魏 煒,趙之璧,袁雅姝

(沈陽建筑大學(xué)市政與環(huán)境工程學(xué)院,遼寧 沈陽 110168)

玉米秸稈在農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物中占比較大[1-2],簡單焚燒會造成大氣污染和資源浪費(fèi),纖維素是玉米秸稈細(xì)胞壁的主要成分,結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜,質(zhì)地結(jié)實(shí)緊密[3],傳統(tǒng)的物理和化學(xué)方法對秸稈降解的效率不高,而生物法降解可以彌補(bǔ)上述不足[4-5]。高云航等[6]從牛糞中篩選出一株纖維素酶活性較高的菌株N12。高兆明等[7]從廈門紅樹林泥樣中篩選到一株纖維素酶產(chǎn)生菌G21。李君君[8]針對茶粕進(jìn)行研究,從土壤、樹葉和腐爛的樹葉中篩選出了L-1、L-2、L-3、L-4、L-5和L-6纖維素降解菌株。魯雄[9]以甘蔗渣為唯一碳源,從廈門溫泉樣品中篩選出熱穩(wěn)定纖維素產(chǎn)生菌XM70。王巖等[10-11]以農(nóng)村自然堆肥堆秸稈還田土為菌源,在15 ℃低溫的培養(yǎng)條件下成功篩選出單菌54株。景如賢等[12]采取克氏碘液染色法從常年落葉的土壤中分離出高效降解菌。纖維素分解菌的篩選與鑒定是決定能否實(shí)現(xiàn)秸稈高效轉(zhuǎn)化為葡萄糖的關(guān)鍵。因此,筆者以沈陽地區(qū)的土樣為原料,利用剛果紅染色法從中篩選出降解性能相對較好的兩種菌株并進(jìn)行鑒定,通過紫外-微波復(fù)合誘變篩選出降解性能更好的菌株,并對產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化,為提升降解秸稈菌的性能提供了理論依據(jù)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 秸稈及土樣

實(shí)驗(yàn)秸稈采自沈陽市張官橋下河畔處的玉米田,大多數(shù)秸稈已經(jīng)腐爛,并被降解風(fēng)干成碎屑狀。實(shí)驗(yàn)土樣采自沈陽建筑大學(xué)景觀稻田、古樹下,張官橋下玉米田、菜地,以及天柱山下等自然環(huán)境土壤。

1.2 主要試劑、培養(yǎng)基及儀器設(shè)備

試劑:濃度為0.05 mol/L,pH為4.8的醋酸緩沖液;CMC-HAc緩沖液;DNS試劑[13];質(zhì)量濃度為1 g/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。

培養(yǎng)基:富集培養(yǎng)液[14];羧甲基纖維素鈉分離篩選培養(yǎng)基;剛果紅纖維素瓊脂培養(yǎng)基[15];濾紙條液體培養(yǎng)基[16];羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基。

儀器設(shè)備:烘箱;恒溫震蕩培養(yǎng)箱;鼓風(fēng)干燥箱;高速多功能粉碎機(jī);高壓蒸汽滅菌鍋;冰箱;高速離心機(jī);電磁爐;生物顯微鏡等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

菌株形態(tài)學(xué)鑒定采用革蘭氏染色法[17]并參考菌株鑒定手冊;菌株分子學(xué)鑒定采用細(xì)菌16SrDNA序列測序的方法。

采用Van Soest分析法測定纖維素降解率。

羧甲基纖維素(CMC)酶活力和濾紙(FPA)酶活力的測定依據(jù)下式:

(1)

式中:A為CMC或FPA酶活力,U/mL;C為還原糖質(zhì)量濃度,g/L;X為稀釋倍數(shù),取25;V為總酶液體積,取10 mL;T為作用時間,取30 min;V1為參與反應(yīng)的酶液體積,取0.5 mL;M為葡萄糖分子量,180。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選及鑒定

