張世鵬，劉文麗，程昌豪，李學寶，李揚

（華中師范大學 生命科學學院/遺傳調(diào)控與整合生物學湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430079）

棉花為錦葵科棉屬植物，是世界范圍內(nèi)重要的經(jīng)濟作物之一，可為紡織工業(yè)提供天然原料。目前，全球種植最為廣泛的是四倍體的陸地棉（Gossypium hirsutum），其纖維產(chǎn)量占總棉花產(chǎn)量的90%，具有重要的經(jīng)濟價值[1]。棉花纖維是棉花胚珠表皮細胞分化而來的單細胞毛狀突起，其發(fā)育過程是一個復雜而高度程序化的過程，可被分為4個相互重疊的時期：起始期、快速伸長期、次生壁生物合成期及脫水成熟期[2]。棉纖維細胞的發(fā)育起始于開花當天，大約持續(xù)至開花后5 d，只有20%～30%的胚珠表皮細胞可以分化形成最終的長纖維。起始期和伸長期之間并沒有顯著的時間節(jié)點，通常認為開花5 d后，棉纖維就已經(jīng)進入了伸長期，并將持續(xù)至20 d。該時期是棉花纖維細胞的快速生長時期，決定著棉纖維的最終長度。在開花后16 d左右，棉纖維細胞開始大量合成纖維素，標志著棉纖維細胞發(fā)育進入了次生壁生物合成期，這個時期纖維素的合成與沉積量決定了成熟棉纖維的強度。這個過程通常持續(xù)到40 d，之后棉纖維發(fā)育進入到脫水成熟期[3]。

作為真核細胞細胞骨架重要組成成分之一，肌動蛋白細胞骨架廣泛參與細胞的形態(tài)維持、細胞器的運動、細胞分裂、細胞遷移、物質(zhì)的囊泡運輸和細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導等[4-6]。棉纖維正常生長發(fā)育依賴于細胞中肌動蛋白細胞骨架的動態(tài)行為，早期體外藥學試驗顯示，肌動蛋白結(jié)合蛋白（F-Actin）在發(fā)育的纖維細胞中參與調(diào)控微管的定向[7]。而在纖維長絨極度縮短的ligon lintless突變體中，F(xiàn)-Actin 結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)不規(guī)則排列狀態(tài)[8]。此外，抑制棉纖維伸長期優(yōu)勢表達的GhACT1基因的表達，會造成肌動蛋白細胞骨架變少，棉纖維伸長生長受到嚴重抑制[9]。

肌動蛋白細胞骨架的動態(tài)特征依賴于各種肌動蛋白結(jié)合蛋白的協(xié)同作用，它們通過結(jié)合、成核、封端、切割、解聚、成束、交聯(lián)等方式參與形成不同形態(tài)的肌動蛋白骨架[10]。在棉花中，下調(diào)肌動蛋白解聚因子GhADF1的表達能夠提高纖維中F-Actin的聚合度，同時提高棉纖維的長度和強度[11]。而過量表達GhPFN2能夠增加纖維細胞的微絲密度及成束度，進而促進纖維細胞中早期纖維素的沉積[12]。

LIM蛋白是一類古老而保守的蛋白家族，大多包含1個或多個LIM結(jié)構(gòu)域（C-X2-C-X16-23-HX2-C）-X2-（C-X16-21C-X2-3-（C/D/H）），參與蛋白與蛋白的相互作用[13]。植物中的LIM蛋白被分為4組。其中，亞族又可分為3個類型：PLIM、WLIM及XLIM[14]。迄今為止，大部分植物LIM蛋白都被認定為肌動蛋白結(jié)合蛋白，能夠促進F-Actin的成束，調(diào)節(jié)肌動蛋白動態(tài)平衡，并保護F-Actin不發(fā)生解聚[15-18]。在棉花中，GhWLIM1a和GhXLIM6也均被報道參與棉纖維中F-Actin的成束反應[19-20]。先前研究表明，GhWLIM5蛋白在體外能夠結(jié)合F-Actin并促進F-Actin成束，但其在棉纖維中的功能及其與其他LIM蛋白是否存在功能差異仍不清楚[21]。

本研究對GhWLIM5蛋白參與棉纖維發(fā)育中FActin成束調(diào)控進行深入探討，并檢測pH對GhWLIM5蛋白功能的影響，同時也比較不同LIM蛋白結(jié)合和促進F-Actin成束能力的差異，為深入理解LIM蛋白在棉纖維發(fā)育中的功能提供重要的科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試棉花品種為陸地棉（Goasypium hirsutum）珂字 312；蛋白表達載體為pET-28a；植物轉(zhuǎn)化載體為pBI121；蛋白表達菌株為BL21；植物轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株為LBA4404。

