馬騰飛,喻肖瑤,趙天濤,吳 進,封 麗

(1.重慶市生態(tài)環(huán)境科學研究院 水環(huán)境工程技術創(chuàng)新中心, 重慶 401147;2.重慶工商大學 國家智能制造服務國際科技合作基地, 重慶 400067;3.重慶理工大學 化學化工學院, 重慶 400054)

0 引言

自1982年Liedeberg等證明了表面等離體共振(surface plasmon resonance,SPR)作為一種光學生物傳感器的效用以來[1],SPR技術在生物傳感器領域得到了快速的發(fā)展和應用。SPR傳感器在生物分子相互作用研究方面具有用樣量少、無損免標記和實時監(jiān)測的優(yōu)勢。因此,SPR生物傳感器在基礎生物學研究[2-5]、藥物發(fā)現(xiàn)和臨床診斷[6-8]、環(huán)境和農(nóng)業(yè)監(jiān)測[9-11]中的應用越來越廣泛。

SPR成像技術(surface plasmon resonance imaging,SPRI),也被稱為“SPR顯微鏡”[12],由Rothenh?usler等[13]在1988年首次提出,隨后相關領域研究獲得了快速增長[14-15]。與傳統(tǒng)的SPR生物傳感器相比,SPRI提供的是傳感器芯片表面區(qū)域的平均共振信號隨時間的變化情況。利用SPRI技術可以研究芯片表面的特定區(qū)域(regions of interest,ROI),通過成像設備(通常是CCD或CMOS相機)記錄芯片表面的SPR圖像。因此,當芯片表面設計有大量的ROI(如微陣列)時,可以實現(xiàn)高通量的分析。此外,在SPRI系統(tǒng)中引入透鏡[16-18](通常在棱鏡和相機之間),或者用高數(shù)值孔徑物鏡代替棱鏡[19-21]時,可以獲得芯片表面的高空間分辨率圖像。

SPRI的優(yōu)點使其不僅可以用于生物分子研究,如蛋白質[22-23]、DNA[24-25]、RNA[26-27],而且可以用于人體細胞研究,如細胞生理變化與表面的相互作用,以及細胞感應等[28]。然而,相比生物分子和人體細胞研究領域,在與人類生產(chǎn)生活和生命健康關聯(lián)緊密的細菌研究領域,SPRI的應用進展相對緩慢和有限。其主要原因可能是樣品復雜的處理要求和潛在的儀器污損問題[28]。隨著近些年來SPRI技術的不斷發(fā)展進步,SPRI技術用于細菌領域的研究也不斷增多。

為了引起更多相關領域研究人員的興趣和關注,展示SPRI技術在細菌分析與檢測領域的良好應用前景,總結了過去十年中涉及細菌領域的相關SPRI研究,主要包括SPRI的基本原理介紹,SPRI用于單細菌行為和生物膜分析方面的研究,以及SPRI在細菌檢測與鑒定方面的應用情況。同時對SPRI技術未來在細菌分析與檢測領域的應用提出了展望,以期為SPRI技術進一步應用于細菌研究相關領域提供參考。

1 SPRI原理簡介

當外部光以一定條件入射在金屬表面,并在金屬/電介質界面上誘導金屬的自由電子振蕩產(chǎn)生共振時,就會發(fā)生SPR現(xiàn)象。因此,在一定的入射角度下,金屬吸收了輻射能量并顯示出反射率的最小值。這個共振角對與金屬表面(通常在垂直方向300 nm內)接觸的電介質(即實驗中的樣品)的折射率極為敏感。當共振角固定時,樣品的折射率變化導致反射率的變化,這可以在SPR圖像中得到體現(xiàn)。SPRI工作原理見圖1[29]。與傳感表面的折射率分布相對應的反射光被CCD相機捕捉,并轉化為2D強度對比圖像[29]。

圖1 SPRI工作原理示意圖

2 SPRI用于單個細菌研究

2.1 蛋白質與單個細菌相互作用

當與外部配體相互作用時,由于固有的細胞間的異質性,單個細菌細胞的反應可能不同。然而,這種異質性會在細菌群體研究中被忽略了,因為對細菌群體研究中獲得的數(shù)據(jù)通常是許多細菌的平均值。SPRI技術的出現(xiàn)為從單菌水平上測量配體與細菌相互作用的結合動力學提供了新的思路[30]。通過將個體細菌修飾于SPRI芯片表面,隨后用SPRI系統(tǒng)對抗體與細菌的結合過程和解離過程進行監(jiān)測,最后可以從圖像序列提取的反射光強度隨時間的變化曲線中獲得詳細的動力學信息。結果表明,盡管所獲得的動力學常數(shù)的平均值與體外實驗研究的數(shù)據(jù)水平一致,但在結合動力學方面存在著較大的細菌個體間差異,不同細菌個體間的動力學常數(shù)甚至存在著若干個數(shù)量級水平的差異,這些差異可能與細菌表面抗原表達和分布的不同有關。這項研究顯示了細菌與外部配體結合能力的異質性,進而表明了SPRI技術在單個細菌水平上探索細菌生理特性的潛力。

