王 萌

咸陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院,咸陽 712000

和厚樸酚(honokiol,HK)是從木蘭科落葉喬木植物厚樸的干皮、根皮及枝皮中分離得到的一種天然化合物,具有抗炎[1]、抗氧化、抗衰老[2]等藥理活性。近年來HK的抗腫瘤活性受到了廣泛關(guān)注,其對肺癌、前列腺癌、乳腺癌和肝癌等具有抑制作用[3],但極低的溶解度[4]和口服生物利用度[5]嚴重影響了其藥用價值,因此,有必要設(shè)計合適的藥物遞送系統(tǒng)來提高HK的溶解度,進而提高其生物利用度和治療效果[6]。自乳化釋藥系統(tǒng)(self-emulsifying drug deli-very systems,SEDDSs)是由藥物、油、表面活性劑和助表面活性劑構(gòu)成的各相同性混合物,其在水性介質(zhì)中溫和攪拌下自發(fā)形成納米級水包油(O/W)型乳液[7],能夠避免藥物的首過效應(yīng)[8],抑制由P-糖蛋白介導(dǎo)的外排作用[9],并且能夠增強藥物的滲透性[10],在提高難溶性藥物的口服生物利用度方面具有廣闊的應(yīng)用前景[11]。本研究制備和厚樸酚自乳化釋藥系統(tǒng)(HK-SEDDSs),并通過大鼠體內(nèi)藥動學(xué)評估藥物的生物利用度,為提高HK的口服生物利用度提供一種有效的方案。

1 儀器與材料

1.1 儀器

HSY-B型智能水浴恒溫振蕩器(常州申光儀器有限公司);Zetasizer Nano ZS型激光粒度儀(英國馬爾文公司);H1750型臺式高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司);JEM-F200型透射電鏡(日本電子株式會社);RC-8DA型藥物溶出儀(天津創(chuàng)興電子設(shè)備制造股份有限公司)。

1.2 試藥

和厚樸酚(廣州合誠三先生物科技有限公司);橄欖油(olive oil)、玉米油(corn oil)、聚氧乙烯蓖麻油(cremophor EL 35)、聚氧乙烯氫化蓖麻油(cremophor RH 40)均由德國巴斯夫輔料公司提供;辛酸/癸酸三酰甘油(miglyol 812)、單辛酸甘油酯(capmul MCM C8)、二乙二醇單乙基醚(transcutol P)、辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯(labrasol)、丙二醇單辛酸酯(capryol 90)均由法國嘉法獅公司提供;吐溫80(tween 80)、聚乙二醇200(PEG200)均由南京威爾藥業(yè)集團股份有限公司提供。

1.3 動物

Wistar大鼠,雌雄各半,2～3月齡,體質(zhì)量為(200～250) g,購自第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心,生產(chǎn)許可證號SCXK-(軍)2012-0007,質(zhì)量合格證號20150021673。

2 方法與結(jié)果

2.1 平衡溶解度的測定

用搖瓶法測定HK在不同油相、表面活性劑和助表面活性劑中的溶解度[12]。于若干個干凈的玻璃小瓶中,分別加入待篩選的油、表面活性劑和助表面活性劑各1.5 mL,再加入過量的HK原料藥,加蓋密封,固定于水浴搖床中,(37±0.5) ℃持續(xù)振搖72 h,以10 000 r·min-1離心5 min,收集上清液,適當(dāng)稀釋后用高效液相色譜(HPLC)法檢測每個組分中HK的含量,計算平衡溶解度。結(jié)果見表1。

表1 和厚樸酚在不同輔料中的溶解度

由表1可見,HK在不同油中的溶解度順序為capryol 90>miglyol 812>capmul MCM C8>橄欖油>玉米油,在不同表面活性劑中溶解度的順序為labrasol>吐溫80>cremophor RH 40>cremophor EL 35,在不同助表面活性劑中溶解度的順序為trans-cutol P>PEG200。因此,本研究分別選擇capryol 90、labrasol和transcutol P作為HK-SEDDSs的油相、表面活性劑和助表面活性劑。