2.1.1 菌株的初篩

表1為7株纖維素降解菌透明圈直徑D、菌落直徑d及其比值。

表1 7株纖維素降解菌透明圈及菌落直徑Table 1 Clear circle and colony diameter of 7 cellulose degrading bacteria

選取D/d值相對較大的菌株Ⅰ、菌株Ⅳ、菌株Ⅴ和菌株Ⅵ4種菌株進(jìn)行濾紙條斷裂實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)15 d的斷裂情況如表2所示,其中菌株Ⅰ在第6 d開始斷裂;菌株Ⅳ和菌株Ⅴ雖然在前9 d斷裂程度一樣,但菌株Ⅳ在12 d斷裂程度更深,菌株Ⅴ在12 d沒有變化?？梢?菌株Ⅰ、菌株Ⅳ降解性相對較好。

表2 4株降解菌的濾紙條斷裂情況Table 2 Break of filter paper of 4 strains of degrading bacteria

選取濾紙條斷裂情況較好的菌株Ⅰ、菌株Ⅳ進(jìn)行剛果紅液體驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),5 d后觀察發(fā)現(xiàn):菌株Ⅰ液體底部有大量紅色沉淀,液體顏色變透明;菌株Ⅳ液體底部有少量紅色沉淀,液體顏色變淺,仍有少量顏色。可見,菌株Ⅰ對纖維素的降解性最好、菌株Ⅳ次之。

2.1.2 菌株Ⅰ的復(fù)篩

初篩并不足以說明降解性能的優(yōu)劣,還需要測定酶活力和降解率加以驗(yàn)證,測得的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Glucose standard curve

實(shí)驗(yàn)分別測出菌株Ⅰ、菌株Ⅳ、菌株Ⅴ的CMC酶活力、FPA酶活力、吸光度及產(chǎn)糖量,將測定的吸光度值代入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線中求出還原糖含量,用酶活力公式求出酶活力值,測得的纖維素降解率如表3所示,可以看出,菌株Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ的CMC酶活力分別是1.050 U·mL-1、0.917 U·mL-1、0.858 U·mL-1;FPA酶活力分別為0.942 U·mL-1、0.810 U·mL-1、0.800 U·mL-1;纖維素降解率分別為22.09%、15.73%、14.23%。由此可見,無論是CMC和FPA酶活力,還是降解率,菌株Ⅰ都是最優(yōu)的,與初篩的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

表3 CMC和FPA酶活力及降解率測定結(jié)果Table 3 Results of CMC and FPA enzyme activity and degradation rate determination

2.1.3 菌株Ⅰ的16SrDNA分子學(xué)鑒定

對菌株Ⅰ進(jìn)行基因組DNA提取、16S擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物的檢測,然后進(jìn)行純化、測序,最后進(jìn)行Ncbi-Blast比對分析,完成16S rDNA基因分子鑒定。圖2為對纖維素降解性能最好的菌株Ⅰ的16S rDNA同源性系統(tǒng)發(fā)育樹。根據(jù)Blast分析結(jié)果,菌株Ⅰ與Streptomyces sp.FZ92親緣關(guān)系最近,達(dá)到99.93%;菌株Ⅳ與Streptomyces rubiginosus親緣關(guān)系最近,達(dá)到99.65%,由此初步判定菌株Ⅰ為鏈霉菌。

圖2 菌株Ⅰ的16S rDNA同源性的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of the 16S rDNA homology of strain I

2.2 菌株Ⅰ的紫外誘變育種

2.2.1 菌株Ⅰ的紫外誘變及初篩結(jié)果

制備孢子濃度為 1.0×108個/mL的菌懸液,置于紫外燈下進(jìn)行常規(guī)處理,設(shè)定照射時間分別為20 s,40 s,60 s,100 s,120 s;在不同照射時間取樣,在涂布過程中避免被光照射,置于40 ℃培養(yǎng)箱,暗培養(yǎng)24 h,再見光培養(yǎng)48 h。紫外照射產(chǎn)生的影響如圖3所示。

