呂蔭宜,吳 雙,田 爽,廖國艷,杜云婷,陳 光

世界瘧疾報告指出,2021年約有2.47億人感染瘧疾,其中約619 000人死于嚴(yán)重并發(fā)癥[1]。盡管使用了包括青蒿素在內(nèi)的抗瘧藥物,嚴(yán)重瘧疾患者的死亡率仍然很高[2-3]。更深入的了解瘧疾感染宿主免疫系統(tǒng)和其他生理功能的平衡,對于制定有效干預(yù)措施以減少瘧疾相關(guān)發(fā)病率和嚴(yán)重并發(fā)癥至關(guān)重要[4]。然而,宿主與寄生蟲之間的相互作用和共同進化為安全有效的疫苗設(shè)計和預(yù)防耐藥提供了重要的背景知識。

長期研究發(fā)現(xiàn),宿主體內(nèi)所涉及的免疫信號通路以及疾病預(yù)后等過程中復(fù)雜的寄生蟲-宿主相互作用途徑和方式是感染性疾病防控的基礎(chǔ)[5]。高通量測序技術(shù)恰恰提供了獲得大量、全面、系統(tǒng)的病原體-宿主相互作用信息,從而使系統(tǒng)研究病原體-宿主相互作用以獲得對其整體理解成為可能。長鏈非編碼RNA (lncRNA) 長度大于200個核苷酸,雖然不編碼蛋白質(zhì),但其可以調(diào)節(jié)基因表達。目前,轉(zhuǎn)錄組學(xué)領(lǐng)域中l(wèi)ncRNAs 在宿主防御中的作用機制研究尚少。僅有的部分研究表明,lncRNAs參與了宿主免疫功能和抗感染能力的調(diào)節(jié)[6]。關(guān)于瘧原蟲感染宿主細胞時lncRNAs表達譜的變化特征無相關(guān)報道。

本研究利用二代測序技術(shù)分析了鼠源致死性約氏瘧原蟲P.y17XL(Plasmodiumyoelii17XL)感染誘導(dǎo)的lncRNAs表達譜特征改變及其對瘧疾感染宿主免疫調(diào)節(jié)的影響,探討lncRNAs表達譜變化與瘧疾感染進程和結(jié)局的相關(guān)性,確定瘧原蟲-宿主相互作用調(diào)控抗瘧免疫的潛在機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑來源及分組 6～8周齡的雌性BALB/c小鼠購自動物研究所(中國北京)。動物在 22 ℃～24 ℃和(50±5)% 濕度下保持12 h明暗循環(huán)。鼠源致死性約氏瘧原蟲(Plasmodiumyoelii17XL,P.y17XL)由Motomi Torii 博士(日本愛媛大學(xué)醫(yī)學(xué)院分子寄生蟲學(xué)系)提供。所有實驗均按照當(dāng)?shù)貏游飩惱砦瘑T會的要求進行。將小鼠隨機分為正常組和P.y17XL感染組。腹腔感染1×106P.y17XL寄生紅細胞,動態(tài)進行小鼠尾靜脈采血,制備薄血膜,Giemsa染色,監(jiān)測原蟲血癥水平及生存率。固定時間點用異氟醚(0.6～0.8 L/min)麻醉小鼠取出脾臟,然后通過頸椎脫臼法處死所有小鼠。所有動物實驗均經(jīng)臺州學(xué)院動物實驗委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號:TZXY2019-501)。所有動物均按照《實驗動物管理條例》(1988.11.1)處死和人道對待。

1.2 LncRNA測序生物信息學(xué)分析

1.2.1 生物信息學(xué)分析流程 小鼠脾臟的RNA分離、文庫制備和測序在北京諾禾致源公司完成,流程如圖1。

圖1 生物信息學(xué)分析流程Fig.1 Process of bioinformatics analysis

1.2.2 LncRNAs差異表達譜及聚類分析 差異表達分析使用ballgown。從統(tǒng)計學(xué)意義的角度上考慮,將不同類型轉(zhuǎn)錄本 (lncRNA, TUCP和mRNA)整體進行差異分析,若分析中包含數(shù)據(jù)庫注釋的lncRNA,進一步將 lncRNA分為已知Annotated_lncRNA 和未知Novel_lncRNA。使用Bioconductor 軟件包,進行層次聚類分析,調(diào)整后的P<0.05或P<0.05的轉(zhuǎn)錄本被指定為差異表達,不同顏色的區(qū)域代表不同聚類分組信息,同組內(nèi)表達模式相近,可能具有相似的功能或參與相同的生物學(xué)過程。

