楊彩虹，趙詠中，漆晶晶，靳 新，李曉雪，李興榮

（ 武威市畜牧獸醫(yī)總站，甘肅 武威 733000 ）

牛病毒性腹瀉/黏膜病（bovine viral diarrhea/mucosal disease，BVD/MD）是由牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）感染引起的一種接觸性傳染病，根據(jù)臨床癥狀不同分為臨床急性感染癥狀（稱為牛病毒性腹瀉，BVD）、臨床持續(xù)性感染、臨床慢性感染癥狀（稱為黏膜病，MD）[1]。牛是BVDV主要的易感動(dòng)物，豬、綿羊、山羊、駱駝等也是易感動(dòng)物，可通過(guò)水平和垂直方式進(jìn)行傳播。BVD/MD最早由Olafson等[2]在美國(guó)紐約發(fā)現(xiàn)，隨后在多個(gè)國(guó)家和地區(qū)廣泛傳播。在我國(guó)，自李佑民等[3]在吉林發(fā)現(xiàn)并分離到第一株BVDV以來(lái)，全國(guó)各地相繼報(bào)道了BVDV的感染和流行情況[4-6]。Ran等[7]、Deng等[8]研究結(jié)果顯示，我國(guó)北方奶牛群BVDV 平均抗體陽(yáng)性率為72.2%，東部地區(qū)牛群BVDV平均抗原陽(yáng)性率為41.19%，BVDV感染形勢(shì)嚴(yán)峻。感染BVDV 后引起的免疫抑制、繁殖障礙、持續(xù)性感染及其他病原體的混合感染，可使?fàn)倥Ｋ劳雎屎吞蕴试黾?%以上、青年牛死亡率達(dá)20%以上，阻礙了養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展并造成重大經(jīng)濟(jì)損失[9-12]。

據(jù)世界各國(guó)防控BVDV 的經(jīng)驗(yàn)[13-14]，開(kāi)展流行病學(xué)調(diào)查是BVDV 防控與凈化的前提。為調(diào)查當(dāng)前BVDV 在武威市肉牛群體的感染情況，本研究從武威市各縣區(qū)（民勤縣、古浪縣、天?？h、涼州區(qū)）、不同養(yǎng)殖類型（散養(yǎng)、規(guī)模化）、不同生長(zhǎng)階段（犢牛、青年牛、成母牛）的牛群中采集血樣512 份，利用商品化試劑盒對(duì)采集的樣品進(jìn)行BVDV抗體檢測(cè)；并從各縣區(qū)采集具有腹瀉癥狀的肉牛新鮮糞便425 份，利用RT-PCR 方法進(jìn)行病原檢測(cè)。通過(guò)檢測(cè)結(jié)果掌握BVDV感染和流行現(xiàn)狀，以期為武威市肉牛BVDV的防控和凈化工作提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

血液樣品：2022 年2 月至2023 年4 月，采集自武威市各縣區(qū)未經(jīng)BVD 疫苗免疫的不同年齡段肉牛血液樣品512 份，其中涼州區(qū)125 份、古浪縣128 份、民勤縣132 份、天?？h127份，具體采樣信息見(jiàn)表1。

表1 血液樣品采集信息Tab.1 Blood sample collection information

糞便樣品：2022 年2 月至2023 年4 月，采集武威市各縣區(qū)未經(jīng)免疫的規(guī)模場(chǎng)具有腹瀉癥狀肉牛新鮮糞便425 份，其中涼州區(qū)120 份、古浪縣103 份、民勤縣105 份、天?？h97份，具體采樣信息見(jiàn)表2。

表2 糞便樣品采集信息Tab.2 Fecal samples collection information

1.2 試劑與儀器

BVDV Ab99-44000 牛病毒性腹瀉抗體檢測(cè)試劑盒（IDEXX公司）、RNA提取試劑盒（天根生化科技（北京）公司）、一步反應(yīng)RT-PCR試劑盒（寶生物工程（大連）有限公司）?？鼓裳?、恒溫培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀、PCR儀、電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)、高速離心機(jī)等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 BVDV血清抗體檢測(cè)

血液樣品經(jīng)37 ℃恒溫箱靜置30 min 后放入4 ℃冰箱，待血清析出后吸取上清，置于-20 ℃冰箱保存，采用商品化的牛病毒性腹瀉抗體檢測(cè)試劑進(jìn)行BVDV抗體檢測(cè)，具體操作方法按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

