和 敏 ，毛 姍 ，李 琳 ，倪海峰 ，都青鈺 ，于永杰 ，3，4，張 霞 ，3，4#（.寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，銀川 750004；.寧夏啟元藥業(yè)有限公司，銀川 7500；3.寧夏藥物創(chuàng)制與仿制藥研究重點實驗室，銀川 750004；4.寧夏少數(shù)民族醫(yī)藥現(xiàn)代化教育部重點實驗室，銀川 750004）

金蓮清熱顆粒是依據(jù)中醫(yī)理論，在漢代名醫(yī)張仲景《傷寒論》中的“白虎湯”和清代名醫(yī)吳鞠通《溫病條辨》中的“增液湯”基礎(chǔ)上加減化裁而成，具有清熱解毒、生津利咽、止咳祛痰的功效[1—2]。方中金蓮花、大青葉為君藥，能清熱解毒；知母、石膏為臣藥，能清熱瀉火、除煩止渴，使高燒速降；玄參、生地為佐藥，能養(yǎng)陰清熱、潤燥、除煩；苦杏仁為使藥，可宣肺止咳化痰。2020年版《中國藥典》僅以牡荊苷的含量作為金蓮清熱顆粒的質(zhì)量控制指標[3]，而本品由7 味中藥組成，成分復(fù)雜，僅使用單一化學(xué)成分作為質(zhì)量控制指標，難以全面準確控制其內(nèi)在質(zhì)量。近年來，對多個指標成分進行檢測分析已成為中藥質(zhì)量控制的發(fā)展方向[4]，但部分中藥成分的化學(xué)對照品分離難度大，而且對多個指標成分進行控制也會增加檢測成本。

一測多評（quantitative analysis of multi-components by single marker，QAMS）法是選擇一個有效成分為內(nèi)參物，構(gòu)建其他成分與內(nèi)參物之間的相對校正因子（relative correction factors，RCF），通過測定一個有效成分的含量，可實現(xiàn)多成分的同時測定[5—9]。但目前中藥QAMS 法存在重復(fù)研究的現(xiàn)象，即相同的分析對象、相同的待測成分，在不同的研究中選用不同的內(nèi)參物重復(fù)建立RCF。由于RCF 的建立需要對全部對照品溶液進行測定，這種情況造成了資源浪費，違背了QAMS 法建立的初衷[10]?；诖?，本研究以金蓮花中藥理作用明確且含量較高的3個成分葒草苷、葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、牡荊苷分別作為內(nèi)參物，建立可同時測定金蓮清熱顆粒中6種成分（分別是君藥金蓮花的活性成分葒草苷、葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、牡荊苷、藜蘆酸，臣藥知母的活性成分芒果苷，佐藥玄參的活性成分哈巴俄苷）含量的QAMS 法，并與外標法（external standard method，ESM）的測定結(jié)果進行比較，以期為該制劑質(zhì)量的全面評價及質(zhì)量標準提升奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有XS105DU 型分析天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）、Prominenece LC-20A 型高效液相色譜儀（日本Shimadzu 公司）、1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）、TGL-16G型高速離心機（上海安亭科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

金蓮清熱顆粒（國藥準字Z20023308）購自寧夏啟元藥業(yè)有限公司，共21批（編號S1～S21）。芒果苷對照品（批號111607-201704）購自中國食品藥品檢定研究院；葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、葒草苷、藜蘆酸、牡荊苷對照品（批號分別為P01O11F126428、S19GB161663、DN1127BA13、D29GB172870，純度均不低于98%）均購自上海源葉生物科技有限公司；哈巴俄苷對照品（批號PS000404，純度≥98%）購自成都普思生物科技股份有限公司；乙腈為色譜純，色譜分析用水為娃哈哈純凈水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液的制備

取金蓮清熱顆粒樣品，研細，精密稱取粉末約0.5 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量；超聲（功率250 W，頻率33 kHz）30 mim，取出放冷后，用溶劑補足減失的質(zhì)量，搖勻；取適量，以10 000 r/min離心10 min，取上清液作為供試品溶液。

2.1.2 混合對照品溶液的制備

分別精密稱取芒果苷、葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、葒草苷、藜蘆酸、牡荊苷和哈巴俄苷對照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為1.000、1.000、0.420 0、0.350 0、0.232 0、1.000 mg/mL的對照品儲備液；精密吸取上述對照品儲備液適量置于同一5 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋并定容，搖勻，得質(zhì)量濃度分別為24.00、160.0、210.0、35.00、46.40、16.00 μg/mL的混合對照品溶液。