1.2.3 LncRNA 共表達靶向mRNA預(yù)測 LncRNAs沒有編碼基因的潛力,它們通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因發(fā)揮作用。目前,lncRNA與mRNA相互作用的潛在機制尚不清楚,lncRNA的生物學(xué)功能是通過其與蛋白質(zhì)編碼基因的共定位和共表達來預(yù)測的。采用Pearson相關(guān)系數(shù)法分析樣本間lncRNAs與mRNAs的相關(guān)性,取相關(guān)性絕對值大于0.95的mRNAs基因進行功能富集分析預(yù)測lncRNAs的主要功能。

1.2.4 差異表達 lncRNAs 靶基因GO和KEGG通路富集分析 LncRNAs通過調(diào)控mRNAs的表達來實現(xiàn)其功能。目前,lncRNAs與mRNAs相互作用的機制尚未明確,我們通過其與蛋白編碼基因的共表達相關(guān)性(co-expression)預(yù)測 lncRNAs的生物學(xué)功能。將與共表達中差異表達的lncRNAs基因分別進行GO和 KEGG富集分析和蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析。GoSeq R包用于差異表達基因或lncRNAs靶基因的GO富集分析,以糾正基因長度偏差[7]。P<0.05的GO基因被認為在差異表達基因中顯著富集。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 本實驗采用SPSS17.0進行統(tǒng)計學(xué)分析。使用Bioconductor軟件包,進行層次聚類分析,調(diào)整后的P<0.05或P<0.05的轉(zhuǎn)錄本被指定為差異表達。采用Pearson相關(guān)系數(shù)法分析數(shù)據(jù),檢驗水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1P.y17XL感染BALB/c小鼠的感染率和生存率 如圖2所示,P.y17XL感染的BALB/c小鼠于感染后第6 d原蟲血癥水平高達39%～49%,所有小鼠均死亡(圖 2A、2B)。

圖2 P.y17XL感染小鼠紅細胞感染率(A)與小鼠生存率(B)Fig.2 Parasitemia (A) and survival rate (B) of P.y17XL-infected BALB/c mice

2.2P.y17XL感染的BALB/c小鼠LncRNAs表達譜差異分析 我們使用火山圖分析了lncRNAs的差異表達(圖3A)。與正常對照組相比,P.y17XL感染的BALB/c小鼠中l(wèi)ncRNAs的表達上調(diào)132個,下調(diào)159個。本實驗采用聚類分析確定不同轉(zhuǎn)錄物的表達模式,將不同實驗組中不同轉(zhuǎn)錄本的FPKM值作為表達水平,進行層次聚類分析。不同顏色用于表示來自不同實驗組的分組信息,同一組內(nèi)相似的表達模式可能具有相似的功能或參與相同的生物學(xué)過程,在本研究中,與正常對照組小鼠相比,P.y17XL感染后 lncRNAs表達譜發(fā)生顯著性差異表達(圖3B)。

圖3 火山圖(A)和熱圖(B)分析P.y17XL感染的BALB/c小鼠lncRNAs差異表達Fig.3 Differential expression of lncRNAs in BALB/c mice infected with P.y17XL, displayed as a volcano plot and heatmap

2.3 LncRNAs 靶向mRNAs預(yù)測 我們通過對lncRNAs共表達的mRNAs基因進行功能富集分析,預(yù)測了瘧原蟲感染相關(guān)的差異lncRNAs的主要功能(表1)。

2.4 差異表達lncRNAs靶基因的GO和KEGG富集分析 GO分析發(fā)現(xiàn)12個差異表達 lncRNAs的富集,主要參與了“生物過程”、“細胞成分”和“分子功能”,且在“生物過程”和“細胞成分”中富集更為顯著,如分子功能的正向調(diào)節(jié)、磷代謝過程的調(diào)節(jié)和囊泡的調(diào)節(jié)(圖4A)。KEGG通路富集分析進一步確定上述差異表達lncRNAs的潛在生物學(xué)功能,預(yù)測相關(guān)免疫學(xué)信號通路和分子相互作用。氣泡圖顯示了富集途徑,其中包括瘧疾、TGF-β信號通路和細胞因子-細胞因子受體相互作用(圖 4B)。

圖4 P.y17XL感染的BALB/c小鼠差異表達lncRNA靶基因的GO(A)和KEGG(B)富集分析Fig.4 GO and KEGG enrichment analysis of differentially expressed lncRNA target genes in BALB/c mice infected with P.y17XL

2.5 差異表達的lncRNAs靶向免疫相關(guān)信號通路分析 根據(jù)KEGG分析結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn)12個差異表達的lncRNAs與總富集于瘧疾、TGF-β信號通路、TNF信號通路和Toll樣受體信號通路的蛋白編碼基因共表達。為了進一步闡明12個差異表達的lncRNAs 在瘧疾中的調(diào)控功能,我們確定了通路圖中差異表達基因的分布(圖 5)。這些結(jié)果提示12個差異表達的lncRNA靶基因通過調(diào)節(jié)免疫相關(guān)信號通路參與瘧疾感染的發(fā)生發(fā)展。

