楊梓璐,石懿平,鄭火建,李洪彪,汪立平,2,3*

(1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院,上海 201306;2.上海海洋大學(xué) 食品熱加工工程技術(shù)研究中心,上海 201306;3.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室(上海),上海 201306)

生物胺是具有生物活性的低分子量含氮化合物,廣泛分布于食品,尤其是發(fā)酵食品中,如魚露、豆豉、發(fā)酵香腸等。高濃度的生物胺會對人體健康產(chǎn)生影響,導(dǎo)致多種毒性作用[1]。大多數(shù)生物胺是由微生物產(chǎn)生的,因此腐敗微生物是部分食品中生物胺的主要來源,當(dāng)腐敗菌在食品加工過程中成為優(yōu)勢菌時,食品中的生物胺容易出現(xiàn)過度積累[2]。因此,控制發(fā)酵過程中的生物胺含量非常重要。目前,食品中常用的生物胺控制方法主要有冷凍、輻照、超高壓、添加山梨酸鉀等防腐劑[3-4],但這些方法通常會對食品的風(fēng)味、質(zhì)量產(chǎn)生一定影響,并引發(fā)消費者對其安全的擔(dān)憂。

乳酸菌作為公認(rèn)的安全菌株,不僅有改善食品風(fēng)味、提高營養(yǎng)價值的作用[5],還能產(chǎn)生細(xì)菌素抑制病原菌與腐敗菌的生長[6],提高食品的安全。在發(fā)酵食品中接種能抑制生物胺產(chǎn)生菌活性的乳酸菌發(fā)酵劑,通過產(chǎn)生細(xì)菌素抑制產(chǎn)胺菌的生長,可以有效控制發(fā)酵食品中生物胺的積累[7-8],是非常有應(yīng)用前景的生物胺控制方法。目前該方法已應(yīng)用于發(fā)酵香腸和干酪的生產(chǎn)中[9-10],但在魚露生產(chǎn)中的應(yīng)用尚未見報道。

實驗前期以南極磷蝦為原料發(fā)酵得到了風(fēng)味較好的高品質(zhì)魚露,但其中生物胺含量較高。結(jié)合高通量測序與平板分離的方法,從南極磷蝦魚露中篩選出2株產(chǎn)胺菌:金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusXM2)和表皮葡萄球菌(StaphylococcusepidermidisXM3),其產(chǎn)組胺含量分別達到了(26.35±2.98)、(31.59±3.10)mg/kg,對發(fā)酵魚露的安全造成了嚴(yán)重影響。實驗以魚露中產(chǎn)胺能力最高的菌S.epidermidisXM3為指示菌,從發(fā)酵食品中篩選產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌,對其所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的抑菌譜和生物學(xué)特性進行研究,以期得到抑制產(chǎn)胺菌且不影響魚露質(zhì)量的安全菌株,為控制魚露以及其他發(fā)酵食品中的生物胺含量提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 篩菌樣品 實驗所用泡菜來自吉林省長春市農(nóng)家自制,香腸來自四川省宜賓市農(nóng)家自制,魚腸道來自上海市浦東新區(qū)古棕路菜市場。所有樣品均在無菌環(huán)境中取樣。

1.1.2 指示菌 采用S.epidermidisXM3,在農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室(上海)保藏。

1.1.3 試劑與培養(yǎng)基 試劑包括胰蛋白胨、碳酸鈣、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、α-淀粉酶、鹽酸、氫氧化鈉、乙酸乙酯等(國藥集團化學(xué)試劑有限公司,分析純)。培養(yǎng)基包括MRS(de Man,Rogosa and Sharpe)培養(yǎng)基、溶菌肉湯(Luria-Bertani,LB)培養(yǎng)基、酵母浸出粉胨葡萄糖(Yeast Extract Peptone Dextrose,YPD)瓊脂培養(yǎng)基(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)。

1.1.4 儀器與設(shè)備 包括拍擊式均質(zhì)機(上海松茂生物科技有限公司,JX-05),Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司),pH計(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司,FE28),可見分光光度計(尤尼柯(上海)儀器有限公司,7200),梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)(杭州朗基科學(xué)儀器有限公司,A300),電泳儀(北京市六一儀器廠,DYY-6C),雙垂直電泳槽(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司,JY-SCZ2+)。

