袁 紅，舒相華，姚 俊，張 瑩，羅班乾，李 鮮，王鳳劉，宋春蓮*

（ 1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650201 ；2. 云南省畜牧獸醫(yī)研究所，云南 昆明 650212 ； 3. 云南省永德縣畜牧獸醫(yī)局，云南 臨滄 677600 ； 4. 云南省賓川縣動物疫病預(yù)防控制中心，云南 大理 671600 ）

在豬養(yǎng)殖過程中，豬的相關(guān)腹瀉病毒和致病性細菌嚴(yán)重制約了豬群健康生長，主要表現(xiàn)為腹瀉、嘔吐、脫水、消瘦，各年齡段豬群均易發(fā)病，發(fā)病率和死亡率可高達100%，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失[1-2]。豬場常見的腹瀉病毒有豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬輪狀病毒（PoRV），引起腸道腹瀉的細菌有大腸桿菌、魏氏梭菌、豬痢疾桿菌、豬沙門氏菌等[3]。由于PEDV、TGEV、PoRV 和細菌引起的腹瀉，臨床特征往往相似，難以鑒別區(qū)分，且常有混合感染的情況發(fā)生[4-5]，提高了疾病發(fā)生的嚴(yán)重性與復(fù)雜性。因此，臨床中需要借助實驗室檢查手段進行檢測與鑒別診斷。

如今，國內(nèi)外很多學(xué)者已經(jīng)建立了腸道腹瀉病毒的多重RT-PCR 鑒別診斷方法。Salem 等[6]建立了TGEV 和PEDV 雙重RT-PCR 檢測方法。范皓天[7]建立了PEDV、TGEV、PoRV 三重RT-PCR 的檢測方法。丁慶文等[8]建立了PDCoV、PEDV、豬薩佩洛病毒（PSV）三重RT-PCR的檢測方法。王睿敏[9]和周亭宇[10]建立了PEDV、TGEV、PoRV、豬德爾塔冠狀病毒（PDCoV）四重RT-PCR 檢測方法。Liu等[11]建立了PEDV、TGEV、輪狀病毒（RVA）、豬圓環(huán)病毒-2（PCV2）和豬圓環(huán)病毒-3（PCV3）五重RT-PCR檢測方法。丁光明[12]建立PEDV、TGEV、豬輪狀病毒-A（PRV-A）、PDCoV、豬嵴病毒（PKV）和豬札幌病毒（PSaV）六重RT-PCR的檢測方法，但迄今尚無PCR可同時檢測并區(qū)分是病毒或細菌引起腹瀉的報道。本研究對PEDV、TGEV、PoRV 基因組保守區(qū)域設(shè)計特異性引物，結(jié)合細菌16s rRNA通用引物，通過各種優(yōu)化反應(yīng)條件成功建立了可同時檢測病毒和細菌的多重PCR檢測方法，并將建立的多重PCR檢測方法應(yīng)用于臨床檢測，以期為病毒與細菌的快速診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供新的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病毒株與細菌

PEDV、TGEV、PoRV 三聯(lián)活疫苗購自哈爾濱維科生物技術(shù)有限公司；大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株、豬瘟病毒（CSFV）、豬藍耳病毒（PRRSV）、PRV、豬細小病毒（PPV）、PCV-2核酸由云南省高校畜禽重要疾病防控重點實驗室保存。

1.1.2 病料

病料來自四川涼山彝族自治州某豬場，共2 份7 日齡哺乳仔豬小腸、9份母豬糞便。

1.1.3 主要試劑

病毒RNA 和DNA 試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑、E. coliDH 5a感受態(tài)細胞、pMD18-T載體、2×Taq PCR Mas-ter MIX 試劑盒，均購自寶生物工程（大連）有限公司；膠回收、質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.1.4 主要儀器

離心機（艾本德股份公司）；PCR 擴增儀、凝膠成像分析儀器（美國伯樂公司）；電泳儀（北京六一儀器廠公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成

