劉麗婭,剡文亮,張子榮, 宋 潔,鄭 瑩,馬曉菁,葉 鋒,谷文喜,易新萍,李 巖

布魯氏菌是一種兼性胞內(nèi)寄生菌,宿主范圍廣、對環(huán)境抵抗力較強(qiáng),可以通過多種途徑感染動物和易感人群[1-2],對畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展和社會公共衛(wèi)生安全造成巨大威脅。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報道,每年布病新增病例數(shù)超過50萬[3]。人感染布病主要是通過接觸患病動物及其動物產(chǎn)品。做好畜間布病防控,對于控制人間布病至關(guān)重要。疫苗接種是控制畜間動物布病的有效手段。目前應(yīng)用于動物布病防控的疫苗主要為弱毒活疫苗,給人和動物帶來一定的生物安全風(fēng)險[4]。從病原學(xué)角度來說,核酸探針分子斑點(diǎn)雜交技術(shù)、聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、巢式PCR方法、熒光探針實時定量PCR等方法可鑒別布魯氏菌疫苗株與自然感染菌株[5-6]。但在免疫學(xué)層面目前尚無檢測區(qū)分自然感染抗體與疫苗免疫抗體的方法,難以對布病自然感染動物進(jìn)行準(zhǔn)確診斷,有效剔除傳染源[7]。

半抗原-瓊脂擴(kuò)散試驗(NH-AGID)是基于脂多糖(S-LPS)和半抗原多糖(NH)的免疫原性差異建立的一種鑒別診斷方法[8-9]。國外研究報道,NH-AGID方法中NH抗原對布魯氏菌疫苗Rev.1株和S19株的免疫抗體多呈陰性反應(yīng),檢測特異性>90%,據(jù)此,應(yīng)用NH-AGID方法可鑒別診斷布魯氏菌疫苗Rev.1株和S19株的免疫抗體與感染抗體[10-11]。本研究擬使用我國羊用布病疫苗M5株和S2株免疫羊,在抗體持續(xù)期內(nèi)應(yīng)用NH-AGID方法進(jìn)行檢測,評估該方法區(qū)分M5和S2疫苗免疫抗體和感染抗體的特異性,以期為我國布病防控診斷提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試劑與疫苗 布病活疫苗(M5株)購自天康生物制藥有限公司(批號2021004);布病活疫苗(S2株)購自天康生物制藥有限公司生產(chǎn)(批號2021031)。布病虎紅平板凝集和試管凝集試驗抗原購自青島中創(chuàng)匯科生物科技有限公司;布病抗體瓊擴(kuò)法檢測試劑盒,包含NH、LPS混合抗原、布魯氏菌病陽性對照血清、21孔瓊脂板等,購自青島瑞爾唯特生物技術(shù)有限公司(批號 2112002)。均在有效期內(nèi)使用。

1.1.2 實驗動物 選取3～5月齡且健康狀況良好的綿羊羔羊74只,免疫前采血,分離血清,經(jīng)布病虎紅平板凝集試驗(RBT)和試管凝集試驗(SAT)檢測結(jié)果均為陰性。

1.2 方 法

1.2.1 分組免疫 將74只實驗羊隨機(jī)分為3組,即M5組24只、S2口服組25只、S2皮下組25只。按照M5、S2疫苗說明書規(guī)定的用法與劑量進(jìn)行免疫。分組情況見表1。

表1 免疫分組情況Tab.1 Immunization groups

1.2.2 血清采集 免疫后7 d、14 d、21 d、30 d、60 d、90 d、120 d、150 d采血分離血清,并置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 檢測 按照國標(biāo)GB 18646-2018,應(yīng)用RBT方法對免疫血清樣品進(jìn)行初篩,陽性血清再經(jīng)SAT方法進(jìn)行確診。確診的免疫抗體陽性血清置于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 NH-AGID試驗 應(yīng)用NH-AGID方法對確診的免疫陽性血清進(jìn)行檢測。待檢血清僅出現(xiàn)一條LPS沉淀線、未出現(xiàn)NH沉淀線,表明該動物檢測LPS抗體陽性,NH抗體陰性,判定為免疫動物;出現(xiàn)NH和LPS兩條沉淀線,表明該動物檢測LPS抗體和NH抗體均為陽性,動物機(jī)體內(nèi)布魯氏菌為活動期或排菌期,判定為布魯氏菌感染動物。LPS沉淀線和NH沉淀線位置見圖1。

注:1為布魯氏菌病陽性對照感染動物;4為免疫動物。圖1 NH-GD方法結(jié)果顯示圖Fig.1 Result display diagram of the MH-Gd method