1.2 實驗方法

1.2.1 產(chǎn)胺菌拮抗乳酸菌的分離與初篩 取25g樣品放入無菌均質(zhì)袋中,加225mL生理鹽水,用均質(zhì)機處理10min。將無菌生理鹽水梯度稀釋,然后分別吸取不同稀釋度的樣品稀釋液100μL涂布于含2% CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基上,在37℃條件下培養(yǎng)48 h,挑選菌落生長密度合適的MRS平板進行下一步實驗。

采用雙層瓊脂覆蓋法[11]并進行一些改進,進行菌株的初篩。在菌落生長密度合適的MRS稀釋涂布平板上倒1層含指示菌量為1×104CFU/mL的半固體培養(yǎng)基(含1%瓊脂),在37℃條件下正置培養(yǎng)12h。培養(yǎng)結(jié)束后觀察菌落周圍是否產(chǎn)生抑菌圈與溶鈣圈,對有抑菌圈和溶鈣圈的菌株進行分離純化和保藏。

1.2.2 產(chǎn)胺菌拮抗乳酸菌的復(fù)篩 將篩選得到的菌株接入MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到發(fā)酵液,離心后將上清液過膜,得到無細(xì)胞上清液。采用有機溶劑萃取法[12],利用相似相溶原理對菌株所產(chǎn)抑菌物質(zhì)進行分離純化。將乙酸乙酯與無細(xì)胞發(fā)酵上清液按體積比1∶1進行萃取以制備細(xì)菌素粗提取物。無細(xì)胞發(fā)酵上清液一次性全部加入,乙酸乙酯分為相等3份,依次加入,每加入1份后充分振蕩、搖勻,待其靜置分層后再加入下一份并重復(fù)上述步驟,直至全部加完。加入乙酸乙酯待其靜置分層后,將上層萃取液合并進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(溫度為55℃,轉(zhuǎn)速為60r/min)以除去乙酸乙酯。取旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)所得粗提物,加入適量的超純水重懸,得到粗提物溶液,同時消除有機酸與過氧化氫的影響。

采用瓊脂打孔法對菌株進行復(fù)篩[13]。在含菌量為1×104CFU/mL的半固體指示菌平板(含1%瓊脂)上打孔并加入無細(xì)胞上清液或粗提物溶液,每個孔里注入50μL液體樣品,在4℃條件下靜置2h后再在37℃條件下正置培養(yǎng)12h。培養(yǎng)結(jié)束后觀察是否形成抑菌圈,并測量抑菌圈大小。菌株的生物胺產(chǎn)生量參照Ma等[14]的方法,將菌株活化后接種至額外添加氨基酸(含量為5g/L)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h,使用分光光度法測定發(fā)酵液中的生物胺含量,以未接種菌株的培養(yǎng)基為對照,確定菌株的生物胺產(chǎn)生能力。通過無細(xì)胞上清液和粗提物溶液的抑菌圈直徑評價各菌株的抑菌活性,選擇抑菌活性最佳且無產(chǎn)胺能力的菌株進行下一步實驗。

1.2.3 菌株的鑒定 1) 形態(tài)學(xué)鑒定:將篩選得到的具有抑菌效果的菌株(記為XCX1)劃線至MRS固體培養(yǎng)基上,在37℃條件下培養(yǎng)24h,觀察菌落形態(tài)。進行革蘭氏染色后,在光學(xué)顯微鏡下觀察菌體的形態(tài)和染色結(jié)果。2) 分子生物學(xué)鑒定:使用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取DNA。以總DNA為模板,使用通用引物27F和1492R進行PCR擴增,使用1%瓊脂糖凝膠電泳方法檢測擴增產(chǎn)物質(zhì)量,PCR擴增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。在美國國家生物技術(shù)信息中心(national center for biotechnology information,NCBI)網(wǎng)站上使用基于局部比對算法的搜索工具(basic local alignment search tool,BLAST)將測序所得的16S rDNA序列與數(shù)據(jù)庫中的序列進行比對,使用 MEGA 5.0軟件采用基于距離(distance-based)的鄰接法(neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,建樹檢驗方法為步長檢驗(bootstrap method),檢驗次數(shù)為1000次,計算模型為Kimura 2參數(shù)模型(Kimura 2-parameter model),缺口數(shù)據(jù)部分刪除(partial deletion),自展值(bootstrap value)范圍為0%～100%,支持度以百分?jǐn)?shù)略去百分號形式表示。將該菌株的 16S rDNA序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫中。

