顏 旭,關舒會,饒欽雄,張其才,陳珊珊,宋衛(wèi)國*

(1 上海海洋大學食品學院,上海 201306;2 上海市農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準與檢測技術研究所,上海 201403)

壬基酚(Nonylphenol,NP)作為一種有毒的異生化合物,常被用作精細化工中間體,是壬基酚聚氧乙烯醚(Nonylphenol ethoxylates,NPEOs)的主要合成物和降解產(chǎn)物,還被用作制造清潔劑、農(nóng)藥助劑、樹脂穩(wěn)定劑、潤滑油添加劑等[1-2]。 作為典型的內(nèi)分泌干擾物(Endocrine disrupting chemicals,EDCs)之一,NP 具有類雌激素活性和生物毒性[3]。 蔬菜可能是對人類有害的NP 的潛在來源。 根據(jù)任杰等[4]的研究,分析了從?？谑须S機抽取的5 種蔬菜,發(fā)現(xiàn)均有4-NP 檢出,白菜和油菜的檢出率為100%,含量為1.26—8.58 μg∕kg。 張濤等[5]抽取了長沙市61 種市售蔬菜,檢測了4 種類雌激素含量,結(jié)果顯示壬基酚的檢出率最高,含量為4.92—90.96 ng∕g。 在蔬菜中已有NP 檢出,嚴重影響食品安全及消費者健康。 因而,開發(fā)準確、靈敏的食品中NP 檢測方法具有現(xiàn)實意義。

蔬菜中壬基酚的含量分析常采用固相萃取(Solid phase extraction,SPE)方法凈化,液相色譜(HPLC)或高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)聯(lián)用測定[6]。 閆冬良等[7]建立了SPE-HPLC 方法,測定芹菜中4-壬基酚在內(nèi)的6 種環(huán)境雌激素,檢出限為3.7—6.3 μg∕L,平均加標回收率在89.60%—97.13%。 She 等[8]通過石墨化炭黑串聯(lián)N-丙基乙二胺(PSA) 管固相萃取凈化,結(jié)合液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法(HPLC-MS∕MS)測定了蔬菜中4-NP 在內(nèi)的NPEOs 及其殘留物含量,添加回收率為65%—118%,相對標準偏差為1.1%—6.2%。 實際樣品檢測中,為了降低基質(zhì)效應,提高測定準確性,減少對儀器損害,樣品前處理顯得至關重要[1,9]。 PSA 作為前處理中應用廣泛的吸附材料,但不能被回收利用[10]。 相對成熟的新型吸附材料如碳納米管[11]、石墨烯[12]具有優(yōu)異的吸附性能,也被用于樣品的前處理凈化。 此外硅酸鹽類吸附劑來源廣泛、價格低廉[13]。 趙潔等[14]利用球磨法制備了多孔的硅酸鎂吸附材料,對水中亞甲基藍的最大吸附量為280 mg∕g。 通過一步水熱法引入硅酸鈉、和鎂鹽對天然凹凸棒進行改性,對Cu2+和亞甲基藍的最大吸附量分別為527.22 mg∕g 和210.64 mg∕g[15]。 Navickiene 等[16]評估了硅酸鎂在分散固相萃取凈化,結(jié)合GC-MS∕MS 聯(lián)合測定啤酒中的15 種農(nóng)藥殘留的應用,結(jié)果表明硅酸鎂是一種有效的替代凈化材料,方法具有準確性、可靠性的同時降低了成本。 硅酸鹽類吸附劑在廢水中染料、重金屬吸附,前處理領域已被證實具有良好的性能,但是對壬基酚的應用研究還未見報道。

本研究通過溶膠-凝膠法制備具有良好吸附性能、更具經(jīng)濟效益的新型硅酸鎂(MS-1∶6)作為固相萃取填料,優(yōu)化洗脫液和洗脫體積,考察重復利用性和對蔬菜中壬基酚的凈化效果,以期建立一種更具經(jīng)濟效益的蔬菜中4-NP 檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