2.2 單個細菌活性研究

細菌由于其自身代謝等生理活動,附著于物體表面時會表現(xiàn)出納米級別的“抖動”行為,常規(guī)的光學顯微鏡和電子顯微鏡無法觀察到細菌的這種行為,而利用SPRI技術則可以實現(xiàn)對細菌的這種“抖動”行為的監(jiān)測[31-32]。Syal等[31]通過觀察營養(yǎng)物質和不同抗生素作用下細菌在SPRI芯片表面的“抖動”情況,證明細菌在芯片表面垂直方向上的振幅變化可以用來表征細菌活性變化,從而實現(xiàn)對細菌活性的實時快速判定?；诖?SPRI技術可以作為一種快速的抗生素敏感性測試方法[31],較傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)方法節(jié)省大量時間。類似地,Liu等[32]采用SPRI方法來監(jiān)測水中存在不同化學物質時單個細菌的活性,從而快速評估化學物質的急性毒理作用。因此,SPRI技術可以作為一種實時快速檢測細菌活性的技術手段,從而用于抗菌藥物研發(fā)和物質毒性毒理方面的研究。

3 SPRI用于細菌生物膜研究

生物膜是細菌存在的一種常見形式,在細菌感染、細菌抗藥性和廢水處理等領域都有大量研究。傳統(tǒng)的生物膜研究方式主要集中于生物膜生物量、表面形貌結構,由于技術手段要求,在取樣備樣過程中可能對生物膜結構或細菌活性構成損傷,且難以實現(xiàn)實時觀測。SPRI技術的出現(xiàn)為生物膜研究提供了一個新的視角。

通過對芯片表面進行修飾模擬生物膜附著生長的基底表面,根據(jù)細菌在芯片表面附著生長時產(chǎn)生的光強信號變化,SPRI技術可以實現(xiàn)對芯片表面細菌附著情況和生物膜形成過程的實時監(jiān)測。Abadian等首次使用SPRI對大腸桿菌和銅綠假單胞的生物膜形成和清除過程進行觀察[33],并用SPRI檢驗了牛血清蛋白和酪蛋白作為表面涂層對銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌生物膜形成的預防效果[34]。類似地,Aninwene等[35]利用SPRI分別觀察了金黃色葡萄球菌在修飾有糖蛋白潤滑素(LUB)涂層的芯片和修飾有牛頜下腺粘蛋白(BSM)涂層的芯片表面的附著和成膜能力,結果表明金黃色葡萄球菌在LUB涂層表面的附著和成膜能力下降90%以上,在BSM表面僅下降7%左右。這些研究充分展現(xiàn)了SPRI技術在生物膜研究和抗生物膜材料研發(fā)方向的良好應用前景。

4 SPRI用于細菌定性/定量檢測

對環(huán)境樣品或指定樣品中的細菌進行定性鑒定和/或定量檢測,在污染防治、食品安全和醫(yī)療衛(wèi)生領域均具有重要意義。SPRI技術由于其用樣量少、可以實時快速檢測的優(yōu)勢,已在細菌鑒定和檢測方面顯示了巨大潛力。現(xiàn)有研究報道中,根據(jù)檢測時是否在芯片表面對細菌進行了一定時間的培養(yǎng),可將檢測方法分為非培養(yǎng)檢測和培養(yǎng)檢測兩類。

4.1 非培養(yǎng)檢測

非培養(yǎng)檢測主要利用細菌的表面特異性實現(xiàn)。常用的方法包括直接檢測法和強化檢測法。直接檢測法通過在芯片表面修飾可以捕獲細菌的抗體或其他物質,從而將樣品中的細菌固定在芯片表面,由此產(chǎn)生的SPRI檢測信號變化表明細菌的存在并用于計算細菌的數(shù)量。當樣品中細菌含量較低時,直接法檢測信號弱,檢出限高,因此其使用較為受限。強化檢測法是在直接檢測法的基礎上通過在捕獲的細菌表面流過含有特異性抗體或探針的溶液,實現(xiàn)對SPRI檢測信號的進一步放大。強化法檢出信號強,檢出限低,可以檢出樣品中較低含量的細菌,因此,得到研究人員的更多關注。

Yodmongkol等[36]采用強化檢測法對溶液中的白色念珠菌進行檢測。首先在SPRI芯片表面修飾一層11-巰基十二烷酸分子層,用于固定白色念珠菌特異性抗體,當溶液中的白色念珠菌被芯片表面的抗體捕獲后,再次在溶液中流過白色念珠菌特異性抗體,從而實現(xiàn)檢測信號的放大。由于使用了針對白色念珠菌表面特異性抗原的特異性抗體,該方法可以從白色念珠菌、大腸桿菌、變異鏈球菌、金黃色葡萄球菌、β-鏈球菌和干酪乳桿菌的混合樣品中檢測出白色念珠菌的含量。類似地,Puttharugsa等[37]采用強化檢測法對植物樣品中致病菌Acidovoraxavenaesubsp.citrulli(Aac)進行檢測,在使用多克隆抗體對SPR信號進行放大后,SPRI系統(tǒng)對Aac的檢出限可達5×105CFU/ml。