圖3 紫外誘變的影響Fig.3 The influence of ultraviolet mutagenesis

從圖3可以看出,孢子的致死率隨著紫外線照射時間的延長而增加,當(dāng)照射時間增至60 s、80 s、120 s時,致死率分別為78%、85%和98%,選擇80s為最佳照射時間進(jìn)行篩選。選取D1/d1較大的6株菌種,分別命名為SF1、SF2、SF3、SF4、SF5、SF6,進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵復(fù)篩實(shí)驗(yàn)。

2.2.2 菌株Ⅰ的紫外誘變復(fù)篩結(jié)果

表4為紫外誘變后的復(fù)篩結(jié)果?？梢钥闯?菌株經(jīng)過紫外誘變后,不論是CMC和FPA酶活力,還是對纖維素的降解效率,都有所提升,尤其是菌株SF3對纖維素的降解率達(dá)到29.37%,與未誘變相比提升了7.28%,因此選用菌株SF3進(jìn)行復(fù)合誘變實(shí)驗(yàn)。

表4 菌株Ⅰ的微紫外誘變復(fù)篩結(jié)果Table 4 Rescreening results of strain I by UV mutagenesis

2.3 菌株SF3的紫外-微波復(fù)合誘變育種

菌株SF3的復(fù)合誘變時間對孢子的影響如圖4所示。根據(jù)圖4結(jié)果,選擇1 min作為微波誘變時間進(jìn)行復(fù)合誘變。

圖4 復(fù)合誘變時間對孢子的影響Fig.4 Effect of compound mutagenesis time on spores

經(jīng)紫外-微波復(fù)合誘變后的復(fù)篩結(jié)果如表5所示。從表5中可以看出,菌株經(jīng)過復(fù)合誘變后,不論是對CMC和FPA酶活力,還是對纖維素降解效率的影響,與單獨(dú)紫外誘變和未誘變相比都有了極大的提升,尤其是菌株SF3-3對纖維素的降解率達(dá)到40.21%,與未誘變相比提升了18.12%,與單獨(dú)紫外誘變相比提升了10.84%,且通過重復(fù)固態(tài)發(fā)酵,其穩(wěn)定性較好,對纖維素的降解率始終保持在30.57%～40.21%。由此可見,紫外-微波復(fù)合誘變與傳統(tǒng)的單獨(dú)誘變相比效果更好。SF3-3可作為復(fù)合誘變產(chǎn)生的新菌株進(jìn)行產(chǎn)酶條件優(yōu)化。

表5 紫外-微波復(fù)合誘變菌株的復(fù)篩結(jié)果Table 5 Results of re-screening of UV-microwave combination mutagenic strains

2.4 產(chǎn)酶條件優(yōu)化

2.4.1 不同溫度對酶活力的影響

溫度直接影響到菌株的生理活性。一般真菌的最佳發(fā)酵溫度在25 ℃左右,細(xì)菌在30 ℃左右。因此,設(shè)定實(shí)驗(yàn)溫度分別為20 ℃、25 ℃、28 ℃、30 ℃、35 ℃。將菌株接種于pH為7.0的50 mL培養(yǎng)基中,分別在以上溫度條件下130 r/min振蕩培養(yǎng)4 d,制備粗酶液,測定CMC及FPA活力,結(jié)果如圖5所示。

圖5 溫度對CMC和FPA酶活力的影響Fig.5 Effect of temperature on CMC and FPA enzume activity

由圖5可知,溫度對CMC和FPA酶活力影響較大,在其他條件相同時,CMC和FPA酶活力均呈先升高后降低的趨勢。當(dāng)溫度達(dá)到28 ℃,CMC和FPA酶活力均達(dá)到最大值,分別為1.996 U/mL和1.951 U/mL,在此溫度下,菌株的酶促反應(yīng)速率達(dá)到較高,產(chǎn)酶條件達(dá)到最佳。在低于25 ℃和高于30 ℃時,由于溫度較為極端導(dǎo)致菌株部分酶失活變性,在一定程度上抑制了CMC和FPA的酶活力,尤其是在20 ℃時CMC和FPA酶活力均達(dá)到最低值,分別為1.184 U/mL和1.126 U/mL。因此可將后續(xù)實(shí)驗(yàn)的溫度設(shè)置為28 ℃。