1.2 試驗方法

1.2.1 載體構(gòu)建 為構(gòu)建GhWLIM5RNAi載體，約250 bp的GhWLIM5的CDS片段首先以反向重復的方式被克隆進pBluescript SK載體，然后通過雙酶切定向連接方式克隆進pBI121載體（35S::GhWLIM5RNAi）或pBI101-TUA9載體（TUA9p::GhWLIM5RNAi），引物分別為GhWLIM5-L1、GhWLIM5-R1和GhWLIM5-L2、GhWLIM5-R2。為構(gòu)建GhWLIM5和GhXLIM6原核表達載體，不含終止密碼子的GhWLIM5、GhXLIM6的編碼序列被克隆到pET-28a載體中，引物分別為Gh-WLIM5-EL、GhWLIM5-ER和GhXLIM6-EL、GhXLIM6-ER。

1.2.2 植物材料生長條件 棉花種子經(jīng)濃硫酸脫絨后，28 ℃培養(yǎng)箱中浸泡1 d后，將露白種子于營養(yǎng)土中在23 ℃培養(yǎng)室中萌發(fā)育苗，16 h光照/8 h黑暗。待其生長至二葉期后，移植到大田繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 高速共沉淀與低速共沉淀 將GhWLIM5和GhXLIM6原核表達載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3），用以表達GhWLIM5和GhXLIM6蛋白。重組蛋白在天然條件下用Ni-NTA瓊脂糖進行親和純化后，用截流大小為10 ku的超濾管將buffer置換為Exchanged buffer（100 mmol/L NaH2PO4、10 mmol/L Tris-HCl，pH值7.4）。

高速、低速共沉淀分析利用Cytoskeleton公司的Actin Binding Protein Biochem Kit進行。首先，將兔源肌動蛋白用General Actin buffer（5 mmol/L Tris-HCl、0.2 mmol/L CaCl2，pH值8.0）溶解至濃度為10 μmol/L，隨后加入到Actin Polymerization buffer（5 mmol/L Tris-HCl、0.2 mmol/L CaCl2、0.2 mmol/L ATP、1.0 mmol/L DTT、2 mmol/L MgCl2，pH值8.0）中使G-Actin聚合成F-Actin。然后將不同濃度蛋白加入到預組裝的F-Actin聚合體系中，于24 ℃條件下孵育30 min，于4 ℃進行離心1 h（高速共沉淀分析離心力為200 000 g，低速共沉淀分析離心力為14 000 g）。上清和沉淀分別收集，SDS PAGE電泳后用考馬斯亮藍G250進行染色分析。

1.2.4 棉纖維F-Actin染色觀察 棉纖維F-Actin染色參照WANG等[17]方法進行。將胚珠在含有0.66 μmol/L Atto 488 phalloidin、0.1 mol/L PIPES（pH值7.0）、0.05% Triton X-100、1 mmol/L MgCl2、3 mmol/L DTT、0.3 mol/L PMSF、5 mmol/L EGTA和0.25%戊二醛的PBS中室溫孵育10 min，漂洗干凈后，將纖維從胚珠上切下并固定在載玻片上，加入抗熒光淬滅劑，蓋上蓋玻片，在激光共聚焦顯微鏡（徠卡，SP5）下進行觀察。

1.2.5 胚珠體外培養(yǎng) 取開花前1 d棉桃，用75%酒精進行表面消毒1 min，然后用無菌水清洗干凈。切開棉桃，取出胚珠置于BT培養(yǎng)基（含0.5 μmol/L IAA和0.5 μmol/L GA）中，30 ℃靜置避光培養(yǎng)。

1.2.6 基因表達檢測 利用天根RNApre Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取各組織RNA，利用HiScript II 1st Strand cDNA synthesis Kit試劑盒將1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以GhTUB作為內(nèi)標進行qRT-PCR分析。qRT-PCR反應條件及基因表達水平計算方法參照文獻[18]的方法進行。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Image J軟件進行微絲定量分析，將微絲圖像骨骼化后統(tǒng)計圖片的Skewness值，代表微絲成束度。使用稱量臺對總種子數(shù)大于100粒的質(zhì)量進行統(tǒng)計，利用量尺對棉纖維長度進行統(tǒng)計，數(shù)據(jù)以平均值±標準差呈現(xiàn)；統(tǒng)計分析采用SPSS 13及Excel軟件進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 GhWLIM5 RNAi轉(zhuǎn)基因棉花表型分析

