丁嘉儀 鄧宇慧 李國豪 朱婉瑢 劉希華

摘要：鉛污染是當前土壤重金屬污染亟待解決的難題之一，利用微生物與樹木的互作來修復鉛污染土壤是一個行之有效的方法。為了給利用植物內(nèi)生細菌提升植物修復鉛污染土壤效率提供支持，以毛竹的芽和葉為材料，分離耐鉛內(nèi)生細菌，采用生理分析和分子鑒定相結合的方法，對分離到的菌種進行鑒定。結果發(fā)現(xiàn)，在不同鉛離子濃度的脅迫下，從毛竹芽和葉組織中分離出27株內(nèi)生細菌，革蘭氏染色和VP實驗均為陽性。過氧化氫酶實驗中，24株表現(xiàn)為陽性（+），3株為陰性（－）；甲基紅實驗測定結果為陽性（++）4株、弱陽性（+）20株、陰性（－）3株。對細菌提取DNA，并PCR擴增16S rDNA序列，通過BLAST比對分析，并用MEGA軟件建立發(fā)育樹等分子鑒定手段，初步推斷分離得到的內(nèi)生細菌為假單胞菌屬、蠟樣芽孢桿菌和不動桿菌屬。

關鍵詞：毛竹; 鉛；內(nèi)生細菌；植物修復

中圖分類號：Q938? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：A? ? ? ? ? ? ? ? 文章編號：2097-2172（2023）08-0740-05

doi：10.3969/j.issn.2097-2172.2023.08.011

Isolation and 16S rDNA Identification of Pb-resistant Endophytic Bacteria Isolated from Phyllostachys pubescens

DING Jiayi 1， 2， DENG Yuhui 2， 3， LI Guohao 1， 2， ZHU Wanrong 1， 4， LIU Xihua 1， 2

（1. Fujian Provincial Key Laboratory of Resources and Environment Monitoring and Sustainable Management and Utilization，

Sanming Fujian 365004， China; 2. School of Resources ＆ Chemical Engineering， Sanming University，

Sanming Fujian 365004， China; 3. The Seventh Middle School of Datian County， Datian Fujian

366100， China; 4. Strait Institute， Sanming Fujian 365004， China）

Abstract： Lead pollution is one of the difficult problems to be solved urgently in soil heavy metal pollution at present. It is an effective method to repair lead-contaminated soil by interaction between microorganisms and trees. In this paper， the lead-tolerant endophytic bacteria from the stems and leaves of Phyllostachys pubescens were isolated and purified， and the strains were identified by physiological analysis and molecular identification. Results showed that a total of 27 endophytic bacteria were isolated under different concentrations of lead stress， which were positive by Gram staining and VP test， 24 strains were positive （+） and 3 strains were negative （-） in catalase test. The results of methylene red test showed that 4 strains were positive （++）， 20 strains were weak positive （+） and 3 strains were negative（-）， and the 16S rDNA sequence was amplified by PCR. By means of molecular identification methods such as BLAST， comparative analysis and establishment of phylogenetic tree with MEGA software， it was preliminarily inferred that the endophytic bacteria isolated were Pseudomonas， Bacillus cereus and Acinetobacter.

Key words： Phyllostachys pubescens， Lead， Endophytic bacteria， Phytoremediation

收稿日期：2022 - 12 - 13；修訂日期：2023 - 06 - 23

基金項目：福建省自然基金面上項目（2020J01375）；福建省資源環(huán)境監(jiān)測與可持續(xù)經(jīng)營利用重點實驗室開放課題（ZD202103）；國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目（CA220241）；福建省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目（S202311311071）。