1.2.4 抑菌譜的測定 采用打孔法測定菌株XCX1所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的抑菌譜[11]。選取表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌(有2種不同來源)、枝芽孢桿菌、戊糖片球菌、腐生葡萄球菌、單增李斯特菌、大腸桿菌、副溶血性弧菌、沙門氏菌、嗜水氣單胞菌、米曲霉、釀酒酵母和漢遜德巴利酵母14株菌株作為指示菌。

1.2.5 抑菌物質(zhì)的理化及生物特性 取適量無細(xì)胞發(fā)酵上清液,分別按以下方式處理,測定菌株XCX1所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、紫外線穩(wěn)定性、金屬離子穩(wěn)定性和蛋白酶敏感性。1) 熱穩(wěn)定性:分別在0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、121℃溫度下處理10min和30min。2) 酸堿穩(wěn)定性:分別調(diào)節(jié)pH值至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0,在37℃條件下水浴2h,之后再將pH值調(diào)回至7.0并用無菌水定容至相同體積。3) 紫外線穩(wěn)定性[15]:將樣品置于30W紫外燈下,在90cm處分別照射10、20、30、40、50、60min。4) 金屬離子穩(wěn)定性:在樣品中分別加入NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2、ZnCl2溶液,使體系中的Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Zn2+摩爾濃度為10mmol/L。5) 蛋白酶敏感性:向樣品中分別加入用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)配制的胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、α-淀粉酶、木瓜蛋白酶和蛋白酶K溶液,使溶液中各蛋白酶的最終質(zhì)量濃度為1mg/mL,再調(diào)節(jié)pH值至各種酶的最適pH值,在37℃條件下水浴2h,之后再將pH值調(diào)回7.0并用無菌水定容至相同體積。

以S.epidermidisXM3為指示菌,以未處理的無細(xì)胞發(fā)酵上清液為對照,按照1.2.2節(jié)中的方法測定抑菌效果。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗平行進行3次,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS Statistics 18.0軟件分析數(shù)據(jù),并用F檢驗進行差異顯著性分析,使用Tukey檢驗進行多重比較。使用 OriginPro 8.1軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)胺菌拮抗菌的篩選

利用雙層瓊脂覆蓋法,以魚露中的產(chǎn)胺菌S.epidermidisXM3作為指示菌,分別從泡菜、香腸、魚腸道等樣品中共分離出近40株具有抑菌效果的菌株,分離純化后分別制取無細(xì)胞上清液,得到4株對S.epidermidisXM3具有較好拮抗作用的菌株。為排除過氧化氫和有機酸對抑菌效果的影響,利用乙酸乙酯萃取法對上清液中的抑菌物質(zhì)粗提取,并進行抑菌實驗,結(jié)果如表1所示。由表1可知,菌株XCX1的上清液和粗提液對S.epidermidisXM3均有較好的拮抗作用。檢測菌株XCX1的產(chǎn)胺能力,結(jié)果表明其不產(chǎn)生組胺,最終確定對抑菌活力最佳的菌株XCX1開展后續(xù)研究。

表1 樣品中拮抗菌對S.epidermidis XM3的抑制作用Tab.1 Inhibitory effect of antagonistic bacteria on S.epidermidis XM3

2.2 菌株XCX1的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)觀察 菌株XCX1在MRS固體培養(yǎng)基上的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果如圖1所示。由圖1可知,菌株XCX1菌落為圓形、微白色(圖1(a)),表面光滑、濕潤、凸起,邊緣整齊,不透明,背面為黃色(圖1(b)),菌落周圍有溶鈣圈(圖1(c))。光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果如圖1(d)所示,結(jié)果表明該菌為長桿狀,多成短鏈狀排列,為革蘭氏陽性菌,不產(chǎn)芽孢,不運動,沒有鞭毛。

圖1 菌株XCX1的形態(tài)學(xué)觀察Fig.1 Morphological features of strain XCX1

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果如圖2所示。由圖2可知,菌株XCX1的16S rDNA在1000～2000堿基對(base pair,bp)處有1條清晰的條帶,測序后得到全長約1431bp的基因序列。經(jīng)BLAST同源性比對,結(jié)果表明菌株XCX1的16S rDNA序列與彎曲乳桿菌(Lactobacilluscurvatus)同源性高達99%。