2.2 偽三元相圖的繪制

用水滴定法構(gòu)建偽三元相圖以確定SEDDSs的最佳自乳化區(qū)域[13]。按照表面活性劑與助表面活性劑質(zhì)量比為1∶1、1∶2、2∶1配制成表面活性劑混合物(Smix),再將Smix與油相以9∶1至1∶9的比例混合均勻,取各混合液1 mL,在磁力攪拌(50 r·min-1)下緩慢滴加0.1 mol·L-1鹽酸溶液(37±0.5) °C,觀察出現(xiàn)渾濁時各處方中油、Smix和水的用量,在偽三元相圖上標(biāo)出能夠形成微乳的區(qū)域。結(jié)果見圖1。自乳化區(qū)域面積越大表示自乳化能力越強[14]。

注:A.1∶1;B.1∶2;C.2∶1。O.油相;S.表面活性劑;Co-S.助表面活性劑。

由圖1可見,表面活性劑和助表面活性劑的比例為2∶1(圖1C)時形成的自乳化區(qū)域的面積最大。因此,以油相capryol 90的比例為5%～25%,表面活性劑labrasol的比例為35%～75%,助表面活性劑transcutol P的比例為10%～50%,進一步優(yōu)化HK-SEDDSs的處方。

2.3 HK-SEDDSs的制備

HK-SEDDSs處方中capryol 90、labrasol和transcutol P用量考察范圍見表2。根據(jù)表3中的處方組成,將capryol 90、labrasol和transcutol P加入玻璃小瓶中,渦旋混合形成均勻透明的SEDDSs,再將HK原料藥加入上述SEDDSs中,渦旋混合使藥物完全溶解,最終得到不同處方的HK-SEDDSs。

表2 HK-SEDDSs的自變量與因變量

表3 HK-SEDDSs的處方組成及對應(yīng)測定結(jié)果

2.4 質(zhì)量評價

2.4.1透射率的測定 取不同處方的HK-SEDDSs各0.5 g,加入0.1 mol·L-1鹽酸溶液稀釋100倍,形成微乳,用紫外可見分光光度計測定各樣品在638 nm處的透光率,通過透光率可初步判斷形成微乳粒徑的大小。

2.4.2自乳化時間的測定 于溶出杯中加入0.1 mol·L-1鹽酸溶液500 mL,溫度為(37±0.5) ℃,轉(zhuǎn)速為50 r·min-1,取不同處方的HK-SEDDSs各0.5 g,置于溶出杯中,肉眼觀察每組樣品自乳化形成微乳的時間,并做記錄。自乳化時間越短,表示自乳化能力越強。

2.4.3粒徑分布的測定 取不同處方的HK-SEDDSs各0.5 g,加入0.1 mol·L-1鹽酸溶液稀釋100倍,形成微乳,取上述樣品加入聚苯乙烯樣品池中,用Zetasizer Nano ZS型激光粒度儀測定粒度分布情況。

2.5 Box-Behnken實驗設(shè)計

根據(jù)偽三元相圖結(jié)果,以油相capryol 90的比例為5%～25%(x1)、表面活性劑labrasol的比例為35%～75%(x2)、助表面活性劑transcutol P的比例為10%～50%(x3)作為自變量,制備HK-SEDDSs,以HK-SEDDSs的透光率(y1)、自乳化時間(y2)和粒徑分布(y3)作為評價指標(biāo)。因素與水平見表2。用3因素3水平Box-Behnken實驗設(shè)計對其處方進行研究[15],共進行17次實驗,結(jié)果見表3。所得的實驗數(shù)據(jù)使用方差分析、多元二次方程和效應(yīng)面圖進行評價。capryol 90、labrasol和transcutol P不同比例對HK-SEDDSs透光率影響的方差分析結(jié)果見表4。capryol 90,labrasol和transcutol P不同比例對HK-SEDDSs的透光率的效應(yīng)面圖見圖2。capryol 90、labrasol和transcutol P不同比例對HK-SEDDSs自乳化時間影響的方差分析結(jié)果見表5。capryol 90、labrasol和transcutol P不同比例對HK-SEDDSs的自乳化時間影響的效應(yīng)面圖見圖3。capryol 90、labrasol和transcutol P不同比例對HK-SEDDSs粒徑分布影響的方差分析結(jié)果見表6。capryol 90、labrasol和transcutol P不同比例對HK-SEDDSs粒徑分布影響的效應(yīng)面圖見圖4。