為了探討GhWLIM5在棉纖維發(fā)育中的功能，分別構(gòu)建了35S啟動子和纖維伸長期優(yōu)勢性啟動子TUA9p啟動的GhWLIM5RNAi載體，轉(zhuǎn)化棉花并均獲得了一些轉(zhuǎn)基因棉花。其中，35S::Gh-WLIM5RNAi共2個株系，TUA9p::GhWLIM5共4個株系。對這些轉(zhuǎn)基因棉花（T2）開花后9 d棉纖維中GhWLIM5的表達量進行檢測，結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)基因棉花纖維中，GhWLIM5的表達量均發(fā)生顯著下調(diào)（圖1-A）。

圖1 GhWLIM5 RNAi轉(zhuǎn)基因棉花纖維表型分析Fig.1 Phenotype analysis of fiber GhWLIM5 RNAi transgenic cotton

表型觀察發(fā)現(xiàn)，這些轉(zhuǎn)基因棉花成熟纖維長度較野生型更短，而其種子大小則沒有顯著差異（圖1-B、1-D）。每個株系隨機選取50顆種子測量棉纖維長度，結(jié)果表明，除TUA9p::GhWLIM5RNAi株系3（TUA3）及35S::GhWLIM5RNAi株系1（35S1）外，其他轉(zhuǎn)基因株系成熟棉纖維長度均較WT顯著變短。測量和統(tǒng)計結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因棉纖維長度較野生型相比均減少5%～15%，二者存在顯著或極顯著差異（圖1-C）。

隨后，選取了棉纖維品質(zhì)4個常用性狀（纖維長度、馬克隆值、纖維強度及伸長率）對野生型及GhWLIM5RNAi轉(zhuǎn)基因棉花成熟纖維進行了品質(zhì)分析。由表1可知，轉(zhuǎn)基因棉花纖維上半部分長度均短于野生型，這與手動測量分析結(jié)果基本吻合。同時，GhWLIM5RNAi轉(zhuǎn)基因棉花（除TUA3外）纖維的強度值也比野生型降低了4.0%～8.9%（表1）。此外，馬克隆值作為棉花的重要品質(zhì)指標，能夠有效地反映棉花纖維細度與成熟度[22-25]，也間接反映了棉纖維細胞壁厚度。品質(zhì)分析結(jié)果顯示，野生型棉纖維馬克隆值為5.44，而大多GhWLIM5RNAi轉(zhuǎn)基因植株的棉纖維馬克隆值則比野生型降低了2.0%～32.4%。這些結(jié)果暗示，GhWLIM5可能不僅參與棉纖維伸長生長，還影響棉纖維次生壁發(fā)育。

表1 野生型與GhWLIM5表達抑制棉花纖維品質(zhì)分析Tab.1 Cotton fiber quality analysis of wild type and GhWLIM5 expression inhibited

為進一步檢測纖維生長速度，本研究在體外進行胚珠培養(yǎng)，在快速伸長期測量纖維長度，結(jié)果如圖2-A所示，在相同的培養(yǎng)環(huán)境下，野生型棉纖維細胞生長速度快于GhWLIM5RNAi轉(zhuǎn)基因棉纖維細胞。培養(yǎng)12 d后野生型棉纖維細胞長度約為12.5 mm，而轉(zhuǎn)基因植株（除TUA3外）棉纖維細胞長度在8.0～10.5 mm（圖2-B）。在培養(yǎng)15、18 d后，轉(zhuǎn)基因植株的棉纖維長度依然短于野生型（圖2-C、D）。以上結(jié)果說明，抑制GhWLIM5的表達能夠抑制棉纖維伸長生長，意味著GhWLIM5在棉纖維伸長生長過程中起著重要作用。

圖2 GhWLIM5 RNAi轉(zhuǎn)基因棉花胚珠離體培養(yǎng)纖維生長情況分析Fig.2 Fiber growth analysis of GhWLIM5 RNAi transgenic cotton ovules cultured in vitro