作者簡介：丁嘉儀（2001? — ），女，寧夏石嘴山人，本科，研究方向為生物技術。Email： 1930966866@qq.com。

通信作者：劉希華（1978? — ），男，福建閩清人，副教授，博士，研究方向為土壤重金屬污染的生物修復。Email：xihua7808@163.com。

由于人類活動的影響和缺乏適當?shù)墓芾?，土壤的有毒金屬污染成為全球范圍?nèi)最嚴重的環(huán)境問題之一。污染土壤的重金屬種類較多，以鉛（Pb）污染最為嚴重，其次為鉻（Cr）、砷（As）、鋅（Zn）、鎘（Cd）、銅（Cu）和汞（Hg），可見鉛污染的問題更是亟待解決。土壤一旦被鉛污染，鉛就會長期存在于土壤中而不被生物降解，且經(jīng)不斷積累并通過食物鏈轉移到生物系統(tǒng)中，最終毒害人類和其他動物的健康［1 - 3 ］。目前應用的物理和化學的方法雖然可以修復鉛污染土壤，但這些方法一般成本較高，且會對土壤生物活性、土壤結構和肥力產(chǎn)生不利影響［4 ］。利用植物修復是解決土壤中鉛污染的另一種選擇，因為它成本不高且有效、環(huán)保，而且是就地修復，具有良好的公眾接受度［1 ］。植物的穩(wěn)定化利用，即利用植物來固定或減少土壤中重金屬的流動性，以防止污染物遷移到地下水或進入食物網(wǎng)，目前正受到廣泛關注。但鉛離子對植物，特別是草本植物有毒性，使植物生長受到抑制，這降低了植物從土壤中去除污染物的效率［5 ］。于是，一些生物量大、生長速度快、能有效積累重金屬、具有經(jīng)濟價值的植物被建議作為植物修復最佳材料［6 ］。快速生長的樹木雖然可以用于土壤污染修復，并作為能源獲得經(jīng)濟收益，但鉛離子會對樹木幼苗產(chǎn)生傷害，從而影響其在污染土壤中的生長［5 ］。近年來的研究表明，一些植物生長促進菌（plant growth promoting bacteria， PGPB）可以通過刺激植物激素（生長素、細胞分裂素、赤霉素等）的合成來輔助寄主植物，并通過產(chǎn)生鐵團、增磷和固氮效應來緩解營養(yǎng)缺乏，還可通過細胞外沉淀、細胞內(nèi)積累、隔離和酶解毒（如氧化/還原）降低重金屬的生物毒性［7 ］。此外，接種PGPB還可提高成年植物體內(nèi)重金屬的積累和轉運能力［8 ］。

毛竹（Phyllostachys pubescens）在中國的種植面積占全部竹子的70%［9 ］。與其他竹種相比，毛竹在適應環(huán)境條件、生長速度快、多用途、生態(tài)價值高等方面具有優(yōu)越的屬性［10 ］。有文獻報道，毛竹可以生長在鉛鋅礦尾砂地區(qū)，說明它可能對這些異常高濃度的Pb具有某種特殊的耐受機制［11 ］。我們從毛竹的葉和芽2個部位分離出耐鉛內(nèi)生細菌，并采用生理分析和分子鑒定相結合的方法，對分離到的菌種進行了鑒定，以期為利用植物內(nèi)生細菌提升植物修復鉛污染土壤效率提供支持。

1? ?材料與方法

1.1? ?供試材料

供試材料為毛竹的芽與葉新鮮組織，采自三明市三元區(qū)三明學院，其母株長勢良好、無病蟲害。供試培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基［12 ］，培養(yǎng)基鉛濃度分別配制為0、0.3、0.6、0.9、1.2 mmol/L。

1.2? ?毛竹內(nèi)生細菌的分離及鑒定

分離與生理生化分析：毛竹內(nèi)生細菌的分離參照劉希華等［12 ］的方法，并對分離得到的菌株進行革蘭氏染色、接觸酶反應、檸檬酸鹽反應、吲哚試驗和甲基紅實驗檢驗。分子鑒定：采用3S柱離心式環(huán)境樣品DNA回收試劑盒V2.2提取分離菌株基因組DNA，以通用引物8f（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3）和1492r（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3）（上海華大基因）進行PCR擴增。退火溫度為52 ℃。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物?；厥? 800 bp左右的PCR產(chǎn)物并連接到pMD19-T Vector，挑取陽性克隆送往上海華大基因公司測序。序列經(jīng)BLAST進行最大相似性比對，用Clustal X 1.83進行同源性分析，用來自MEGA（7.0）的Neighbor-Joining（NJ）法構建系統(tǒng)發(fā)育樹［13 ］。