圖2 Capryol 90 (x1)、labrasol (x2)和transcutol P (x3)不同比例對HK-SEDDSs透光率 (y1)影響的效應(yīng)面圖

圖4 Capryol 90 (x1)、labrasol (x2)和transcutol P (x3)不同比例對HK-SEDDSs粒徑分布(y3)影響的效應(yīng)面圖

表4 capryol 90(x1)、labrasol(x2)和transcutol P(x3)不同比例對HK-SEDDSs透光率(y1)影響的方差分析結(jié)果

表5 Capryol 90(x1)、labrasol(x2)和transcutol P(x3)不同比例對HK-SEDDSs自乳化時間(y2)影響的方差分析結(jié)果

表6 capryol 90 (x1)、labrasol(x2)和transcutol P(x3)不同比例對HK-SEDDSs粒徑分布(y3)影響的方差分析結(jié)果

所制備的17組HK-SEDDSs樣品的透射率在82.4%～98.1%范圍內(nèi),由表4可見,capryol 90的比例(x1)、labrasol的比例(x2)和transcutol P的比例(x3)對HK-SEDDSs的透光率(y1)均具有顯著影響(P<0.05)。由圖2可見,隨著處方中油相capryol 90比例的上升,HK-SEDDSs的透光率增大,這是由于表面活性劑和助表面活性劑的量不足造成的;而隨著處方中表面活性劑labrasol和助表面活性劑transcutol P比例的上升,HK-SEDDSs的透光率增大,這是由于表面活性劑和輔助表面活性劑共同作用降低了油水界面的張力,使形成的微乳的粒徑更小,提高了透光率。使用多元二次方程對3個變量與透光率(y1)之間的關(guān)系進行方程擬合:y1=96.34-3.50x1+3.05x2+2.17x3+2.38x1x2-1.02x1x3-0.42x2x3-3.28x12-1.93x22-2.38x32(R2=0.989 7)。

所制備的17組HK-SEDDSs樣品的自乳化時間在23～147 s范圍內(nèi)。由表5可見,capryol 90比例(x1)、labrasol比例(x2)和transcutol P比例(x3)對HK-SEDDSs的自乳化時間(y2)均具有顯著影響(P<0.05)。由圖3可見,隨著處方中油相capryol 90比例的上升,HK-SEDDSs的自乳化時間有所延長,而隨著處方中表面活性劑labrasol比例和助表面活性劑transcutol P比例的上升,HK-SEDDSs的自乳化時間縮短,這是由于表面活性劑和輔助表面活性劑共同作用降低了油水界面的張力,提高了自乳化性能。3個變量與自乳化時間(y2)之間的二次多項式擬合方程為y2=63.20+30.62x1-19.75x2-23.13x3-13.25x1x2-9.00x1x3+14.25x2x3+22.40x12-2.35x22-7.60x32(R2=0.999 6)。

所制備的17組HK-SEDDSs樣品形成的微乳粒徑分布在29.5～214.6 nm范圍內(nèi)。由表6可見,capryol 90比例(x1)、labrasol比例(x2)和transcutol P比例(x3)對HK-SEDDSs形成的微乳粒徑的分布(y3)均具有顯著影響(P<0.05)。由圖4可見,隨著處方中油相capryol 90比例的上升,微乳的粒徑增大;隨著處方中表面活性劑labrasol比例和助表面活性劑transcutol P比例的上升,微乳的粒徑減小。3個變量與粒徑分布(y1)之間的二次多項式擬合方程為y3=113.08+60.04x1-32.77x2-20.66x3-14.93x1x2+1.00x1x3+6.83x2x3-6.32x12+3.26x22+3.69x32(R2=0.996 9)。