2.4.2 不同培養(yǎng)基初始pH值對酶活力的影響

培養(yǎng)基初始pH值改變產(chǎn)酶效果的機(jī)理是由于pH可以改變菌株細(xì)胞內(nèi)部的電荷量,在一定程度上影響了酶的構(gòu)造及酶促反應(yīng)的速率。設(shè)定發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0,將培養(yǎng)過夜的菌種分別接種于50 mL培養(yǎng)基中,再分別在28 ℃條件下,130 r/min振蕩培養(yǎng)4 d后制備粗酶液,測定CMC及FPA酶活力,圖6為測定結(jié)果。

圖6 pH對CMC和FPA酶活力的影響Fig.6 Effect ofpH on CMC and FPA enzume activity

由圖6可知,培養(yǎng)基初始pH值對CMC和FPA的酶活力的影響較大,從圖中可以看出,在其他條件都相同的情況下,CMC和FPA酶活力呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢,且不同pH下的酶活力差異也比較顯著,因此表明培養(yǎng)基初始pH對菌株的CMC和FPA酶活力影響較大。當(dāng)pH值呈酸性時,酸性越強(qiáng)酶活力越低,當(dāng)pH為4.0時,CMC和FPA酶活力達(dá)到酸性條件下也是整體條件下的最低值,分別為1.260 U/mL和1.126 U/mL;當(dāng)pH升高至中性時,酶活力有了明顯的提高,其中當(dāng)培養(yǎng)基初始pH值達(dá)到7.0時,CMC和FPA酶活力達(dá)到最大分別為2.072 U/mL和1.871 U/mL;繼續(xù)升高pH達(dá)到堿性時,酶活力逐漸降低,直到pH達(dá)到9.0時,CMC和FPA酶活力達(dá)到堿性條件下的最低值,分別為1.753 U/mL和1.646 U/mL。由此可見,酸性條件下對菌株酶活力的影響程度要強(qiáng)于堿性。最適培養(yǎng)基初始pH值為7.0。

2.4.3 不同接種量對酶活力的影響

將菌株分別按1%、2%、4%、6%、8%、10%的接種量接種于50 mL、初始pH值為7.0的培養(yǎng)基中,在28 ℃、130 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)4 d后取發(fā)酵液,測定CMC及FPA活力,以確定最佳接種量(見圖7)。

圖7 接種量對CMC和FPA酶活力的影響Fig.7 Effect of inoculation amount on CMC and FPA enzume activity

從圖7中可知,接種量對酶活力的影響不是很大,隨接種量呈先升高再下降的趨勢,在其他條件相同時,該菌的接種量為2%時,其CMC和FPA酶活力均達(dá)到最大值,分別為1.603 U/mL和1.523 U/mL,當(dāng)接種量超過2%時,菌株的酶活力逐漸降低,尤其是當(dāng)接種量達(dá)到10%時,其CMC和FPA酶活力均達(dá)到最低值,分別為1.501 U/mL和1.465 U/mL,接種量的增加導(dǎo)致酶促反應(yīng)無法正常進(jìn)行,在一定程度上抑制了產(chǎn)酶效果,因此最適接種量為2%。

2.4.4 不同轉(zhuǎn)速對酶活力的影響

將菌株以接種量為2%接種到初始pH值為7.0發(fā)酵培養(yǎng)基中,分別設(shè)定搖床轉(zhuǎn)速為100 r/min、130 r/min、148 r/min、180 r/min,均置于28 ℃條件下振蕩培養(yǎng)4 d后取發(fā)酵液,測定CMC及FPA活力,圖8為實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖8 轉(zhuǎn)速對CMC和FPA酶活力的影響Fig.8 Effectof rotational speed on CMC and FPA enzume activity