2.2 棉纖維F-Actin聚合度檢測

先前研究表明，GhWLIM5蛋白在體外能夠促進F-Actin絲束的聚合[21]。因此，本研究用Atto 488-鬼筆環(huán)肽對處于開花后12 d的野生型及GhWLIM5RNAi轉(zhuǎn)基因植株棉纖維進行染色，分析GhWLIM5對棉纖維中F-Actin細胞骨架的影響。結(jié)果表明（圖3），野生型棉纖維中，肌動蛋白絲束與棉纖維細胞生長方向平行，F(xiàn)-Actin絲束聚合度較高（圖3-A）；而無論是在35S::GhWLIM5RNAi還是在TUA9p::GhWLIM5RNAi轉(zhuǎn)基因棉花中，F(xiàn)-Actin絲束的聚合程度都發(fā)生了下降（圖3-B、C）。用Image J對F-Actin的Skewness值進行計算用以量化F-Actin的聚合度，結(jié)果顯示，GhWLIM5抑制程度較高的轉(zhuǎn)基因株系（35S2、TUA1、TUA2）棉纖維F-Actin的Skewness值顯著低于野生型，且FActin聚合程度和GhWLIM5的表達量呈正相關(guān)（圖3-D）。以上結(jié)果表明，GhWLIM5通過增加F-Actin的成束度調(diào)控棉纖維細胞內(nèi)微絲骨架高級結(jié)構(gòu)重排，進而促進棉纖維的伸長生長。

圖3 GhWLIM5 RNAi轉(zhuǎn)基因棉花纖維中的肌動蛋白細胞骨架Fig.3 Actin cytoskeleton in fibers of GhWLIM5 RNAi transgenic cotton

2.3 pH對LIM蛋白促進F-Actin成束能力的影響

有研究表明，LIM蛋白促進F-Actin成束的能力受到pH的影響[26]。為檢測GhWLIM5的功能是否也受到pH的調(diào)節(jié)，本研究表達并純化了GhWLIM5蛋白，并在體外進行了F-Actin聚合反應，利用低速共沉淀檢測在不同pH環(huán)境下GhWLIM5促進FActin成束的能力。結(jié)果顯示，在加入了相同量的GhWLIM5蛋白后，pH條件不一樣F-Actin的聚合程度不同（圖4-A）。測量與統(tǒng)計結(jié)果表明，當反應體系中無GhWLIM5時，不論在哪種pH條件下，均有約40%的F-Actin存在于沉淀中，說明pH不影響F-Actin的自身聚合能力。但在加入GhWLIM5后，在pH值為6.2時，處于沉淀中的F-Actin比例提高到約70%；當pH值升到7.0時，處于沉淀中的FActin比例降至50%左右；而當pH值升到7.4后，處于沉淀中的F-Actin比例降至和不加GhWLIM5時一樣，均為40%左右（圖4-B）。由此可見，GhWLIM5促進F-Actin成束的能力與pH環(huán)境密切相關(guān)，隨著pH值的升高，GhWLIM5促進F-Actin成束的能力逐漸下降。

圖4 低速共沉淀分析不同pH條件下GhWLIM5促進F-Actin成束能力Fig.4 Ability of GhWLIM5 promoting F-Actin bundles under different pH conditions by low-speed co-sedimentation

2.4 不同LIM蛋白結(jié)合F-Actin能力的比較

先前研究表明，不同LIM蛋白結(jié)合F-Actin的能力存在差異[15]。為比較GhWLIM5和XLIM家族的GhXLIM6對F-Actin的結(jié)合能力差異，將過量GhWLIM5和GhXLIM6蛋白分別與等量F-Actin孵育后進行高速共沉淀試驗，檢測二者與F-Actin的結(jié)合能力。結(jié)果顯示，加入同等濃度F-Actin的情況下，經(jīng)高速離心（200 000 g），GhXLIM6存在于沉淀中的比例明顯高于GhWLIM5，說明GhWLIM5結(jié)合F-Actin的能力弱于GhXLIM6（圖5-A）。

圖5 不同LIM蛋白結(jié)合與促進F-Actin成束的能力比較Fig.5 Comparison of ability of different LIM proteins to bind and promote F-Actin bundles

進而，將不同濃度GhWLIM5和GhXLIM6蛋白與一定量的F-Actin進行體外聚合反應后，通過低速共沉淀檢測它們促進F-Actin成束的能力。結(jié)果顯示，添加到4 μmol/L的GhWLIM5可使70%的低聚合度的F-Actin聚合成高聚合度的F-Actin絲束，而達到同樣的效果，GhXLIM6只需要添加到2 μmol/L，說明GhWLIM5促進F-Actin成束的能力不如GhXLIM6（圖5-B）。