1.2.5 NH-AGID方法對M5和S2疫苗免疫抗體與感染抗體的鑒別診斷特異性 應(yīng)用公式計算:特異性(Sp)=未檢測出NH抗體血清數(shù)/疫苗免疫血清總數(shù)[12]。

2 結(jié) 果

2.1 疫苗免疫抗體陽性率 免疫后7 d～150 d內(nèi),對M5、S2疫苗組免疫羊進(jìn)行采血并分離血清,應(yīng)用RBT初篩、SAT確診檢測。SAT檢測結(jié)果表明布魯氏菌S2疫苗和M5疫苗免疫組的免疫抗體消長規(guī)律趨勢基本一致。M5和S2株免疫綿羊14 d后均可檢測到免疫抗體,且抗體陽性率最高;免疫60 d后免疫抗體陽性率呈現(xiàn)遞減趨勢。S2株疫苗口服組免疫動物在150 d時免疫抗體的血清學(xué)反應(yīng)均為陰性,約12%的M5株和S2株疫苗皮下注射接種動物在150 d時免疫抗體血清學(xué)反應(yīng)仍為陽性。SAT方法確診的免疫陽性血清結(jié)果見表2。

表2 布病M5和S2株疫苗免疫羊血清SAT檢測結(jié)果Tab.2 SAT test results for sheep serum immunized with the M5 and S2 strains of Brucella

2.2 M5疫苗免疫組NH-AGID試驗結(jié)果 應(yīng)用NH-AGID方法對M5疫苗免疫后7 d～150 d內(nèi)經(jīng)SAT確診為陽性的免疫血清樣品檢測結(jié)果表明:免疫后7 d～150 d內(nèi)NH-AGID方法對布魯氏菌M5株疫苗免疫陽性血清的LPS抗體檢出率為100%;NH抗體檢出率為8.3%～29.2%,表明M5株疫苗免疫羊免疫后7 d～150 d一直存在免疫動物排菌情況,其中免疫后14 d達(dá)最高為29.2%,近70%的免疫動物此時處于排菌狀態(tài)。該結(jié)果顯示綿羊?qū)5株疫苗有較強(qiáng)的免疫應(yīng)答。結(jié)果見表3。

表3 布病M5株疫苗免疫羊血清NH-AGID檢測結(jié)果Tab.3 NH-AGID test results for sheep serum immunized with the M5 strain of Brucella

2.3 S2疫苗免疫組NH-AGID試驗結(jié)果 應(yīng)用NH-AGID方法對S2疫苗免疫后7 d～150 d內(nèi)經(jīng)SAT確診為陽性的免疫血清樣品檢測結(jié)果表明:布魯氏菌S2株灌服免疫組免疫陽性血清與NH抗原呈陰性反應(yīng),檢測特異性為100%。LPS抗體檢出率為31.2%～66.7%,其中免疫后21 d LPS的檢出率最低僅為31.2%,近65%的S2免疫動物未檢出LPS抗體。

布魯氏菌S2株皮下注射免疫組免疫后60 d內(nèi),免疫陽性血清的NH抗體檢出率為4.5%～20%,表明S2株疫苗皮下注射組免疫后60 d內(nèi)存在免疫動物排菌現(xiàn)象;免疫后90～150 d NH抗體檢出率為0。LPS抗體檢出率為45.4%～100%。結(jié)果見表4。

表4 布病S2株疫苗免疫羊血清NH-AGID檢測結(jié)果Tab.4 NH-AGID test results for sheep serum immunized with the S2 strain of Brucella

2.4 NH-AGID方法特異性 共檢測M5疫苗免疫抗體陽性血清192份,檢出NH抗體血清數(shù)為33份,NH-AGID方法檢測M5疫苗免疫抗體與感染抗體的鑒別診斷特異性為82.8%。檢測S2疫苗免疫抗體陽性血清400份,檢出NH抗體血清數(shù)為14份,NH-AGID方法檢測S2疫苗免疫抗體與感染抗體的鑒別診斷特異性為96.5%。