除了利用細菌表面特性進行檢測,Foudeh等[38]提出利用環(huán)境中細菌的16s rRNA進行定性檢測。因為環(huán)境中RNA的存在與活細菌活動直接相關,而死亡的細菌的RNA會快速降解[39]。Foudeh等[38]采用SPRI技術對水體中引發(fā)軍團病的Legionellapneumophila細菌進行檢測,對L.pneumophila16s rRNA的檢測方法與細菌強化檢測法類似,首先在SPRI芯片表面修飾上與L.pneumophila16s rRNA互補的DNA探針,然后將含有目標RNA,以及可以與目標RNA互補的識別探針的樣品流過芯片表面,樣品中的目標RNA被DNA探針所捕獲,同時識別探針也與被捕獲的RNA結合,而識別探針上同時含有可與量子點結合的基團,當最后含有量子點的溶液加入后,被捕獲的RNA因結合了量子點,產(chǎn)生的SRPI信號得到進一步放大,從而實現(xiàn)了對水環(huán)境樣品中RNA在亞飛摩爾(sub-femtomole)水平上的快速檢出。

4.2 培養(yǎng)檢測

非培養(yǎng)檢測法中的直接法由于對低濃度細菌樣品檢測信號弱而應用受限,因此研究人員考慮對芯片表面捕獲的細菌進行培養(yǎng),以增強檢測信號。Bouguelia等[40]研究發(fā)現(xiàn),隨著細菌增殖,SPRI信號不斷增強,可以根據(jù)細菌濃度變化、細菌世代時間、SPRI信號變化和培養(yǎng)時間之間的量化關系,反推出培養(yǎng)初期的細菌濃度,即樣品中的細菌濃度。該方法可用于對Salmonellaenterica,Streptococcuspneumoniae和EscherichiacoliO157∶H7的檢測,檢出限可低至(2.8±19.6)CFU/mL。類似地,基于培養(yǎng)檢測法,Morlay等[41]采用SPRI技術實現(xiàn)嬰兒配方粉中的食品病原體克羅諾桿菌和沙門氏菌的快速檢測,檢出限可達30 CFU/25g奶粉;Mondani等[42]實現(xiàn)對不同溫度范圍內保存的食物樣品中E.coliO157∶H7的有效檢測;Mallevre等[43]則利用SPRI技術觀察了納米氧化銀壓力下細菌的生長情況,實現(xiàn)了實時毒性檢測研究。

非培養(yǎng)檢測方法中的強化檢出法可以獲得較好的檢出限,但使用的抗體普遍較昂貴,因此研究人員也嘗試通過采用較為經(jīng)濟的物質替代抗體的方式來降低實驗成本。Bulard等[44]采用碳水化合物修飾到芯片表面以固定細菌。當細菌被固定到芯片表面后,實時記錄生物芯片上細菌生長的SPRI信號。通過對細菌SPRI信號和對照信號處理獲得不同菌株的“差分時間”,進而得到碳水化合物芯片對不同菌株的指紋圖譜。該方法可以實現(xiàn)10 h內對5種初始濃度僅為102CFU/mL的大腸桿菌菌株的有效區(qū)分和檢測,在食品安全領域顯示出良好的應用前景。

5 結束語

SPRI技術具有樣品用量少、實時快速和樣品無損監(jiān)測/檢測的優(yōu)點,在環(huán)境、農(nóng)業(yè)、食品安全和醫(yī)療衛(wèi)生領域的細菌分析與檢測方面具有良好的應用前景。未來仍有許多需要深入研究的地方,以進一步提高細菌檢測結果的精準度和細菌生理機制等方面研究的深度,以及繼續(xù)降低實驗成本等。相關的研究方向包括但不限于:① 實際樣品預處理方法,如對影響背景信號的高鹽度樣品進行脫鹽處理;② SPRI芯片的修飾及再生方法,如結合目標菌株表面特性尋找或研發(fā)吸附結合力強且對細菌活性影響較小的芯片修飾物質,研制廉價易再生的芯片修飾涂層等;③ SPRI與其他技術的結合應用,如與電化學技術結合,檢測小分子物質與細菌的結合動力學[45],或是與質譜技術進行結合,探究不同條件下細菌分泌胞外蛋白和代謝產(chǎn)物情況[46];④ 對圖像數(shù)據(jù)處理方法進行優(yōu)化,如引入計算機深度學習[47]等算法提升數(shù)據(jù)處理精準度等。