圖2 菌株XCX1的PCR擴增產(chǎn)物電泳圖

利用MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果如圖3所示。由圖3可知,該菌株與彎曲乳桿菌聚為一支,結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果,鑒定菌株XCX1為彎曲乳桿菌,將其命名為L.curvatusXCX1。獲得GeneBank數(shù)據(jù)庫登錄號為OQ626370。

注:枝上數(shù)字為支持度,以略去百分號的百分?jǐn)?shù)表示。 圖3 菌株XCX1基于16S rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2.3 菌株XCX1的抑菌譜 采用瓊脂擴散法測定L.curvatusXCX1抑菌物質(zhì)的抑菌譜,共測14株指示菌,包括魚露中分離得到的產(chǎn)胺菌、產(chǎn)蛋白酶菌以及幾種常見的革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和酵母菌,結(jié)果如表2所示。由表2可知,L.curvatusXCX1對魚露中產(chǎn)胺能力最高的2個菌株S.aureusXM2和S.epidermidisXM3有抑制作用,而對魚露中產(chǎn)蛋白酶能力最高的菌VirgibacillusdokdonensisXM4無抑制作用。因此判斷,L.curvatusXCX1可作為魚露中主要產(chǎn)胺菌的拮抗菌,能控制魚露中生物胺的積累且不影響魚露的質(zhì)量。

表2 菌株XCX1所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的抑菌譜Tab.2 Antimicrobial spectrum of antibacterial substances produced by strain XCX1

另外,表2中數(shù)據(jù)證明L.curvatusXCX1對供試的大部分菌株均有抑制效果,其中5株革蘭氏陽性菌的抑菌圈直徑達到(7.91±0.08)～(19.22±0.24)mm,4株革蘭氏陰性菌抑菌圈直徑達到(12.50±0.11)～(19.02±0.16)mm,細(xì)菌中對冷藏食品中常見腐敗菌單增李斯特菌的抑制效果最好;然而,L.curvatusXCX1對益生菌枝芽孢桿菌、戊糖片球菌以及真菌釀酒酵母和漢遜德巴利酵母無抑制作用。

實驗結(jié)果表明,L.curvatusXCX1能夠抑制一些常見的食源性致病菌、水產(chǎn)致病菌,同時,相比于Heidari等[16]和任麗等[17]報道的彎曲乳桿菌所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的抑菌譜,L.curvatusXCX1所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的抑菌譜更廣。

2.2.4 菌株XCX1所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的理化及生物特性 以S.epidermidisXM3為指示菌,測定L.curvatusXCX1所產(chǎn)抑菌物質(zhì)在不同理化條件處理下抑菌活性的變化,結(jié)果如圖4所示。

(a) 溫度 (b) pH值

(c) 紫外線照射時間 (d) 金屬離子注:不同小寫字母表示差異顯著 (P<0.05)。圖4 不同因素對菌株XCX1所產(chǎn)抑菌物質(zhì)活性的影響Fig.4 Effect of different factors on activity of antibacterial substances produced by strain XCX1

1) 熱穩(wěn)定性:由圖4(a)可知,L.curvatusXCX1所產(chǎn)抑菌物質(zhì)具有良好的熱穩(wěn)定性,在0℃～121℃條件下均能保留大部分抑菌活性,推測是因為該抑菌物質(zhì)具有較為穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。在121℃條件下處理30min時,抑菌活性最低,與對照組相比有所降低,說明L.curvatusXCX1所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的熱穩(wěn)定性良好,在高壓滅菌的處理條件下仍然具有一定的抑菌活性。因此,其在食品加工領(lǐng)域具有一定的應(yīng)用前景,能夠與高壓殺菌的方式相結(jié)合用于食品加工。2) 酸堿穩(wěn)定性:由圖4(b)可知,L.curvatusXCX1所產(chǎn)抑菌物質(zhì)在pH值為2.0～8.0時抑菌活性較好,當(dāng)pH值大于10.0時抑菌活性出現(xiàn)顯著性下降(P<0.05),但仍保持了不低的抑菌活性;表明該抑菌物質(zhì)在酸性和中性環(huán)境中穩(wěn)定性較好,甚至能夠耐受極端酸環(huán)境,但在強堿性環(huán)境下穩(wěn)定性較差,活性會受到抑制。因此,L.curvatusXCX1所產(chǎn)抑菌物質(zhì)在低pH值環(huán)境中的良好穩(wěn)定性對于其在酸性、中性和弱堿性條件下食品加工中的應(yīng)用非常重要。3) 紫外線穩(wěn)定性:由圖4(c)可知,當(dāng)紫外線照射10～60min時,對L.curvatusXCX1所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的抑菌活性影響很小,說明該抑菌物質(zhì)具有良好的紫外線穩(wěn)定性,這表示在食品加工過程中,可以將其與傳統(tǒng)的紫外線殺菌方式相結(jié)合,以達到更好的效果。4) 金屬離子穩(wěn)定性:由圖4(d)可知,不同金屬離子對L.curvatusXCX1所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的抑菌活性影響程度不同,如Na+和Ca2+對抑菌活性幾乎沒有影響,K+和Mg2+對抑菌活性有輕微的抑制效果,而Zn2+能增強抑菌活性。

