(guò)免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bad、Bax、Bcl-XL和Bcl-2的表達(dá)。結(jié)果顯示，在兩細(xì)胞系中，促凋亡蛋白Bad和Bax表達(dá)上調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-XL和Bcl-2表達(dá)降低，且呈劑量依賴關(guān)系（圖3E～G）。這些結(jié)果與流式細(xì)胞檢測(cè)的趨勢(shì)是一致的，即HDS可顯著誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的凋亡。

圖3 HDS可誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞凋亡Figure 3 HDS can induce the apoptosis of T-lymphoblastic leukemia cells

2.4 HDS 可通過(guò)CHK1/CHK2 信號(hào)通路阻斷T 淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)過(guò)程

為了確定HDS 是否影響T 淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的DNA 損傷修復(fù)過(guò)程，進(jìn)而加重細(xì)胞DNA 損傷，以100 μmol/L 和300 μmol/L 的HDS 處理Jurkat（圖4A）和Hut-78（圖4B）細(xì)胞48 h，并檢測(cè)DNA 合成損傷的標(biāo)志基因γ-H2AX 的表達(dá)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，HDS處理組中，Jurkat和Hut-78細(xì)胞γ-H2AX 陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯增加，且呈劑量依賴關(guān)系（圖4C、D）。同時(shí)，用免疫印跡法檢測(cè)DNA 損傷相關(guān)蛋白CHK1、p-CHK1、CHK2、p-CHK2和γ-H2AX的表達(dá)水平（圖4E～G）。結(jié)果表明，γ-H2AX的表達(dá)與免疫熒光染色數(shù)據(jù)的趨勢(shì)相一致，且HDS 可通過(guò)磷酸化相應(yīng)的下游分子CHK1 和CHK2，抑制DNA 損傷修復(fù)過(guò)程，導(dǎo)致T 淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞DNA 損傷加重。

圖4 HDS可通過(guò)CHK1/CHK2信號(hào)通路阻斷T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)過(guò)程Figure 4 HDS can block the DNA damage repair process of T-lymphoblastic leukemia cells through the CHK1/CHK2 signaling pathway

2.5 HDS 可抑制小鼠中T 淋巴細(xì)胞白血病腫瘤的生長(zhǎng)

建立裸鼠皮下T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞異種移植模型來(lái)研究HDS對(duì)T淋巴細(xì)胞白血病腫瘤的治療效果。采用5 周齡BALB/c 裸鼠，皮下注射Jurkat 細(xì)胞（1×107個(gè)/只）。小鼠T淋巴細(xì)胞白血病腫瘤形成后，HDS組每只每天腹腔注射100 mg/kg HDS，對(duì)照組注射等量的DMSO，同時(shí)每天測(cè)量腫瘤大小和小鼠體重，共13 d。數(shù)據(jù)顯示，與對(duì)照組相比，經(jīng)HDS處理的小鼠，其T 淋巴細(xì)胞白血病腫瘤生長(zhǎng)明顯受到抑制（圖5A、B）。但HDS組與對(duì)照組小鼠體重?zé)o顯著差異（圖5C）。

圖5 HDS可抑制小鼠中T淋巴細(xì)胞白血病腫瘤的生長(zhǎng)Figure 5 HDS can inhibit the growth of T-cell lymphoblastic leukemia tumors in mice

HDS 處理13 d 后，取動(dòng)物的腫瘤組織，進(jìn)行切片和蘇木精-伊紅染色，結(jié)果顯示HDS 組小鼠的腫瘤組織壞死明顯增加，但心臟、肝臟和腎臟組織沒(méi)有明顯變化（圖5D）。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HDS可抑制小鼠體內(nèi)移植的T 淋巴細(xì)胞白血病腫瘤，但對(duì)小鼠無(wú)明顯毒性。

將腫瘤組織切片進(jìn)行免疫組化染色分析，數(shù)據(jù)顯示，HDS 組小鼠腫瘤組織中，Ki67 陽(yáng)性細(xì)胞比例較對(duì)照組明顯降低，γ-H2AX 陽(yáng)性細(xì)胞比例較對(duì)照組明顯升高（圖5E），表明在小鼠體內(nèi)，HDS 亦可顯著誘導(dǎo)T 淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞DNA 損傷，抑制T 淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的增殖。

3 討論

急性淋巴細(xì)胞白血病是一種侵襲性腫瘤，目前針對(duì)T 淋巴細(xì)胞白血病的治療方案效果較差，疾病復(fù)發(fā)率與死亡率仍非常高［1-2］。因此，開發(fā)新的藥物和治療策略非常有意義。