BVDV 抗體檢測(cè)結(jié)果判定：S/P=（樣品OD450nm值-陰性平均OD450nm值）/（陽(yáng)性平均OD450nm值-陰性平均OD450nm值）；若NC-x≤0.25，S/P≥0.3 判定為陽(yáng)性（+），0.2≤S/P＜0.3判定為可疑（±），S/P＜0.20判定為陰性（-）。

1.3.2 BVDV病原RT-PCR檢測(cè)

糞便樣品中加入6～7 mL PBS 振蕩搖勻，12 000 r/min離心10 min取上清置于-20 ℃冰箱保存，按照RNA提取試劑盒說(shuō)明書提取病毒基因組RNA，對(duì)其進(jìn)行一步法RTPCR擴(kuò)增。

根據(jù)GenBank上登錄的BVDV基因組序列，選擇基因組中高度保守的5'-UTR 區(qū)域設(shè)計(jì)1 對(duì)特異性引物，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，目的片段大小為297 bp，引物信息見(jiàn)表3。

表3 引物信息Tab.3 Primer information

擴(kuò)增體系（20 μL）：ddH2O 5.5 μL、2×Buffer 10 μL、酶0.5 μL、上下游引物各0.5 μL、RNA 3.0 μL。

擴(kuò)增程序：50 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min；95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

擴(kuò)增結(jié)束后取5 μL PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，觀察并記錄擴(kuò)增結(jié)果，統(tǒng)計(jì)BVDV病原陽(yáng)性率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)錄入Excel軟件進(jìn)行匯總整理。

2 結(jié)果與分析

2.1 BVDV抗體檢測(cè)結(jié)果

2.1.1 不同地區(qū)肉牛BVDV血清抗體檢測(cè)結(jié)果（見(jiàn)表4）

表4 不同地區(qū)肉牛BVDV血清抗體檢測(cè)結(jié)果Tab.4 Detection results of BVDV serum antibody in beef cattle from different regions

由表4可知，武威市肉牛血清共檢出陽(yáng)性樣品308份，抗體總陽(yáng)性率為60.16%（308/512），其中涼州區(qū)樣品陽(yáng)性率最高為71.20%（89/125），天祝縣樣品陽(yáng)性率最低為44.88%（57/127）。

2.1.2 不同年齡段肉牛BVDV血清抗體檢測(cè)結(jié)果(見(jiàn)表5)

表5 不同年齡段肉牛BVDV血清抗體檢測(cè)結(jié)果Tab.5 Detection results of BVDV serum antibody in beef cattle of different ages

由表5 可知，不同年齡段牛群均有BVDV 感染，青年牛和成年母牛BVDV抗體陽(yáng)性率相差不大，犢牛抗體陽(yáng)性率最低為26.47%（111/158），成母?？贵w陽(yáng)性率最高為74.45%（142/184）。

2.1.3 不同養(yǎng)殖模式下肉牛BVDV 血清抗體檢測(cè)結(jié)果（見(jiàn)表6）

表6 不同養(yǎng)殖模式下肉牛BVDV血清抗體檢測(cè)結(jié)果Tab.6 Detection results of BVDV serum antibody in beef cattle under different breeding modes

由表6 可知，武威市各縣區(qū)規(guī)模場(chǎng)和散養(yǎng)戶肉牛BVDV 血清抗體陽(yáng)性率相差不大，規(guī)模場(chǎng)為57.06%（225/375），散養(yǎng)戶為55.47%（83/137）。

2.2 BVDV病原檢測(cè)結(jié)果（見(jiàn)圖1、表7）

圖1 部分樣品RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Results of RT-PCR amplification of some samples

表7 不同地區(qū)肉牛糞便BVDV病原檢測(cè)結(jié)果Tab.7 Detection results of BVDV pathogen in beef cattle feces from different regions

采用RT-PCR方法對(duì)采集到的具有腹瀉癥狀的425份新鮮肉牛糞便樣品進(jìn)行病原檢測(cè)，部分樣品RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1。

由表7 可知，武威市不同縣區(qū)規(guī)模場(chǎng)肉牛群均存在BVDV的感染，病原總陽(yáng)性率為7.76%（33/425），各縣區(qū)感染情況存在差異，其中天?？h糞便樣品病原陽(yáng)性率最低為2.06%（2/97），涼州區(qū)最高為15.83%（19/120）。