2.5 棉纖維中纖維素合酶表達水平比較

纖維品質(zhì)分析結(jié)果顯示，GhWLIM5RNAi轉(zhuǎn)基因棉花成熟纖維斷裂比強度低于野生型，說明抑制該基因的表達還會影響棉纖維次生壁的發(fā)育。成熟棉纖維中超過90%為纖維素，為進一步探索該基因是否能和XLIM一樣調(diào)控棉纖維中纖維素合酶——GhCESA4/7/8的表達，進行了實時熒光定量PCR試驗，結(jié)果表明，和野生型相比，在轉(zhuǎn)基因棉花纖維中這些纖維素合酶基因的表達并未發(fā)生明顯變化（圖6），說明GhWLIM5可能不直接影響棉纖維次生壁發(fā)育。

圖6 次生壁相關(guān)纖維素合酶基因在GhWLIM5 RNAi轉(zhuǎn)基因棉花纖維中的表達情況Fig.6 Expression of secondary wall related cellulose synthase genes in GhWLIM5 RNAi transgenic cotton fibers

3 結(jié)論與討論

作為細胞內(nèi)長距離運輸?shù)能壍?，肌動蛋白細胞骨架在尖端或者極性生長的細胞中，如花粉管、根毛、棉纖維等，發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[19-20,27-29]。先前研究表明，GhWLIM5在伸長期的纖維中優(yōu)勢表達，而這個時期是纖維細胞生長速度到達頂峰的階段[21]。為了滿足細胞快速生長的需求，該時期的纖維細胞需要高效的囊泡及細胞器的運輸，也意味著需要更為高效的微絲重排。當具有促進F-Actin成束功能的GhWLIM5蛋白在棉纖維細胞中含量不足時，將直接降低細胞中微絲的成束能力，導致纖維細胞中囊泡及細胞器運輸能力下降，抑制棉纖維生長。事實上，目前的研究也證實，在GhWLIM5RNAi轉(zhuǎn)基因棉花中，GhWLIM5表達量越低，纖維細胞中微絲成束程度就越低，最終棉纖維長度越短。

先前研究表明，擬南芥和百合中的PLIM蛋白促進F-Actin成束的能力受到pH的影響，低pH環(huán)境更利于PLIM對F-Actin成束的促進作用；而擬南芥中WLIMs的活性與pH無關(guān)[15,17]。研究顯示，在棉花中WLIM蛋白GhWLIM5促進F-Actin成束的能力受到pH的調(diào)節(jié)，這與擬南芥、百合中的PLIM的特性較為相似。而GhXLIM6則表現(xiàn)出與擬南芥中WLIM蛋白相似特性，對pH相對不敏感[26]。由此可見，在棉花纖維發(fā)育過程中，LIM蛋白的功能受到更為復雜地調(diào)控，同時兼有花粉管和根毛中存在的調(diào)控方式，這與棉花纖維生長呈現(xiàn)獨特、向頂?shù)臄U散性生長模式是相一致的[30]。

此外，雖然抑制GhWLIM5也會引起棉纖維次生壁的發(fā)育受阻，但和GhXLIM6不同的是，GhWLIM5并不表現(xiàn)出直接調(diào)控次生壁基因的表達。這意味著棉花中不同LIM蛋白在棉纖維發(fā)育過程中出現(xiàn)一定的功能分化，WLIM類傾向于行使F-Actin成束蛋白的功能，而XLIM類則兼任FActin成束蛋白及轉(zhuǎn)錄因子2個角色。先前有研究表明，F(xiàn)-Actin和微管細胞骨架組織的活性變化不僅關(guān)系到纖維的伸長生長，還能夠影響到棉纖維次生壁的合成。尤其是纖維細胞中較早形成的肌動蛋白束，能夠促進微管重排及纖維素沉積[12]。而GhWLIM5在纖維發(fā)育起始及伸長期均有較高的表達量，意味著該蛋白在這2個時期對肌動蛋白絲束的聚合都有著重要的促進作用。在GhWLIM5RNAi轉(zhuǎn)基因棉花纖維中，GhWLIM5的缺失直接導致在纖維生長的早期即發(fā)生了F-Actin聚合程度的下降，這可能造成纖維細胞中微管重排的紊亂和纖維素沉積的異常，這或許是GhWLIM5RNAi轉(zhuǎn)基因棉花纖維細胞壁發(fā)育受影響的原因。