ACQUITY UPLC 超高效液相色譜儀(美國Waters 公司);AB 5500 型三重四極桿質(zhì)譜儀(美國ABSCIEX 公司);MX-S 渦旋儀(美國賽洛捷克公司);萬分之一電子分析天平(上海Ohaus 公司);NEVAP-12 氮吹儀(美國Organomation 公司);CQ-250-DST 超聲波清洗器(上海躍進醫(yī)用光學器械廠);D-37520 低溫高速離心機(美國Thermo 公司);蔬菜粉碎機(中山市歐麥斯電器有限公司);Ultra 系列超純水(上海首立實業(yè)有限公司);GM-0.1A 負壓抽濾裝置(天津市津騰實驗設備有限公司)。

4-壬基酚(99%)、硝酸(AR)購自上海麥克林生化科技有限公司;氨水、乙腈、丙酮、正己烷、甲醇(HPLC 級,德國Merck 公司);氯化鈉(AR,上海愛彼化學試劑有限公司);九水硅酸鈉(GR)、氯化鎂(99%)、氫氧化鈉(96%)、鹽酸(AR)購自國藥集團化學試劑有限公司;多層氧化石墨烯(GO 98%,上海源葉生物科技有限公司);氨基化多壁碳納米管(AMNCTs 95%,上海阿拉丁試劑有限公司);N-丙基乙二胺(PSA 40 μm,上海安捷倫科技有限公司)。 試驗用水均為超純水。

1.2 4-NP 標準曲線和添加樣品制備

標準儲備溶液(5 000 mg∕L):準確稱量0.50 g 4-NP 溶于50 mL 的棕色容量瓶,用甲醇充分溶解并定容。

標準中間溶液(50 mg∕L):用甲醇稀釋4-NP 標準儲備溶液。

標準使用液(10 mg∕L):取標準儲備液0.1 mL 于50 mL 的棕色容量瓶,超純水定容,充分混勻。

溶劑標準曲線和基質(zhì)標準曲線:分別用乙腈和蔬菜基質(zhì)提取液將4-NP 稀釋成0.01 mg∕L、0.05 mg∕L、0.1 mg∕L、0.25 mg∕L、0.5 mg∕L 的不同濃度的標準工作溶液。

標準儲備溶液于-18 ℃冰箱中儲存,保質(zhì)期6 個月,其余溶液4 ℃冰箱中儲存,保質(zhì)期3 個月。 配制標準使用液和標準工作溶液時保證甲醇處于較低含量( ＜2‰),以避免共溶劑效應。

考慮到不同蔬菜基質(zhì)中的干擾物成分不同對殘留分析的影響,選取5 種具有代表性的蔬菜:白菜(十字花科植物)、四季豆(豆科植物)、生菜(菊科植物)、黃瓜(葫蘆科植物)、洋蔥(百合科植物),購自當?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場,并進行空白樣品4-NP 含量測定。 5 種蔬菜中加入適量中間濃度標準溶液,添加水平為10 μg∕kg、50 μg∕kg、100 μg∕kg,每組5 個重復。

1.3 吸附材料

1.3.1 溶膠-凝膠法制備硅酸鎂

硅酸鎂現(xiàn)用現(xiàn)制,具體方法為:在水浴持續(xù)攪拌下,通過向0.5 mol∕L 九水硅酸鈉溶液中相同濃度的氯化鎂溶液,控制鎂∕硅比例為1∶6。 混勻之后,用鹽酸和氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH,在水浴條件下繼續(xù)攪拌2 h,放置陳化12 h,傾出上層溶液,用去離子水洗滌,去除雜質(zhì)和氯離子,烘箱60 ℃烘干,研磨,編號MS-1∶6,待用。