由圖8可知,轉(zhuǎn)速對CMC和FPA酶活力的影響不是很大,在其他條件相同時,該菌的最適轉(zhuǎn)速為130 r/min,其CMC和FPA酶活力均達(dá)到最大值,分別為1.642 U/mL和1.563 U/mL,當(dāng)轉(zhuǎn)速低于100 r/min和高于180 r/min時,在一定程度上抑制了產(chǎn)酶效果,且在轉(zhuǎn)速達(dá)到180 r/min時,CMC和FPA酶活力均達(dá)到最小值,分別為1.599 U/mL和1.489 U/mL,造成酶活力較低的原因是過快的轉(zhuǎn)速可能改變菌株細(xì)胞變性或使之失活,在一定程度上影響了酶促反應(yīng)速率,因此,該菌株的最適宜轉(zhuǎn)速為130 r/min。

2.5 正交試驗(yàn)及驗(yàn)證

由于誘變后的Streptomyces sp.FZ92C的CMC和FPA酶活會受到多種因素的影響,因此要確定一個最佳的反應(yīng)條件。將培養(yǎng)時間設(shè)置為4d,設(shè)計(jì)了正交試驗(yàn),各因素水平表如表6所示。

表6 正交試驗(yàn)因素水平表Table 6 Factor level table of orthogonal test

正交試驗(yàn)極差越大,說明影響就越大。正交試驗(yàn)結(jié)果如表7所示,從表7中4種單因素CMC與FPA正交試驗(yàn)的極值實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,對兩種酶活力影響最大的是溫度,其次是培養(yǎng)基pH值,再次是接種量,最后是轉(zhuǎn)速。

表7 正交試驗(yàn)結(jié)果表Table 7 Results of orthogonal test

通過正交試驗(yàn)得出的結(jié)果確定最佳條件:溫度為28 ℃、接種量為2%、pH值為6.0、轉(zhuǎn)速為130 r/min,此時的CMC酶活力為1.812 U/mL,FPA酶活力為1.812 U/mL。單因素試驗(yàn)得出的最佳試驗(yàn)條件:溫度為28℃、接種量為2%、pH值為7.0、轉(zhuǎn)速為130 r/min,CMC酶活力為2.072 U/mL,FPA酶活力為1.464 U/mL。由此可見單因素試驗(yàn)得出最佳條件時的CMC和FPA酶活力要高于正交試驗(yàn)最佳條件時的CMC和FPA酶活力,因此最佳產(chǎn)酶條件:溫度為28℃、接種量為2%、pH值為7.0、轉(zhuǎn)速為130 r/min。

3 結(jié) 論

(1)從張官橋下玉米地篩選出來的兩株降解菌經(jīng)16S rDNA鑒定均為鏈霉菌屬菌種,菌株Ⅰ與Streptomyces sp.FZ92親緣關(guān)系為99.93%;菌株Ⅳ與Streptomyces rubiginosus親緣關(guān)系99.65%,且菌株Ⅰ的降解性能最好,達(dá)12.08%。

(2)對菌株Ⅰ進(jìn)行紫外-微波復(fù)合誘變,得到1株纖維素降解性能最好、對秸稈降解效率達(dá)到40.21%的菌株SF3-3,與未誘變株相比降解率提升了18.12%,與單獨(dú)紫外誘變株相比降解率提升了10.84%,復(fù)合誘變極大地提高了菌株的降解性能。

(3)兩種酶活力的影響因素強(qiáng)弱依次為:溫度、培養(yǎng)基初始pH值、接種量、轉(zhuǎn)速;復(fù)合誘變后的菌株SF3-3的最佳產(chǎn)酶條件:溫度為28 ℃、接種量為2%、pH值為7.0、轉(zhuǎn)速為130 r/min。