引物設(shè)計的參照毒株均為來自GenBank 上的基因核酸序列，PEDV-N基因序列（登錄號：AF353511）、TGEV-S基因序列（登錄號：AJ271965.2）、PoRV-VP6（登錄號：FJ617209）、細菌16s rRNA通用引物。使用Oligo 7軟件分別設(shè)計應(yīng)用于擴增PEDV、TGEV、PoRV 和目的基因片段的特異性引物，并由上海生工生物工程有限公司進行合成，引物信息見表1。

表1 引物信息Tab.1 Primer information

1.2.2 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建

1.2.2.1 RNA和DNA的提取

按照Takara 試劑盒9766 進行病毒RNA 提取，大腸桿菌用Takara試劑盒9763進行細菌DNA提取，-80 ℃保存。

1.2.2.2 RNA反轉(zhuǎn)錄及PCR的擴增

參照Takara試劑盒RR047A，進行RNA反轉(zhuǎn)錄。

PCR 擴增體系（25 μL）：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL、特異性引物或細菌通用引物上下游各1 μL、反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或DNA各1 μL、滅菌雙蒸水9.5 μL補足反應(yīng)體系。

PEDV-N-901 PCR擴增程序：94 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃延伸。TGEV-S-571 PCR 擴增程序：94 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃延伸。

PoRV-VP6-257 PCR 擴增程序：94 ℃ 2 min；95 ℃30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃延伸。 16S rRNA-1500 PCR 擴增程序：94 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s，35 個循環(huán)；72 ℃10 min，4 ℃延伸。

1.2.2.3 目的基因的純化

將上述PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。在紫外燈下顯示出目的條帶并進行切割，裝至1.5 mL EP管中稱重。按照天根膠回收試劑盒進行DNA純化。

1.2.2.4 目的基因的克隆與轉(zhuǎn)化

在界定“整本書閱讀”這一概念時，不少學(xué)者用結(jié)構(gòu)主義二元對立的方法來闡釋，從與“篇章閱讀”相對立的角度，認為“整本書閱讀”首先在閱讀材料上不再是一篇節(jié)選文章的含英咀華，而是一本有著獨立精神、獨特思想價值，能夠作為一個連續(xù)性整體給讀者別樣閱讀感受的完滿集合，閱讀材料更長，也更具復(fù)雜性，完成這一復(fù)雜閱讀任務(wù)的時間更長，表現(xiàn)出來的閱讀行為也更具連續(xù)性。其次，不同于“列書單式”閱讀時代，僅僅是“讀”的粗淺要求，整本書閱讀是以“讀透”，讀出長進為硬性指標(biāo)的深層次閱讀。在整本書閱讀課上，教師是引導(dǎo)者、傾聽者，更多的時候是調(diào)控者、記錄者。整本書閱讀教學(xué)策略是在師生共同閱讀中生成的。

取純化后的DNA產(chǎn)物，連接至pMD18-T載體上。轉(zhuǎn)化DH5a 感受態(tài)細胞，挑選白色單個菌落進行菌液擴增。擴增后的菌液，取少量直接進行擴增，陽性菌液送至上海生工公司進行測序鑒定，其中部分菌液放置-80 ℃保存，以便后續(xù)使用。

1.2.2.5 重組質(zhì)粒的制備

將PCR、測序鑒定均為陽性的樣品，根據(jù)天根質(zhì)粒抽提試劑盒進行重組質(zhì)粒的制備。

1.2.3 多重PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

將已構(gòu)建的4 種重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為該試驗?zāi)０澹⒖傮w積為25 μL 的多重PCR，反應(yīng)擴增體系：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL、4對引物上下游各0.5 μL、4種質(zhì)粒各0.7 μL、無酶水5.7 μL。將PCR的退火溫度分別設(shè)置為45.0、46.0、48.0、50.0、51.0、53.5、55.0、57.0 ℃，上下游引物濃度分別為10.000 00、7.500 00、5.000 00、2.500 00、1.250 00、0.625 00、0.312 50、0.156 25 μmol/L，循環(huán)次數(shù)分別為20、25、30、35、40、45個循環(huán)，最后選擇最佳退火溫度、上下游引物濃度、循環(huán)次數(shù)。