2.1.3 陰性供試品溶液的制備

按照金蓮清熱顆粒的處方比例和提取、干燥、成型等工藝條件，分別制備缺金蓮花、缺知母、缺玄參的陰性樣品，按“2.1.1”項下方法制備各陰性供試品溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱為Agilent Eclipse Plus C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，97%B；5～15 min，97%B→95%B；15～25 min，95%B→90%B；25～91 min，90%B→68%B）；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測波長為270 nm；進樣量為10 μL。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適用性考察

取“2.1”項下混合對照品溶液、供試品溶液、各陰性供試品溶液適量，按照“2.2”項下色譜條件進樣測定，結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示，各成分色譜峰的分離度均符合要求，理論板數(shù)均大于5 000，陰性供試品分別在各成分的保留時間處無干擾。

圖1 系統(tǒng)適用性考察的高效液相色譜圖

2.3.2 線性關(guān)系考察

取“2.1.2”項下混合對照品溶液適量，經(jīng)倍比稀釋后按照“2.2”項下色譜條件進樣檢測，記錄芒果苷、葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、葒草苷、藜蘆酸、牡荊苷和哈巴俄苷的峰面積。將各對照品的質(zhì)量濃度作為橫坐標（x），峰面積作為縱坐標（y），進行線性回歸，結(jié)果見表1。

表1 6種化合物的線性關(guān)系考察結(jié)果

2.3.3 精密度試驗

取“2.1.2”項下混合對照品溶液適量，按“2.2”項下色譜條件連續(xù)進樣6 次，記錄芒果苷、葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、葒草苷、藜蘆酸、牡荊苷和哈巴俄苷的峰面積。結(jié)果顯示，上述6 個成分峰面積的RSD 分別為0.40%、0.53%、0.27%、0.31%、0.24%、0.38%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗

精密稱取同批金蓮清熱顆粒樣品（編號S21），根據(jù)“2.1.1”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，按標準曲線計算含量。結(jié)果顯示，芒果苷、葒草素-2″ -O-β-L-半乳糖苷、葒草苷、藜蘆酸、牡荊苷、哈巴俄苷的平均含量分別為0.34、2.13、2.40、0.21、0.68、0.12 mg/g，RSD 分別為1.25%、1.80%、1.65%、1.16%、1.38%、0.79%（n＝6），表明該方法重復(fù)性較好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗

精密稱取同批金蓮清熱顆粒樣品（編號S21），根據(jù)“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，分別在室溫放置0、2、4、8、12、24 h 時按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，芒果苷、葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、葒草苷、藜蘆酸、牡荊苷和哈巴俄苷峰面積的RSD 分別為0.79%、0.66%、0.43%、0.75%、1.77%、0.60%（n＝6），表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗

取已知含量的同批金蓮清熱顆粒樣品6 份，每份約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入相當于樣品中各成分含量100%的對照品溶液，根據(jù)“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，計算加樣回收率。結(jié)果顯示，芒果苷、葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、葒草苷、藜蘆酸、牡荊苷和哈巴俄苷的平均加樣回收率分別為99.7%、96.4%、94.6%、101.2%、96.0%、98.1%，RSD分別為3.00%、0.69%、1.20%、3.30%、1.90%、2.50%（n＝6），表明該方法準確度良好。

2.4 待測成分與不同內(nèi)參物的RCF的建立

2.4.1 RCF的計算

本實驗采用多點校正法計算RCF[11]，即根據(jù)“2.3.2”線性關(guān)系考察項下葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、葒草苷、牡荊苷3 個成分6 個質(zhì)量點的峰面積和進樣量，依據(jù)公式RCF＝fi/fs＝（Wi/Ai）/（Ws/As） ＝ （Wi×As）/（Ws×Ai）計算分別以上述3 個成分作為內(nèi)參物時，另外5 個待測成分與內(nèi)參物的RCF。公式中fs、fi分別為內(nèi)參物與待測成分的絕對校正因子，As、Ws分別為內(nèi)參物的峰面積和質(zhì)量，Ai、Wi分別為待測成分的峰面積和質(zhì)量。結(jié)果顯示，以上述3 個成分作為內(nèi)參物時，另外5 個待測成分與內(nèi)參物的RCF的RSD均小于2.00%（n＝6）。結(jié)果見表2。