1.3.2 吸附性能考察

在25 ℃、35 ℃、45 ℃條件下,準確稱取6 mg 的吸附材料,分別置于一組含有30 mL(10 mg∕L)4-NP 溶液的琥珀色玻璃瓶中,恒溫氣浴振蕩,間隔相應時間取樣(0 min、5 min、10 min、20 min、30 min、60 min、90 min、120 min、240 min、300 min),使用0.22 μm 的濾膜分離吸附劑和吸附質(zhì)。 利用超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀測定吸附質(zhì)濃度,所有試驗平行進行3 次,每個試驗數(shù)據(jù)由平均值獲得。 按照公式計算吸附量:

其中,qt(mg∕g)是t時每單位量吸附劑吸附的4-NP 的量,C0是4-NP 的初始濃度,Ce是t時4-NP 溶液的濃度,V是4-NP 溶液體積,m是吸附劑的投加量。

1.4 分析方法

1.4.1 樣品的提取與凈化

提取方法參考張其才等[17],將蔬菜勻漿后,準確稱取5.00 g(精確到0.01 g)于50 mL 塑料離心管中,加入20 mL 乙腈,渦旋提取2 min,超聲提取10 min,加入氯化鈉5 g,振蕩1 min,于8 000 r∕min 下離心5 min;取上清液5 mL 于試管中,待凈化。

分別稱取200 mg 的MS-1∶6、GO、AMCNTs、PSA 均勻裝填入商品SPE 柱管(3 mL),自上而下分別是墊片、吸附劑、墊片。 5 mL 乙腈,5 mL 超純水負壓預淋洗SPE 柱。 將待凈化溶液上樣到SPE 柱,固相萃取儀負壓下以1 mL∕min 的流速通過SPE 柱,接收上樣液,另加入5 mL 乙腈洗脫,氮氣吹干,加入1 mL 乙腈復溶,過0.22 μm 有機濾膜轉(zhuǎn)移至進樣小瓶中,外標法定量測定。

1.4.2 儀器條件

色譜柱:Waters BEH C18 色譜柱(2.1 mm×50 mm,1.7 μm);流速0.35 mL∕min,流動相A 相為甲醇,B 相為0.1%氨水。 梯度洗脫程序:0—2.0 min,30% A,70% B;2.0—5.5 min 95% A;5.5—6.0 min,30%A,70% B。 進用量2 mL,柱溫40 ℃。

質(zhì)譜條件:采用電噴霧負離子源掃描(ESI -);多反應監(jiān)測模式(MRM);離子化電壓5 kV;溫度500 ℃;噴霧氣55 μL∕min;氣簾氣35 μL∕min;4-NP 母離子為219.3 m∕z,定性離子對為133.0∕147 m∕z,定量離子為133.0 m∕z,碰撞能量為-38 eV∕-37 eV。

1.4.3 方法確定

主要包括:基質(zhì)效應、線性、檢出限、定量限及方法的準確度和精密度。

2 結(jié)果與分析

2.1 合成硅酸鎂的吸附性能

為了考察MS-1∶6對4-NP 的吸附性能,建立吸附量(mg∕g)與時間的關系曲線,在25 ℃、35 ℃、45 ℃3 個溫度下進行。 如圖1 所示,MS-1∶6表現(xiàn)出優(yōu)異的吸附性能,25 ℃下對4-NP 的最大吸附量為30.84 mg∕g。 隨著溫度的升高,4-NP 的吸附量逐漸降低,表明在較低溫度下有利于MS-1∶6對4-NP 的吸附,可以滿足常溫條件下對樣品的SPE 凈化要求。

圖1 溫度對4-NP 吸附量的影響Fig.1 Effect of temperature on adsorption of 4-NP

2.2 合成硅酸鎂SPE 柱凈化方法的優(yōu)化

為了得到最佳凈化結(jié)果,得到合適的洗脫溶劑。 以50 μg∕kg 乙腈溶液上樣,比較了10 mL 甲醇、乙腈、丙酮和正己烷∶丙酮(1 ∶9)4 種不同極性的有機溶劑洗脫效果,結(jié)果見圖2A,乙腈的平均回收率(103%)高于甲醇(76%)、丙酮(51.5%)和正己烷∶丙酮(1∶9)(42.6%)。 在此基礎上,選擇乙腈作為活化-洗脫溶劑。