1.2.4 多重PCR的特異性、敏感性、重復(fù)性試驗

本試驗分別以PEDV、TGEV、PoRV、CSFV、PRRSV的cDNA 和細菌、PCV-2、PRV、PPV 的DNA 為模板，無酶水為陰性對照，檢測試驗所構(gòu)建的多重PCR方法的特異性。

將4 種重組質(zhì)粒先單項進行敏感性試驗，選定各濃度相等進行，再將4 種質(zhì)粒等比例混合，均以10 的倍比系列稀釋為濃度1.72×109～1.72×10 copies/μL 的混合液，進行多重PCR的敏感性試驗，隨機選取多重PCR同一個濃度進行多次重復(fù)性試驗。

1.2.5 臨床樣品的檢測

對四川省涼山彝族自治州某豬場發(fā)生腹瀉的母豬和哺乳仔豬進行檢測，共采集11份樣品，其中哺乳仔豬小腸2份，母豬糞便9份。

2 結(jié)果與分析

2.1 四重PCR方法的建立

2.1.1 多重PCR退火溫度的優(yōu)化（見圖1）

圖1 多重PCR退火溫度的優(yōu)化Fig.1 Optimization of the multiplex PCR annealing temperature

由圖1 可知，各個反應(yīng)體系在不同退火溫度下均可擴增出較為清晰的條帶，但退火溫度過高或過低均會影響后期試驗。再根據(jù)每對引物的熔解溫度（Tm值），因此，本試驗中選取53.5 ℃為最適退火溫度。

2.1.2 多重PCR引物濃度的優(yōu)化（見圖2）

圖2 多重PCR引物濃度的優(yōu)化Fig.2 Optimization of multiplex PCR primer concentrations

由圖2 可知，經(jīng)過優(yōu)化，PEDV-N引物濃度為1.250 00 μmol/L、TGEV-S引物濃度為2.500 00 μmol/L、PoRV-VP6 和16s rRNA 引物濃度為5.000 00 μmol/L 時條帶最清晰明亮。

2.1.3 多重PCR循環(huán)次數(shù)的優(yōu)化（見圖3）

由圖3 可知，當(dāng)循環(huán)次數(shù)為35 次時，擴增條帶最清晰明亮，確定為該體系的最佳循環(huán)次數(shù)。

注 ： M為DL2000 DNA Marker；1～6分別為循環(huán)次數(shù)20、25、30、35、40、45。

2.1.4 多重PCR反應(yīng)條件的確定

該體系經(jīng)優(yōu)化反應(yīng)條件，確定多重PCR 的反應(yīng)體系（共25 μL）：2×Taq Master Mix 12.5 μL；PEDV-N上下游引物（10 μmol/L）1.250 00 μmol/L、TGEV-S上下游引物（10 μmol/L）2.500 00 μmol/L、16s rRNA 和PoRV-VP6 上下游引物（10 mol/L）5.000 00 μmol/L；模板2.8 μL、滅菌雙蒸水5.7 μL。

多重PCR 擴增程序：94 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性30 s，53.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。

2.1.5 多重PCR特異性試驗（見圖4）

圖4 多重PCR特異性試驗Fig.4 Multiplex PCR-specific test

由圖4 可知，只有PEDV、TGEV、PoRV 和細菌擴增出相應(yīng)的目的片段，而PRRSV、CSFV、PRV 和PCV2 均未出現(xiàn)擴增條帶，表明多重PCR無交叉反應(yīng)。