不同蛋白酶處理對L.curvatusXCX1所產(chǎn)抑菌物質(zhì)抑菌活性的影響如表3所示。由表3可知,所有蛋白酶處理后,抑菌活性均出現(xiàn)了不同程度下降。α-淀粉酶和木瓜蛋白酶處理后,抑菌活性有所下降;而胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶以及蛋白酶K處理后,抑菌活性完全喪失,說明該抑菌物質(zhì)對這4種酶的敏感性較高。這可能是因為該抑菌物質(zhì)為蛋白類或肽類物質(zhì),具有細(xì)菌素的常見特性,初步分析其是某種低分子量的細(xì)菌素;而這些蛋白酶能夠破壞該抑菌物質(zhì)中的活性部分。由于該抑菌物質(zhì)對各種蛋白酶較為敏感,而人體消化道中都存在這4種蛋白酶,因此表明,該抑菌物質(zhì)不會在人體內(nèi)殘留,當(dāng)作為防腐劑或發(fā)酵劑在食品加工中添加時具有一定的安全性。

表3 菌株XCX1所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的酶敏感實驗Tab.3 Enzyme sensitivity test of antibacterial substances produced by strain XCX1

3 結(jié)論

從發(fā)酵食品中篩選出1株產(chǎn)胺菌的拮抗菌株,結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察與16S rDNA檢測鑒定該菌株為彎曲乳桿菌(L.curvatusXCX1)。其所產(chǎn)抑菌物質(zhì)能夠抑制魚露中產(chǎn)胺菌的生長,而對魚露中的產(chǎn)蛋白酶菌無抑制作用,因此可作為魚露中產(chǎn)胺菌的拮抗菌,控制魚露中生物胺的積累。實驗表明,該菌株所產(chǎn)抑菌物質(zhì)對絕大多數(shù)指示菌具有較好的抑菌作用,對供試的所有革蘭氏陰性菌均具有較好的抑菌活性,對除枝芽孢桿菌(VirgibacillusdokdonensisXM4)、戊糖片球菌(PediococcuspentoseSL47)外的革蘭氏陽性菌也都具有較好的抑菌活性,還能夠抑制真菌中的米曲霉(AspergillusoryzaeYL001),可見L.curvatusXCX1所產(chǎn)抑菌物質(zhì)具有廣譜抑菌作用。此外,L.curvatusXCX1所產(chǎn)抑菌物質(zhì)具有良好的熱穩(wěn)定性和紫外線穩(wěn)定性,可耐受高壓滅菌與紫外輻射;也具有較好的酸堿耐受性,活性pH值范圍為2.0～8.0,有利于其在食品加工中的應(yīng)用;L.curvatusXCX1使用安全性高,經(jīng)6種蛋白酶處理后,所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的抑菌活性出現(xiàn)不同程度的下降,表明該抑菌物質(zhì)為蛋白類或肽類物質(zhì),具有細(xì)菌素的常見特性,且對人體應(yīng)具有一定的安全性。下一步將繼續(xù)研究L.curvatusXCX1所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與作用機制,進行全基因組測序以挖掘其潛在的細(xì)菌素基因簇,并進一步探究其作為新型發(fā)酵劑在提高食品安全方面的作用,為其在魚露及其他發(fā)酵食品加工中的應(yīng)用提供更多理論依據(jù)。