2? ?結果與分析

2.1? ?內(nèi)生菌的分離

將毛竹芽、葉新鮮組織經(jīng)表面消毒處理后，用無菌水淋洗，取組織表面的無菌水涂布培養(yǎng)檢測，無菌落長出，說明組織表面消毒徹底。將消毒后的毛竹芽、葉組織接種到鉛濃度不同的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，共分離到27株內(nèi)生細菌（編號為S1-27），其中從芽組織中分離到15株，從葉組織中分離到12株（表1）?？梢?，分離到的內(nèi)生菌菌株數(shù)量與所接種的毛竹器官類型和培養(yǎng)基的鉛濃度沒有明顯的關聯(lián)。

2.2? ?形態(tài)學與生理指標

通過肉眼觀察，分離得到的菌株單菌落均呈圓形，乳白色，輪廓光滑。經(jīng)革蘭氏染色、顯微鏡觀察，所有菌株均為G+菌，其形態(tài)為桿狀。過氧化氫酶實驗中，24株為陽性（+），3株為陰性（－）；甲基紅實驗測定結果表明，4株為陽性（++）、20株為弱陽性（+）、3株為陰性（－）。分離得到的27株內(nèi)生細菌的VP實驗結果均為陽性（+）（表2）。

2.3? ?內(nèi)生菌株的16S rDNA基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構建

提取甲基紅實驗、VP實驗結果和過氧化氫實驗結果不一致的S1、S2、S3、S5、S18和S27等毛竹內(nèi)生細菌的DNA，分別擴增各菌株的16SrDNA序列，送上海華大基因公司測序。對測序結果經(jīng)兩兩BLAST分析結果表明，這些內(nèi)生細菌有3種不同序列，其中S1與S5序列相同，S2和S27序列相同，S3和S18序列相同。經(jīng)判斷，16S rDNA序列相同的為同1個菌種。對S1、S2和S3構建系統(tǒng)發(fā)育樹，將這3段序列置入NCBI數(shù)據(jù)庫，經(jīng)過BLAST檢索，分別找到了與之相似性最高的種屬。

將毛竹內(nèi)生細菌菌株與其同源性較高的菌株16SrDNA序列利用MEGA（7.0）程序包構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。經(jīng)對系統(tǒng)發(fā)育樹分析，可初步推斷S5為假單胞菌屬（Pseudomonas SP.）、S17為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、S43為不動桿菌屬（Acinetobacter SP.）。

3? ?討論與結論

相關研究表明，微生物在植物生長發(fā)育中發(fā)揮著重要作用，同時植物與微生物的共生可以有效改善土壤質量和養(yǎng)分循環(huán)，因此接種經(jīng)過篩選和馴化的微生物可以顯著提高植物對受污染土壤的修復效率［14 - 15 ］。本研究在不同鉛離子濃度的脅迫下，從毛竹芽和葉組織中分離出27個耐鉛內(nèi)生菌菌株，革蘭氏染色和VP實驗均為陽性。過氧化氫酶實驗中，24株表現(xiàn)為陽性（+），3株為陰性（－）；甲基紅實驗測定結果為陽性（++）4株、弱陽性（+）20株、陰性（－）3株。通過生理生化以及16S rDNA的分子鑒定，確定共獲得3個不同的菌株，并推斷3個菌株分別屬于假單胞菌屬、蠟樣芽孢桿菌屬和不動桿菌屬。

有研究者指出，芽孢桿菌的鐵載體可以通過與10種不可用形式的Fe3+形成絡合物，并將它們改變?yōu)榭捎糜谥参镂盏姆绞絹泶龠M植物生長［16 ］。假單胞菌是可以從根組織中分離出的5個最常見的可培養(yǎng)內(nèi)生細菌種類之一，是廣為人知的植物伴生細菌，具有許多PGPB性質，也是一種抗鉛植物生長促進細菌，可用于植物修復［17 ］。因此，對這兩類菌的定植能力，以及它們對鉛的吸附能力進行研究，將有助于提高微生物與樹木聯(lián)合修復重金屬污染土壤技術水平。

參考文獻：

［1］ ALI H， KHAN E， SAJAD M A. Phytoremediation of heavy metals--concepts and applications［J］.? Chemosphere， 2013， 91（7）： 869-881.