2.1.6 多重PCR敏感性試驗（見圖5）

圖5 多重PCR敏感性試驗Fig.5 Multiplex PCR sensitivity test

由圖5可知，PEDV、TGEV、PoRV、細菌的檢出下限均為1.72×103copies/μL。

2.1.7 多重PCR重復(fù)性試驗（見圖6）

圖6 多重PCR重復(fù)性試驗Fig.6 Multiplex PCR reproducibility test

由圖6可知，選取濃度為1.72×105copies/μL進行6次重復(fù)性試驗，結(jié)果均可擴增出一致的目的條帶，表明建立的方法具有良好的重復(fù)性。

2.2 多重PCR方法的臨床初步應(yīng)用結(jié)果（見圖7）

圖7 臨床樣品檢測結(jié)果Fig.7 Test results of clinical samples

由圖7可知，11份腹瀉樣品均呈PEDV陽性，并且部分母豬有細菌混合感染。將其純化后進行測序，測序結(jié)果在NCBI進行比對，證實了仔豬和母豬均被PEDV所感染，其中4頭母豬有細菌混合感染，細菌為惡臭假單胞菌。

3 討論

目前，由PEDV、TGEV、PoRV和細菌性引起的腹瀉臨床中多以嘔吐、腹瀉、厭食和脫水為主要癥狀，通過臨床癥狀和病理解剖難以區(qū)分鑒別[13-15]，必須借助實驗室檢測進行診斷。本文針對PEDV、TGEV、PoRV設(shè)計3對特異性引物，結(jié)合細菌16S rRNA 通用引物設(shè)計豬腹瀉性病毒和細菌的多重PCR方法，以三聯(lián)苗和大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株為陽性對照進行重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建；以標(biāo)準(zhǔn)品為模板，進行多重PCR條件的優(yōu)化，陽性對照擴增可得到257、571、901和1 500 bp 的特異性條帶，表明成功建立起多重PCR。靈敏度試驗結(jié)果表明，該方法靈敏度可達1.72×103copies/μL；在重復(fù)6次后，重復(fù)性好，并成功應(yīng)用于臨床檢測。結(jié)果表明，試驗所建立的方法靈敏度高、重復(fù)性好、特異性高。對四川省涼山州紅巖子某規(guī)模化豬場11份哺乳仔豬和母豬腹瀉樣品進行檢測，得到和陽性對照相同大小的目的片段，將其純化后測序，所得序列在NCBI 上進行比對，比對結(jié)果為哺乳仔豬和母豬被PEDV和惡臭假單胞菌感染，為病毒和細菌混合感染。

臨床中由細菌和病毒引起的腹瀉很常見。劉磊等[16]對某規(guī)?；i場內(nèi)出現(xiàn)腹瀉情況的仔豬進行檢測，結(jié)果顯示，PEDV 和豬鏈球菌混合感染是引起該場豬發(fā)病的主要原因。黃美州[17]對甘豫地區(qū)仔豬泄瀉病致病細菌和病毒進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，致病性大腸埃希氏菌和PEDV 是主要導(dǎo)致豬腹瀉的主要病原。上述研究結(jié)果表明，豬腹瀉往往由病毒和細菌混合感染所致。但細菌和病毒引起的腹瀉目前無法通過同一診斷技術(shù)PCR進行鑒別，本試驗為區(qū)別豬腹瀉是由病毒或細菌感染提供了一種新的臨床鑒別診斷方法，在一定程度上提高了診斷的效率，節(jié)約了時間與經(jīng)濟成本，進而為臨床鑒別診斷豬腹瀉的病因是細菌或病毒感染提供一定的診斷價值。

4 結(jié)論

本試驗所建立的豬腹瀉性細菌和病毒多重PCR 方法能夠在第一時間鑒別診斷出豬腹瀉的病因是細菌或病毒感染，為臨床診療節(jié)約了時間與成本。