本研究以T 淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株Jurkat 和Hut-78 細(xì)胞為研究對(duì)象，探討HDS 對(duì)T 淋巴細(xì)胞白血病的體外治療作用。通過(guò)CCK-8 和克隆形成實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)HDS 以劑量和時(shí)間依賴的方式顯著抑制T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)。CCK-8 結(jié)果表明，HDS 通過(guò)下調(diào)T 淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞中Cdc25A、CDK2 和Cyclin A2 的蛋白水平，以劑量和時(shí)間依賴的方式阻斷細(xì)胞周期的S期。

除了細(xì)胞周期停滯外，細(xì)胞死亡也可能導(dǎo)致腫瘤抑制［18］。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞死亡的常見亞型［19］。因此，研究了HDS 作用后T 淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的凋亡表型。Annexin V/PI 雙重染色和流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，T 淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株Jurkat 和Hut-78 細(xì)胞發(fā)生明顯的細(xì)胞凋亡，在特定劑量下培養(yǎng)48 h，凋亡率為60%～80%。此外，Bad、Bax、Bcl-2和Bcl-XL 在細(xì)胞凋亡中起重要作用［19］。HDS 處理腫瘤細(xì)胞后，Western blot結(jié)果表明，促凋亡蛋白Bax和Bad表達(dá)上調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL表達(dá)降低，呈劑量依賴關(guān)系，提示這可能是HDS抗T淋巴細(xì)胞白血病的相關(guān)機(jī)制。此外，與細(xì)胞凋亡相關(guān)的詳細(xì)通路還有待進(jìn)一步探索。

HDS 是一種與核糖核苷酸還原酶亞單位M2（ribonucleotide reductase small subunit M2，RRM2）受體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的RNR抑制劑。RNR在DNA損傷修復(fù)中發(fā)揮關(guān)鍵作用［16］。此外，關(guān)于HDS在其他類型腫瘤中的研究也很多，如肝細(xì)胞癌［13］。研究認(rèn)為，HDS可能會(huì)干擾DNA損傷修復(fù)過(guò)程。γ-H2AX染色結(jié)果顯示，經(jīng)HDS 處理的細(xì)胞DNA 損傷加重。蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，HDS 處理上調(diào)了p-CHK1 和p-CHK2 的表達(dá)。CHK2 是一種位于DNA 損傷檢查點(diǎn)的限速蛋白，可以指導(dǎo)與S 期細(xì)胞周期停滯相關(guān)的Cdc25A［20-21］。ATM/ATR 可以反映DNA 損傷，并將信號(hào)傳遞給其下游分子CHK2/CHK1，最終導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯或凋亡［22-23］。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證藥物的有效性和安全性，建立了T 淋巴細(xì)胞白血病異種移植小鼠模型。在體內(nèi)，HDS可以抑制小鼠T淋巴細(xì)胞白血病腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而增加腫瘤組織壞死，但對(duì)小鼠的心臟、肝臟等其他器官?zèng)]有明顯影響，表明HDS 對(duì)T 淋巴細(xì)胞白血病腫瘤具有殺傷作用，且無(wú)明顯毒性。結(jié)合體外實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，表明HDS可有效殺傷T 淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞，可作為治療T 淋巴細(xì)胞白血病的靶向藥物。

HDS 在抗腫瘤方面有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。首先，HDS是一種成分清晰、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的復(fù)方藥物，可以在體外合成；其次，它已被臨床批準(zhǔn)用于肝膽疾病，本研究將舊藥用于新的目的，改變現(xiàn)有藥物的用途，可以顯著降低新藥開發(fā)的費(fèi)用和時(shí)間；此外，HDS 作為一種臨床藥物對(duì)T淋巴細(xì)胞白血病具有明顯的療效和安全性。

HDS在T淋巴細(xì)胞白血病治療中的應(yīng)用仍需進(jìn)一步探索。首先，目前尚不清楚在停藥期間移植的T 淋巴細(xì)胞白血病腫瘤是否會(huì)復(fù)發(fā)；其次，HDS 抗T淋巴細(xì)胞白血病腫瘤的具體機(jī)制除誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期停滯外，還有待進(jìn)一步研究；最后，HDS作為RNR 抑制劑，可以影響RRM2 的活性，需要進(jìn)一步找出HDS 作用RNR 的亞型以及與這些還原酶結(jié)合的金屬因子，這可能涉及細(xì)胞鐵死亡或與金屬離子相關(guān)的其他形式的細(xì)胞死亡［10］。

綜上所述，體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均顯示，HDS對(duì)T淋巴細(xì)胞白血病有良好的治療效果。它可促進(jìn)細(xì)胞凋亡、通過(guò)CHK1/CHK2信號(hào)通路加重DNA損傷，且可誘導(dǎo)S 期細(xì)胞周期停滯等途徑抑制細(xì)胞增殖。HDS已被批準(zhǔn)用于肝病治療，為進(jìn)一步臨床應(yīng)用于T淋巴細(xì)胞白血病患者提供了理論依據(jù)。本研究也為進(jìn)一步開發(fā)和優(yōu)化其他藥物的使用策略提供了依據(jù)。