［2］ FAHR M， LAPLAZE L， BENDAOU N， et al. Effect of lead on root growth［J］. Front Plant Sci， 2013， 4： e00175.

［3］ YANG Y， HUANG B， XU J， et al.? Heavy metal domestication enhances beneficial effects of arbuscular mycorrhizal fungi on lead（Pb） phytoremediation efficiency of Bidens parviflora through improving plant growth and root Pb accumulation［J］.? Environ Sci Pollut Res Int， 2022， 29（22）： 32988-33001.

［4］ ZHI-XIN N， SUN L N， SUN T H， et al. Evaluation of phytoextracting cadmium and lead by sunflower， ricinus， alfalfa and mustard in hydroponic culture［J］.? J Environ Sci （China），? 2007， 19（8）： 961-967.

［5］ PULFORD I D， WATSON C. Phytoremediation of heavy metal-contaminated land by trees--a review［J］.? Environment International， 2003， 29（4）： 529-540.

［6］ SELAMAT S N， ABDULLAH S R， IDRIS M. Phytoremediation of lead （Pb） and arsenic（As） by Melastoma malabathricum L. from contaminated soil in separate exposure［J］.? Int J Phytoremediation， 2014， 16（7-12）： 694-703.

［7］ LIU C， LIN H， LI B， et al. Endophyte Pseudomonas putida enhanced Trifolium repens L. growth and heavy metal uptake： A promising in-situ non-soil cover phytoremediation method of nonferrous metallic tailing［J］.? Chemosphere， 2021， 272： e129816.

［8］ BAN Y， XU Z， YANG Y， et al.? Effect of dark septate endophytic fungus Gaeumannomyces cylindrosporus on plant growth， Photosynthesis and Pb Tolerance of Maize （Zea mays L.）［J］.? Pedosphere， 2017， 27（2）： 283-292.

［9］ 袁宗勝.? 福建毛竹冬筍營養(yǎng)品質地域性差異分析［J］.? 江西農(nóng)業(yè)學報，2013，25（9）：31-33.

［10］ 郭起榮，張元慶.? 毛竹分子輔助選擇育種工作展望［J］.? 江西農(nóng)業(yè)大學學報，2001（3）：379-383.

［11］ LIU D， LI S， ISLAM E， et al. Lead accumulation and tolerance of Moso bamboo（Phyllostachys pubescens） seedlings： applications of phytoremediation［J］.? J Zhejiang Univ Sci B， 2015， 16（2）： 123-130.

［12］ 劉希華，江丹丹，文? ?欣.? 小飛蓬耐鉛內(nèi)生細菌的分離及其16S rDNA鑒定［J］.? 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2018，

46（4）：260-262.

［13］ THOMPSON J D， GIBSON T J， PLEWNIAK F， et al. The CLUSTAL_X windows interface： flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools［J］. Nucleic Acids Research， 1997， 25（24）： 4876-4882.

［14］ FAN M， LIU Z， NAN L， et al. Isolation， characterization， and selection of heavy metal-resistant and plant growth-promoting endophytic bacteria from root nodules of Robinia pseudoacacia in a Pb/Zn mining area［J］.? Microbiol Res， 2018， 217： 51-59.

［15］ JEBARA S H， SAADANI O， FATNASSI I C， et al. Inoculation of Lens culinaris with Pb-resistant bacteria shows potential for phytostabilization［J］.? Environ Sci Pollut Res Int， 2015 ，22（4）： 2537-2545.

［16］ SHIN M N， SHIM J， YOU Y， et al. Characterization of lead resistant endophytic Bacillus sp. MN3-4 and its potential for promoting lead accumulation in metal hyperaccumulator Alnus firma［J］.? J Hazard Mater， 2012， 199-200： 314-320.

［17］ BABU A G， SHEA P J， SUDHAKAR D， et al. Potential use of Pseudomonas koreensis AGB-1 in association with Miscanthus sinensis to remediate heavy metal（loid）-contaminated mining site soil［J］.? Journal of Environmental Management， 2015， 151： 160-166.