圖2 洗脫溶劑(A)和用量(B)對4-NP 回收率的影響Fig.2 Effect of types of eluent(A) and volume of eluent(B) on the recovery of 4-NP

在50 μg∕kg 添加濃度下,比較了2 mL、5 mL、10 mL、15 mL、20 mL 乙腈用量對4-NP 洗脫回收率的影響。 結(jié)果見圖2B,在洗脫液為2 mL 時,平均回收率為60%,洗脫液為5 mL 時,對4-NP 的回收率接近100%。 繼續(xù)增大洗脫液體積后,回收率也趨于穩(wěn)定。 從經(jīng)濟效果和減少氮吹時間的方面考慮,選取5 mL的乙腈用量進行洗脫。

2.3 多種材料凈化效果的比較

作為凈化中常用的吸附材料,PSA 主要吸附方式為靜電吸附,氨基是主要吸附功能基[18];GO 具有高比表面積,豐富的表面含氧基團等特點,具有較好的吸附性能[19]。 凈化材料不同,凈化程度的強弱不同,從而影響回收率[20]。 因此,在上述優(yōu)化后的洗脫條件下,采用固相萃取作為前處理凈化方法,研究了MS-1∶6與現(xiàn)有商業(yè)吸附材料、N-丙基乙二胺(PSA)對4-NP 的基質(zhì)效應的影響。 選用白菜作為代表基質(zhì),在50 μg∕kg 添加濃度下,對5 mL 乙腈提取液進行凈化,結(jié)果見圖3A,經(jīng)過SPE 凈化后的平均回收率為GO(102.52%) ＞MS-1∶6(87.20%) ＞AMCNTs(85.10%) ＞PSA(79.60%)。 相比于其他材料,MS-1∶6在價格上更具明顯優(yōu)勢[PSA 56 元(人民幣,下同)∕g,GO 300 元∕g,AMCNTs 119.8 元∕g,MS-1∶6 0.2 元∕g]。 因此,新型MS-1∶6作為固相萃取柱填料進行樣品4-NP 凈化,經(jīng)濟可行,但需要進一步方法學考察。

圖3 4 種吸附材料凈化后4-NP 的基質(zhì)效應(A)固相萃取小柱的循環(huán)使用(B)Fig.3 Matrix effect of 4-NP purified by four adsorption materials(A) and recycle of SPE cartridge(B)

2.4 固相萃取小柱循環(huán)使用

固相萃取柱的循環(huán)使用性是衡量材料應用的重要指標之一,選用白菜作為代表基質(zhì),在50 μg∕kg 的4-NP 添加濃度下,進行重復吸附-解析循環(huán)6 次,考察所填充的小柱的可重復使用性能。 在最優(yōu)的條件下進行吸附-洗脫,一個循環(huán)結(jié)束后,將小柱放于氮氣流下吹干,以減少試驗誤差。 如圖3B 所示,在經(jīng)過6 次的重復使用后,回收率大于80%,在蔬菜中4-NP 的前處理中具有較好的應用前景。

2.5 方法學考察

2.5.1 基質(zhì)效應、線性、檢出限與定量限

通過溶劑標準曲線斜率(msolvent)和基質(zhì)標準曲線斜率(mmatrix)來計算基質(zhì)效應(Matrix effect,ME)。ME=mmartix∕msolvent,基質(zhì)效應為0.8—1.2 時可接受[17,21]。 本試驗評估3 種蔬菜的基質(zhì)效應,結(jié)果見表1。3 種蔬菜都表現(xiàn)出基質(zhì)減弱效應,基質(zhì)效應均小于0.8,因此本研究采用的是基質(zhì)標準工作溶液進行外標法定量。 在10—500 μg∕L 范圍內(nèi),質(zhì)量濃度與峰面積之間呈良好的線性關系,決定系數(shù)均不低于0.999。以3 倍信噪比(S∕N)作為4-NP 測定濃度的檢出限(LOD),以10 倍信噪比(S∕N)作為4-NP 測定濃度的定量限(LOQ)。 在白菜、生菜、洋蔥3 種基質(zhì)中的方法檢出限分別為0.6 μg∕kg、0.8 μg∕kg、0.6 μg∕kg,定量限為2 μg∕kg。