HK-SEDDSs口服進入體內(nèi),要求在短時間內(nèi)迅速自乳化形成粒徑較小的微乳,這樣有利于藥物的充分吸收與利用[16],因此本研究要求制備的HK-SEDDSs的透光率最大化,自乳化時間最短化,形成的微乳粒徑分布最小化。經(jīng)實驗軟件優(yōu)化得到HK-SEDDSs的最佳處方為capryol 90、labrasol和trans-cutol P的質(zhì)量比為10∶60∶30。

2.6 HK-SEDDSs性質(zhì)研究

2.6.1熱力學(xué)穩(wěn)定性 本研究用離心、低溫-高溫循環(huán)、冷凍-高溫循環(huán)評價HK-SEDDSs的熱力學(xué)穩(wěn)定性[17]。①離心考察:取HK-SEDDSs 0.5 g,加入0.1 mol·L-1鹽酸溶液稀釋100倍,以10 000 r·min-1離心20 min,肉眼觀察是否存在相分離和相轉(zhuǎn)變現(xiàn)象。②低溫-高溫循環(huán)考察:取HK-SEDDSs 1 g置于西林瓶中,在5 ℃放置48 h,取出后放置在40 ℃下48 h,連續(xù)進行3次循環(huán),肉眼觀察是否存在相分離和相轉(zhuǎn)變現(xiàn)象。③冷凍-高溫循環(huán)考察:取HK-SEDDSs 1 g置于西林瓶中,在-20 ℃放置48 h,取出后在40 ℃放置48 h,連續(xù)進行3次循環(huán),肉眼觀察是否存在相分離和相轉(zhuǎn)變現(xiàn)象。實驗結(jié)果顯示,HK-SEDDSs經(jīng)離心、低溫-高溫循環(huán)和冷凍-高溫循環(huán),均未出現(xiàn)相分離和相轉(zhuǎn)變現(xiàn)象,表明HK-SEDDSs的熱力學(xué)穩(wěn)定性良好。

2.6.2微觀形態(tài)觀察 取HK-SEDDSs 0.5 g,加入0.1 mol·L-1鹽酸溶液稀釋100倍,形成微乳,將1滴微乳液置于碳涂層銅網(wǎng)上,均勻鋪展,再將1滴磷鎢酸滴加到樣品表面,等待10 min,用濾紙在邊緣吸收多余水分,置于陰涼處風(fēng)干。將樣品放置在透射電子顯微鏡下觀察微乳的微觀形態(tài),見圖5。由圖5可見,HK-SEDDSs形成的微乳以圓球形均勻分散,其粒徑大部分在30～80 nm范圍內(nèi)。

圖5 HK-SEDDSs形成的微乳的透射電鏡照片

2.7 藥物溶出研究

用槳法比較HK-SEDDSs與HK原料藥的體外溶出速率,以0.1 mol·L-1鹽酸溶液作為溶出介質(zhì),取介質(zhì)500 mL置于溶出杯中,溫度為(37±0.5) ℃;將HK-SEDDSs置于透析袋(截留相對分子質(zhì)量為12 000)中,系住兩端,固定在攪拌槳上,開啟攪拌槳,轉(zhuǎn)速為100 r·min-1,在預(yù)設(shè)時間間隔(10、20、30、45、60、90、120 min)吸取5 mL溶出介質(zhì),經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾,進樣檢測藥物含量,計算藥物累積溶出度。另取HK原料藥直接置于溶出杯中,操作同上。比較HK-SEDDSs與HK原料藥的體外溶出速率,結(jié)果見圖6。由圖6可見,HK-SEDDSs中藥物的釋放速度較快,在10 min內(nèi)超過60%的藥物溶出,在30 min內(nèi)藥物基本完全溶出。相比之下,HK原料藥的溶出速率較為緩慢,在120 min內(nèi)僅有約25%的藥物溶出。