表2 不同內(nèi)參物的RCF計算結(jié)果（n＝6）

2.4.2 RCF重現(xiàn)性考察

取“2.1.2”項下混合對照品溶液適量，按“2.2”項下色譜條件，分別采用Agilent Eclipse Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Shimadzu InertSustain C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent Zorbax SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以不同型號的高效液相色譜儀（Prominenece LC-20A 型高效液相色譜系統(tǒng)、Agilent 1260 型高效液相色譜系統(tǒng)）進行分析，計算分別以葒草素-2″-Oβ-L-半乳糖苷、葒草苷、牡荊苷作為內(nèi)參物時，另外5 個待測成分與內(nèi)參物的RCF。結(jié)果顯示，以葒草素-2″-Oβ-L-半乳糖苷、葒草苷、牡荊苷3個成分分別作為內(nèi)參物時，另外5 個待測成分與內(nèi)參物的RCF 的RSD 均小于5.00%（n＝6），表明RCF的重現(xiàn)性良好。

2.5 待測成分色譜峰的定位

記錄“2.4.2”項下使用2 種高效液相色譜系統(tǒng)、3 種色譜柱測定的各成分色譜峰保留時間，計算以葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、葒草苷、牡荊苷3 個成分分別作為內(nèi)參物時，另外5個待測成分與內(nèi)參物的相對保留時間。結(jié)果顯示，以葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、葒草苷、牡荊苷3 個成分分別作為內(nèi)參物時，另外5 個待測成分與內(nèi)參物的相對保留時間的RSD均小于3.00%（n＝6），表明采用不同色譜柱和色譜系統(tǒng)時各成分相對保留時間波動較小。

2.6 QAMS與ESM含量測定結(jié)果比較

取金蓮清熱顆粒樣品21批，分別按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，分別采用ESM 和QAMS 法（以葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、葒草苷、牡荊苷分別作為內(nèi)參物）計算含量，并通過計算差異百分比[PD＝| QAMS 結(jié)果－ESM 結(jié)果 |×2/（QAMS結(jié)果＋ESM 結(jié)果）×100%]比較2 種方法所得結(jié)果[12]。結(jié)果顯示，以葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、葒草苷、牡荊苷中任一化學(xué)成分作為內(nèi)參物時，采用QAMS法計算21批金蓮清熱顆粒中6 個成分含量的RSD 均小于2.00%，與ESM 測定結(jié)果的PD 均不大于4.00%，表明本研究構(gòu)建的QAMS法準確可靠，可在3個內(nèi)參物中任何一個對照品存在的情況下，同時測定金蓮清熱顆粒中6個成分的含量。結(jié)果見表3。

表3 金蓮清熱顆粒中6個成分含量的ESM和QAMS法測定結(jié)果（mg/g，n＝2）

3 討論

相關(guān)研究表明，金蓮清熱顆粒采用超聲提取法和索氏提取法制備供試品溶液的效果相近，均優(yōu)于回流提取法[13]，且超聲提取法所需時間較短，操作相對簡單便捷，因此本研究選取超聲提取法制備樣品。本研究還考察了不同提取溶劑（水、甲醇、乙醇）對供試品溶液制備的影響，結(jié)果表明，以甲醇為溶劑時各成分提取率最高；進一步比較了甲醇體積分數(shù)（30%、50%、70%）、提取時間（20、30、40、50 min）和提取溶劑用量（10、25、50、100 mL）的影響，最終確定金蓮清熱顆粒供試品溶液的制備方法為：精密稱定金蓮清熱顆粒粉末0.50 g，加入50%甲醇溶液25 mL超聲提取30 min。

本研究還考察了不同流動相組成（甲醇-水、乙腈-水、甲醇-甲酸、乙腈-磷酸）的洗脫分離效果，結(jié)果顯示，以乙腈-0.1%磷酸溶液作為流動相時，各成分的色譜峰分離較好。金蓮清熱顆粒中含有多味藥材，成分復(fù)雜，筆者前期采用光電二極管陣列檢測器對供試品溶液進行了全波長掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在270 nm波長處，6個成分均有較好吸收，色譜峰分離較好，理論板數(shù)符合要求。筆者還考察了柱溫（25、30、35 ℃）和流速（0.9、1.0、1.1 mL/min）的變化對各待測成分色譜峰分離度、相對保留時間和RCF 的影響，結(jié)果顯示，上述2 個因素的變化均無顯著影響。

綜上所述，本研究建立了基于多種內(nèi)參物同時測定金蓮清熱顆粒中6 種成分含量的QAMS 法，該方法與ESM所得結(jié)果無明顯差異，可用于金蓮清熱顆粒的質(zhì)量控制。