表1 3 種蔬菜中4-NP 的基質(zhì)效應、線性、檢出限和定量限Table 1 Matrix effect,linearity,LOD and LOQ of 4-NP in three vegetables

2.5.2 方法回收率和精密度

方法準確性與精密度用回收率和變異系數(shù)衡量。 表2 結(jié)果顯示了最優(yōu)條件下4-NP 在5 種蔬菜基質(zhì)中的添加回收率和相對標準偏差。 在10 μg∕kg 的添加水平下,5 種蔬菜中4-NP 回收率為84.13%—103.42%,相對標準偏差(RSD)為3.54%—7.81%;在50 μg∕kg 的添加水平下,5 種蔬菜中4-NP 回收率為85.64%—106.56 %,相對標準偏差(RSD)為4.41%—10.86 %;在100 μg∕kg 的添加水平下,5 種蔬菜中4-NP 回收率為94.36%—102.27%,相對標準偏差(RSD)為1.5%—7.13%。 綜上所述,4-NP 回收率和相對標準偏差符合食品中壬基酚測定的再現(xiàn)性要求。 該方法具有較好的回收率和重現(xiàn)性,滿足復雜樣品中痕量物質(zhì)的分析要求,能夠應用于蔬菜中NP 的測定。

表2 4-NP 在5 種蔬菜中的平均添加回收率及相對標準偏差(n=5)Table 2 Average addition recoveries and RSDs of 4-NP added to five vegetables(n=5) %

2.6 方法比對

將本研究與近年來已報道的對食品及食品包裝材料的檢測方法進行比較,結(jié)果見表3。 本方法溶劑消耗量低于常規(guī)檢測方法,節(jié)省了檢測成本。 無需內(nèi)標,無需衍生化處理,方法簡單,易操作。 采用負壓下SPE 凈化,減少了前處理時間。 檢出限與其他液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢出限相近,低于其他檢測方法,表明該方法具有較高靈敏度,可以滿足蔬菜等低脂肪含量食品中的4-NP 測定。

表3 本研究與已報道的方法比較Table 3 This study compared with other reported method

3 結(jié)論與討論

本研究合成一種硅酸鎂吸附材料,采用負壓SPE 凈化模式,液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析,建立了蔬菜中4-NP 的檢測方法。 對4-NP 具有較好的吸附效果,凈化效果優(yōu)于傳統(tǒng)凈化材料(PSA),略高于AMCNTs,低于GO。 具有較高成本優(yōu)勢,為GO 的1∕1 500,AMCNTs 的1∕600,PSA 的1∕280。 5 種蔬菜中4-NP 回收率為88.63%—106.82%,RSD 為1.5%—10.86%,檢出限為0.6—0.8 μg∕kg,定量限為2 μg∕kg,滿足蔬菜中壬基酚的測定要求。

黃榮榮等[28]在樣品中加入同位素內(nèi)標后,經(jīng)Carb∕NH2固相萃取柱凈化,平均回收率為87.9%—98.0%。 馬啟明等[29]采用凝膠滲透色譜柱(GPC)凈化,收集14—17 min 組分旋轉(zhuǎn)蒸干,對奶粉中4-NP回收率為87.3%—96.5%,本流程較為簡單,減少溶劑消耗,并且回收率較高。 本研究建立MS-1∶6固相萃取凈化方法對蔬菜中4-NP 檢測具有較高回收率,提高效率,并且減少溶劑的使用,方法靈敏度高,操作簡單,具有廣泛的應用前景。