3 討 論

瘧原蟲在宿主體內(nèi)難以清除主要與逃避人體免疫系統(tǒng),并利用宿主的反應(yīng)作為生理信號來調(diào)節(jié)生命周期,使其迅速適應(yīng)宿主環(huán)境密切相關(guān)[8]。因此,寄生蟲和宿主之間的相互作用對于寄生蟲在生命周期的各個階段建立感染和毒力是至關(guān)重要的。LncRNAs參與了多個物種之間的相互作用,例如載體-宿主-病原體相互作用。 LncRNAs 既可以是載體/宿主衍生的,也可以是由病原體編碼的[9]。LncRNAs 作為基因表達的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,參與大多數(shù)細胞過程。為了探究瘧疾感染中l(wèi)ncRNAs表達譜特征,我們采用RNA-seq方法分析了P.y17XL感染的BALB/c小鼠差異表達的lncRNAs。結(jié)果發(fā)現(xiàn)132個上調(diào)和159個下調(diào)的lncRNAs與瘧原蟲感染相關(guān)(圖3)。作為廣泛調(diào)節(jié)細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達的新興介質(zhì),lncRNAs越來越受到關(guān)注。研究中檢測到了一部分寄生蟲感染后參與調(diào)控免疫相關(guān)基因的lncRNAs。LncRNAs在寄生蟲入侵宿主過程中具有關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。LncRNAs調(diào)節(jié)寄生蟲和宿主中的基因轉(zhuǎn)錄、mRNA穩(wěn)定性和翻譯以及免疫反應(yīng)[10]。我們預(yù)測了這些差異表達lncRNAs的潛在靶向mRNAs,以便通過與蛋白質(zhì)編碼基因的共表達來分析lncRNAs的生物學(xué)功能。 GO和KEGG富集分析顯示,差異表達的lncRNAs參與了宿主免疫反應(yīng)、細胞增殖、代謝和疾病相關(guān)轉(zhuǎn)錄物表達的調(diào)控,其中我們發(fā)現(xiàn)與瘧疾感染中TGF-β信號通路、TNF信號通路和Toll樣受體信號通路相關(guān)的明顯差異表達的lncRNAs包括3個已知的和9個未知的lncRNAs,分別是ENSMUST00000146154.1、ENSMUST00000181191.1、ENSMUST00000202081.1、LNC_000258、LNC_000871、LNC_000962、LNC_002093、LNC_004354、LNC_006284、LNC_004518、LNC_004350和LNC_003730。雖然我們鑒定的一些lncRNAs可能是由其他因素誘導(dǎo)的,但它們?nèi)匀挥锌赡艹蔀榀懺x感染誘導(dǎo)免疫過程中的關(guān)鍵因素。

研究發(fā)現(xiàn),瘧原蟲感染誘導(dǎo)的lncRNAs差異表達通過免疫相關(guān)信號通路改變了瘧疾感染后宿主的免疫反應(yīng)特征(圖5)。寄生蟲和宿主之間蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用是寄生蟲持續(xù)存在于宿主體內(nèi)的前提條件[11]。在長期的協(xié)同進化過程中,寄生蟲可以通過復(fù)雜的通信來調(diào)控宿主免疫系統(tǒng),從而使寄生蟲能夠控制宿主的生理功能和免疫穩(wěn)態(tài),有利于寄生蟲在宿主體內(nèi)的生存[12]。

圖5 P.y17XL感染小鼠的差異表達lncRNAs基因分布Fig.5 Distribution of differentially expressed lncRNA genes in P.y17XL infected mice

LncRNAs在免疫學(xué)領(lǐng)域研究是一個新興的熱點,有限的研究發(fā)現(xiàn),lncRNAs作為一種新型調(diào)節(jié)劑,參與調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)中的相關(guān)基因表達。LncRNAs通過一種高度譜系特異性的方式調(diào)節(jié)免疫細胞功能和分化特征來調(diào)控染色質(zhì)、RNA和蛋白質(zhì)的作用[13]。本研究結(jié)果表明,瘧原蟲感染顯著改變了宿主lncRNAs的表達譜特征,可能與瘧疾感染過程和感染結(jié)局密切相關(guān)。因此,lncRNAs是瘧原蟲與宿主免疫系統(tǒng)交流的橋梁。在后續(xù)研究中,我們需要驗證與免疫學(xué)相關(guān)基因表達相關(guān)的特定lncRNAs在瘧疾感染中的特異性功能。

利益沖突:無

引用本文格式:呂蔭宜,吳雙,田爽,等.約氏瘧原蟲P.y17XL感染小鼠長鏈非編碼RNA表達譜特征分析[J].中國人獸共患病學(xué)報,2023,39(8):733-738. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2023.00.079