尹雪宇,陳遠騰,莊爾俊,趙俊杰,董 玲,李海龍,2

帶絳蟲是一種腸道寄生蠕蟲,人因生食含有囊尾蚴的豬肉或牛肉而感染[1],人體感染帶絳蟲病后通常無明顯癥狀,少數(shù)患者會出現(xiàn)腹痛、腹瀉、消化不良和食欲不振等不典型癥狀[2],感染人類的帶絳蟲主要有豬帶絳蟲、牛帶絳蟲和亞洲帶絳蟲。在我國帶絳蟲主要分布于云南、西藏以及四川等少數(shù)民族地區(qū)。云南大理是白族聚集地區(qū), 當?shù)鼐用裣彩成?以生豬肉或豬肝為主),是導致帶絳蟲病流行的主要原因,近年有研究證實云南大理流行的帶絳蟲以亞洲帶絳蟲為主[3]。報告顯示帶絳蟲在大理州各地感染程度不同,大理市感染率最高為87.29%,洱源縣其次占6.08%,其余周邊地區(qū)帶絳蟲感染率相對較低[4]。近年有學者對彌渡縣帶絳蟲流行分布情況進行調查,結果顯示彌渡縣人群帶絳蟲感染率為15.7%,蟲種均為亞洲帶絳蟲[5]。

12S rRNA是一種存在于線粒體核糖體中的小亞基RNA,進化速率較高[6],常用于各種脊椎動物的親緣關系比較中[7-8],研究表明12S rRNA基因也可以用于豬帶絳蟲、牛帶絳蟲和亞洲帶絳蟲的分類鑒定[9]。因此,本研究基于線粒體12S rRNA基因序列對大理州5個地區(qū)的帶絳蟲群體進行遺傳多樣性分析,旨在為大理州帶絳蟲病的防控和研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 以大理州血吸蟲防治所2019年5月至2021年8月收治的帶絳蟲患者為研究對象,采用檳榔—南瓜子—甘露醇法對患者進行驅蟲[10],收集到131份亞洲帶絳蟲樣本,對采集到的亞洲帶絳蟲樣本進行分類,其中大理市(DL)58份、巍山縣(WS)14份、彌渡縣(MD)18份、漾濞縣(YB)24份、洱源縣(EY)17份。各樣本來源地的地理分布情況如圖1所示。

[審圖號:GS(2022)1873號]圖1 大理州5個亞洲帶絳蟲群體地理分布Fig.1 Geographical distribution of 5 populations of Taenia asiatica in Dali Prefecture

1.2 試劑與儀器 組織DNA提取試劑盒(上海生工生物工程技術服務有限公司)、2×Taq PCR Master Mix(北京天根生化有限公司)、DL2000 DNA Maker(TaKaRa大連寶生生物工程有限公司)、雙蒸水、 DNA凝膠電泳成像系統(tǒng)(美國UVA公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 DNA提取和引物設計 取下絳蟲孕節(jié)并將其剪碎,用研磨器研磨后,按照組織DNA提取試劑盒說明書提取DNA,存放于4 ℃冰箱內。參考文獻報道[11]對線粒體12S rRNA基因進行PCR引物設計,上游引物:5′-AGGGGATAGGACACAGTGCCAGC-3′;下游引物:5′-CGGTGTGTACATGAGCTAAAC-3′。

1.3.2 PCR擴增體系和程序 PCR擴增總反應體系為30 μL,其中2×Taq PCR MasterMix 15 μL,上游引物和下游引物各1 μL,模板DNA 2 μL,雙蒸水11 μL。反應程序為:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s,57 ℃退火45 s,72 ℃延伸35 s,共35個循環(huán),72 ℃延伸10 min。

1.3.3 PCR產物檢測和測序 擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,于凝膠電泳成像系統(tǒng)中觀察結果,將擴增產物送至上海生工生物工程有限公司進行單向測序,測序引物與擴增引物相同。

1.3.4 序列分析 通過MEGA7.0軟件對測序產物進行比對對齊,在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST同源性比對;將經同源性比對為亞洲帶絳蟲的序列按地區(qū)進行分組整合;通過DNASP5.10.01軟件對序列進行遺傳多樣性分析、中性檢驗分析以及遺傳分化系數(shù)FST和基因流Nm分析(公式為Nm=(1/FST-1)/4)[12];通過MEGA7.0計算各組之間的堿基組成、變異位點數(shù)以及遺傳距離。

2 結 果

2.1 PCR擴增結果 131條帶絳蟲12S rRNA基因的PCR擴增結果如圖2所示(部分結果),長度為493 bp。測序產物經GenBank數(shù)據(jù)庫中的BLAST同源性比對,131條帶絳蟲樣本均確定為亞洲帶絳蟲,與NCBI中亞洲帶絳蟲12S rRNA基因序列(編號:MT448955)比對,同源性為:97.67%～100%。

注:M:DNAMaker 2000;1～8:部分陽性樣品,目的片段493 bp。圖2 部分亞洲帶絳蟲樣本12S rRNA基因PCR電泳圖Fig.2 PCR amplification of 12S rRNA from part of Taenia asiatica samples

2.2 堿基組成 通過MEGA7.0分析得到的亞洲帶絳蟲線粒體12S rRNA基因片段堿基組成如表1所示,A、T、G、C的平均含量分別為28.3%、43.2%、19.4%和9.1%,A+T含量(71.5%)明顯高于G+C含量(28.5%),呈現(xiàn)A/T偏倚性。

表1 亞洲帶絳蟲各群體12S rRNA基因片段堿基組成Tab.1 Base composition of 12S rRNA gene fragment in different populations of Taenia asiatica