圖6 HK-SEDDSs與HK原料藥在pH 1.2鹽酸溶液中的溶出曲線

2.8 生物利用度研究

用Wistar大鼠(200～250 g)研究HK-SEDDSs的體內(nèi)藥動學(xué)行為。實驗前大鼠禁食12 h,可自由飲水。將大鼠分為2組,第1組通過灌胃針口服給予HK混懸液,第2組通過灌胃針口服給予HK-SEDDSs,給藥劑量均為50 mg·kg-1?？诜o藥后,在不同時間點(15、30 min,1、2、4、6、8、12 h)經(jīng)眼眶靜脈叢取血樣,置于預(yù)肝素化離心管中,以4 000 r·min-1離心15 min,分離上層血漿,置于-20 °C冰箱中保存。取血漿樣品200 μL,加入紫杉醇溶液50 μL作為內(nèi)標(biāo),渦旋混合5 min,加入乙腈500 μL沉淀蛋白,以12 000 r·min-1離心10 min,分離有機相至尖底離心管中,減壓干燥,殘留物用200 μL乙腈溶解,用HPLC法分析血漿樣品中藥物的質(zhì)量濃度[18]。色譜條件:色譜柱為C18柱(250 mm×4.5 mm,5 μm);流動相為10 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液(pH 4.5)-乙腈(80∶20);檢測波長為225 nm;進樣量為20 μL。使用DAS 2.0藥動學(xué)軟件計算達峰時間(tmax)、達峰濃度(cmax)、半衰期(t1/2)、血藥質(zhì)量濃度-時間曲線下面積(AUC0→∞)等藥動學(xué)參數(shù)。結(jié)果見表7。

表7 HK混懸劑和HK-SEDDSs經(jīng)口服給藥后在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)參數(shù)

由表7可見,HK混懸劑和HK-SEDDSs的tmax分別為(1.1±0.6)、(0.7±0.4) h,cmax分別為(395.3±35.7)、(633.6±54.2) ng·mL-1,t1/2分別為(8.3±1.6)、(8.0±1.3) h,AUC0→∞分別為(1 478.8±105.3)、(2 531.6±174.3) ng·mL-1·h-1;與HK混懸劑組比較,HK-SEDDSs中HK的相對生物利用度達到了159.0%。

3 討論

本研究通過測定HK在各種輔料中的溶解度,確定了處方中油相、表面活性劑和助表面活性劑的種類,進一步采用水滴定法繪制了HK-SEDDSs的偽三元相圖,確定了處方中油相、表面活性劑和助表面活性劑的質(zhì)量比范圍,最終通過Box-Behnken實驗設(shè)計得到HK-SEDDSs的最佳處方組成:capryol 90為油相,cremophor EL為表面活性劑,transcutol P為助表面活性劑,三者的質(zhì)量比為10∶60∶30,用最優(yōu)處方制備的HK-SEDDSs具有熱力學(xué)穩(wěn)定性好、自乳化速度快、形成的微乳透光率高、粒徑小且分布均勻、藥物溶出速度快的優(yōu)點,為開展動物體內(nèi)藥動學(xué)評價奠定了藥學(xué)基礎(chǔ)。

藥動學(xué)結(jié)果顯示,口服HK-SEDDSs組大鼠的cmax和AUC(0→∞)均明顯提高,分別是口服HK混懸劑組大鼠的1.6倍和1.6倍(P<0.05),這是由于HK-SEDDSs進入體內(nèi)迅速形成粒徑極小、比表面積極大的微乳,提高了藥物的溶解度,促進了藥物的吸收。

本研究制備的HK-SEDDSs雖然顯著提高了HK的口服生物利用度,但是HK-SEDDSs是以液體狀態(tài)存在,不利于藥物的保存及患者的使用,后續(xù)會將HK-SEDDSs開發(fā)成易于儲存和便于攜帶與使用的固體制劑。