3 討論

近年來(lái)，隨著養(yǎng)牛業(yè)的快速發(fā)展及交易運(yùn)輸，BVD 的發(fā)生與傳播隨之增加，如Deng 等[15]對(duì)全國(guó)范圍內(nèi)的奶牛進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查顯示抗體陽(yáng)性率高達(dá)89.49%，抗原陽(yáng)性率高達(dá)32.06%，感染情況較為嚴(yán)重。當(dāng)前，BVD已成為危害養(yǎng)牛業(yè)的主要傳染病之一，該病的防控和凈化工作迫在眉睫[16]。

本研究中，武威市各縣區(qū)肉牛BVDV抗體總陽(yáng)性率為60.16%，病原總陽(yáng)性率為7.76%?？贵w總陽(yáng)性率水平高于2016 年李勇生等[17]對(duì)甘肅省部分地區(qū)進(jìn)行調(diào)查得到的56.36%，以及陳穎彬等[18]、高亞桃等[19]對(duì)河北及周邊地區(qū)BVDV 流行病學(xué)調(diào)查的40.5%；抗體總陽(yáng)性率水平低于張忠輝等[20]在青海地區(qū)調(diào)查的82.3%以及劉澤余等[21]吉林地區(qū)牧場(chǎng)調(diào)查的77.1%。病原陽(yáng)性率高于山東地區(qū)的0.49%[22]、寧夏地區(qū)2.71%[23]和河南地區(qū)的1.77%[24]；與四川、西藏高原地區(qū)19.46%[25]、吉林地區(qū)23.40%[21]、寧夏銀川地區(qū)17.24%[26]部分牧場(chǎng)BVDV病原陽(yáng)性率相比較偏低。因此，在國(guó)內(nèi)不同地區(qū)，BVDV 感染因地域、調(diào)運(yùn)、防控措施等不同而存在差異，但均處于較高水平。

從不同年齡段肉牛感染BVDV 情況來(lái)看，成年母牛（74.45%）和青年牛（68.35%）的抗體陽(yáng)性率高于犢牛（26.47%）。與李天增等[5]對(duì)全國(guó)98 家規(guī)模牛場(chǎng)BVDV 抗體陽(yáng)性率調(diào)查結(jié)果相比，犢牛群（30.16%～47.87%）偏低，青年牛群（51.35%～73.02%）基本保持一致。呈現(xiàn)犢牛群BVDV 抗體陽(yáng)性率較低，一方面與4～6 月齡犢牛獲得的母源抗體自然消退有關(guān)；另一方面可能是部分母牛在妊娠早期（30～125 d）感染了BVDV，所產(chǎn)犢牛屬于持續(xù)性感染牛（persistent infection，PI），對(duì)BVDV產(chǎn)生免疫抑制。從養(yǎng)殖模式來(lái)看，規(guī)模場(chǎng)BVDV 抗體陽(yáng)性率略高于散養(yǎng)戶，可見(jiàn)BVD 的防控?zé)o論是在規(guī)模場(chǎng)還是散養(yǎng)戶均應(yīng)引起足夠重視。

武威市涼州區(qū)BVDV 感染病原、抗體陽(yáng)性率均為最高，天?？h最低。其中涼州區(qū)BVDV 感染病原陽(yáng)性率（15.83%）與王衡等[27]2019年所做調(diào)查得出的19.77%相比有所下降。通常情況下不同采樣方法、采樣時(shí)間及牧場(chǎng)選擇均會(huì)引起調(diào)查結(jié)果不一致；也有可能隨著農(nóng)場(chǎng)主對(duì)BVD認(rèn)知程度增加，疫病防控措施及時(shí)跟進(jìn)，使BVDV 感染率有所下降。此外，研究顯示，牛群感染BVDV 后短時(shí)間內(nèi)不會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，疾病的發(fā)展進(jìn)程同樣會(huì)導(dǎo)致調(diào)查結(jié)果差異。盡管如此，本調(diào)查結(jié)果顯示，武威市內(nèi)以涼州區(qū)BVDV的感染形勢(shì)最為嚴(yán)峻，需要及時(shí)開(kāi)展BVD防控和種群凈化工作。

4 結(jié)論

本調(diào)查結(jié)果顯示，武威市各縣區(qū)的肉牛群普遍存在BVDV 感染，已對(duì)養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展構(gòu)成潛在威脅，各級(jí)部門應(yīng)高度重視BVD防控和凈化工作，堅(jiān)持自繁自養(yǎng)，加強(qiáng)疫苗免疫，持續(xù)篩查并淘汰PI牛，逐步達(dá)到凈化的目的。