2.3 遺傳多樣性及變異 5個群體12S rRNA基因序列共檢測到138個變異位點,共定義76個單倍體型。其中單倍型多樣性為0.983 0,核酸多樣性為0.033 2,呈現(xiàn)出高Hd高Pi的分布模式(Hd>0.5, Pi>0.005)。各群體中大理市的單倍型數(shù)最多為45,彌渡縣的單倍型數(shù)最少為13。巍山群體的變異位點數(shù)最多為93,漾濞群體的變異位點數(shù)最少為25。巍山群體的單倍型多樣性和核酸多樣性最高,分別為1和0.054 9;彌渡群體的單倍型多樣性最低,為0.966 7,漾濞群體的核苷酸多樣性最低,為0.026 9;對各群體12S rRNA基因進行中性檢驗,其中大理市和巍山縣的Fu’s Fs和Tajima’s D分別為顯著負值,推測這兩個群體可能曾發(fā)生過群體擴張(表2)。

表2 基于12S rRNA基因的亞洲帶絳蟲群體遺傳多樣性Tab.2 Genetic diversity of Taenia asiatica populations based on 12S rRNA gene

2.4 遺傳分化系數(shù)(FST)與基因流(Nm) 運用DNASP軟件計算亞洲帶絳蟲群體間的遺傳分化系數(shù)?；?2S rRNA基因分析結果顯示(表3),各群體之間的遺傳分化指數(shù)范圍為-0.019 13～0.040 80,除了巍山群體與各群體間有極小的遺傳分化(01),其中以漾濞群體與巍山群體之間的基因交流最為頻繁,Nm為22.497 95。

表3 基于12S rRNA基因的亞洲帶絳蟲群體遺傳分化系數(shù)與基因流Tab.3 FST and Nm of Taenia asiatica population based on 12S rRNA gene

2.5 遺傳距離 各群體12S rRNA基因經MEGA7.0計算得到的遺傳距離結果見表4, 大理市與巍山縣群體之間的遺傳距離最大為0.022 9,漾濞縣與洱源縣群體之間的遺傳距離最小為0.002 3;其中巍山群體與各群體間均具有較高的遺傳距離(0.020 0～0.022 9),該群體與各群體間的親緣關系相對較遠。推測與各地區(qū)亞洲帶絳蟲群體進化速度不同有關。

表4 基于12S rRNA基因的亞洲帶絳蟲群體遺傳距離Tab.4 Genetic distance of Taenia asiatica based on 12S rRNA gene

3 討 論

本研究通過PCR擴增獲得5個亞洲帶絳蟲群體的12S rRNA基因,結果顯示12S rRNA基因序列的堿基組成呈A/T偏倚性,與蠕蟲線粒體基因組成特點相吻合[13];單倍型多樣性和核酸多樣性是衡量一個物種或群體遺傳多樣性的重要指標,單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別以0.5和0.005為界,數(shù)值越大說明遺傳多樣性越高[14]。在本研究中,12S rRNA的單倍型多樣性和核酸多樣性分別為0.983 0(Hd>0.5)和0.033 2(Pi>0.005),說明這5個群體均經過了長時間的演化[15],遺傳多樣性較高。

FST和Nm[17]是反應群體進化的兩個重要參數(shù)。FST值的范圍在0～1之間有意義,若00.25,表示兩群體間有極大的遺傳分化;若FST值為負,表示兩群體間不存在遺傳分化[18];Nm以1為臨界值,數(shù)值越大則群體間基因流動交流越頻繁且發(fā)生遺傳漂流的概率越小[19]。本研究中,大理州5個群體的遺傳分化指數(shù)為-0.019 13～0.040 80,其中巍山群體與其他群體之間的FST范圍為0.010 99～0.040 80,說明巍山群體與各群體之間存在極小的遺傳分化,其余4個群體之間的FST均為負值,說明這4個亞洲帶絳蟲群體間沒有遺傳分化;基因流范圍5.877 45～22.497 95,說明各群體間基因交流水平較高。

群體間的遺傳距離是衡量群體間的親緣關系的指標,遺傳距離越大,親緣關系越遠[20]。本研究中大理與巍山群體之間的遺傳距離最大,漾濞與洱源群體之間的遺傳距離最小,說明漾濞縣和洱源縣亞洲帶絳蟲群體之間存在較近的親緣關系,巍山群體與各群體間的親緣關系相對較遠;Fu’s Fs[21]或Tajima’s D[22]值是中性檢驗的兩個重要參數(shù),可以推算種群的歷史動態(tài),當Fu’s Fs或Tajima’s D結果為顯著負值,則表明群體出現(xiàn)過種群擴張效應;當Fu’s Fs或Tajima’s D結果不顯著或接近于0時,說明該群體大小穩(wěn)定,符合中性檢驗。這5個群體中大理群體和巍山群體的Fu’s Fs和Tajima’s D分別為顯著負值,說明大理市和巍山縣的亞洲帶絳蟲群體可能發(fā)生過群體擴張,這兩個群體在某個時期的感染率可能升高。

本研究中亞洲帶絳蟲群體遺傳分化程度較低,但均經過了長久的歷史演化,遺傳多樣性較高。本研究對大理州亞洲帶絳蟲群體12S rRNA基因序列進行了測定和分析,評估亞洲帶絳蟲群體的遺傳多樣性,為亞洲帶絳蟲的遺傳多樣性研究提供了相關數(shù)據(jù)。

利益沖突:無

引用本文格式:基于線粒體12S rRNA基因對大理州亞洲帶絳蟲遺傳多樣性的分析[J].中國人獸共患病學報,2023,39(8):784-788. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2023.00.086