3 討 論

生產(chǎn)實踐中因無法區(qū)分布魯氏菌病自然感染動物和免疫動物,造成部分假陽性動物誤殺,真陽性動物漏殺,不僅帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失,還嚴(yán)重阻礙了布魯氏菌病的凈化進(jìn)程。世界動物衛(wèi)生組織(World Organization for Animal Health,OIE)《陸生動物診斷試驗和疫苗手冊》指出,NH-AGID方法適用于布病免疫地區(qū)反芻動物的鑒別診斷。應(yīng)用該方法可甄別出畜群中的布魯氏菌病自然感染動物,為布魯氏菌病防控提供技術(shù)支撐。該方法中光滑型LPS抗原和天然半抗原(NH)大多從牛種和羊種布魯氏菌中獲得,是布魯氏菌抗原中的兩種重要檢測標(biāo)識物[13]。LPS抗原免疫原性強(qiáng),光滑型布魯氏菌均能刺激機(jī)體產(chǎn)生LPS抗體。NH抗原因缺少LPS的免疫核心位點(diǎn)使得其免疫原性較弱[14],布魯氏菌病感染動物在布魯氏菌活動期或排菌期可持續(xù)刺激機(jī)體產(chǎn)生NH抗體。NH-AGID方法應(yīng)用LPS抗原和NH抗原檢測血清中的抗體,由于LPS抗原分子量大、擴(kuò)散慢,在靠近中央抗原孔出現(xiàn)沉淀線;NH抗原分子量小、擴(kuò)散快,靠近被檢血清孔出現(xiàn)沉淀線。據(jù)此,可根據(jù)抗原擴(kuò)散速度差異而形成沉淀線位置不同來鑒別布魯氏菌感染抗體和疫苗免疫抗體。本研究應(yīng)用NH-AGID方法對M5株疫苗免疫陽性血清進(jìn)行檢測,LPS檢出率為100%,NH抗原對M5疫苗的免疫抗體部分呈陽性反應(yīng),NH抗體檢出率介于8.3%～29.2%。研究表明NH抗體的產(chǎn)生與布魯氏菌排出情況密切相關(guān)[15]。部分免疫M(jìn)5株疫苗血清檢出NH抗體,可能與M5疫苗毒力較強(qiáng)有關(guān)[16]。NH-AGID是否適用于M5疫苗抗體與感染抗體的鑒別診斷,尚需對該疫苗菌株的毒力、免疫途徑、免疫劑量等方面進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果顯示該方法應(yīng)用于M5疫苗免疫后的鑒別診斷特異性為82.8%。

通過灌服、皮下注射兩種不同免疫方式和免疫劑量對適齡羔羊進(jìn)行S2疫苗免疫接種,獲得S2疫苗免疫陽性血清,應(yīng)用NH-AGID方法進(jìn)行檢測,表明其對S2株疫苗免疫血清的鑒別診斷特異性為96.5%。S2疫苗灌服免疫后陽性血清與NH抗原呈陰性反應(yīng),其鑒別診斷特異性達(dá)100%。但與文獻(xiàn)報道NH-AGID方法能夠鑒別S2免疫背景下布病感染抗體和疫苗免疫抗體不同的是[17],S2疫苗皮下注射組免疫后部分陽性血清與NH抗原呈陽性反應(yīng),NH抗體檢出率為4.5%～20%。NH-AGID方法對S2疫苗兩種不同免疫方式獲得的陽性血清LPS抗體檢出率均低于M5疫苗免疫陽性血清的LPS抗體檢出率,究其原因,推測S2疫苗與牛、羊布魯氏菌的LPS抗原反應(yīng)原性可能存有差異。NH-AGID方法僅適用于反芻動物,LPS和NH抗原主要提取自光滑型牛、羊種布魯氏菌。該方法對豬種布魯氏菌S2疫苗中的LPS和NH抗體的反應(yīng)原性,以及豬種S2株跨宿主感染后的鑒別診斷特異性尚待進(jìn)一步研究證實。

本文研究結(jié)果表明,NH-AGID方法對我國現(xiàn)階段應(yīng)用的羊用布魯氏菌疫苗M5株和S2株的鑒別診斷應(yīng)用還存在一定缺陷。由于NH-AGID方法對免疫抗體與自然感染抗體的鑒別診斷能力與不同疫苗的免疫背景、疫苗毒力、免疫劑量、免疫途徑或其他等多方面因素相關(guān),因此還需進(jìn)一步研究并明確該方法在我國現(xiàn)有S2、M5疫苗免疫背景下的適用范圍和條件。NH-AGID方法可鑒別出布病感染且處于布魯氏菌活動期或排菌期的動物,有助于及時清除畜群中的布病傳染源,有效促進(jìn)動物布病的防控與凈化。同時布病防控應(yīng)采取多法并存、相互補(bǔ)充,以“One Health”為理念[18],從動物無疫、人類健康和環(huán)境生物安全角度出發(fā),切實推進(jìn)我國布病防控工作的順利進(jìn)行。

利益沖突:無

引用本文格式:劉麗婭,剡文亮,張子榮,等.布魯氏菌病M5、S2疫苗免疫血清半抗原-瓊脂擴(kuò)散試驗方法檢測評價[J].中國人獸共患病學(xué)報,2023,39(8):766-771. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2023.00.083