段嘉寶，農(nóng)靜嫻，李孟純，楊天樂(lè)，李 鈾，2，3*

（ 1. 西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730100 ；2. 西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心 甘肅省動(dòng)物細(xì)胞技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730030 ；3. 西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心 生物工程與技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730030 ）

塔里木盆地深居亞歐大陸內(nèi)部，位于青藏高原北部、帕米爾高原東部和天山南部，是中國(guó)面積最大的內(nèi)陸盆地。塔里木盆地東西長(zhǎng)1 500 km，南北寬約600 km，面積約530 000 km2，四周海拔高度在800～1 300 m 之間。盆地降水量少且蒸發(fā)量高，屬于典型的大陸性干旱氣候[1-2]。盆地因其獨(dú)特的地質(zhì)地貌及環(huán)境屬性，孕育了豐富獨(dú)特的生物多樣性資源。南疆沙蜥（Phrynocephalus forsythii）隸屬于鬣蜥科（Agamidae）中的沙蜥屬（Phrynocephalus），是塔里木盆地特有爬行物種之一，是棲息于稀疏灌叢或戈壁灘的卵胎生蜥蜴。與同域分布的葉城沙蜥相比，南疆沙蜥更喜歡較為濕潤(rùn)的棲息地[3]。

微衛(wèi)星標(biāo)記（simple sequence repeat，SSR）是基于DNA長(zhǎng)度多態(tài)性的分子標(biāo)記技術(shù)，可直接反映核酸水平的遺傳變異，廣泛應(yīng)用于野生動(dòng)物遺傳多樣性研究[4-6]。張沼等[7]利用8對(duì)微衛(wèi)星分子標(biāo)記對(duì)賽罕烏拉國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)的馬鹿糞便樣品進(jìn)行遺傳多樣性分析，表明該地區(qū)馬鹿種群的遺傳多樣性處于中上水平。張于光等[8]基于SSR對(duì)三江源和祁連山國(guó)家公園雪豹進(jìn)行種群遺傳多樣性研究發(fā)現(xiàn)，野外生存雪豹種群遺傳多樣性相對(duì)較低，但祁連山國(guó)家公園雪豹種群遺傳多樣性相對(duì)較高，該研究成果對(duì)野生動(dòng)物科學(xué)化保護(hù)提供了參考。目前學(xué)者多關(guān)注南疆沙蜥的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系及進(jìn)化歷史的研究，群體遺傳結(jié)構(gòu)的研究也在不斷完善[3,9]。本研究利用選取的4個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，對(duì)塔里木盆地5個(gè)區(qū)域的南疆沙蜥的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行探究，以期為塔里木地區(qū)南疆沙蜥的遺傳資源保護(hù)以及荒漠化地區(qū)其他物種的保護(hù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)研究對(duì)象為塔里木盆地5個(gè)地區(qū)（民豐、策勒、于田、和田、皮山）采集共計(jì)74個(gè)南疆沙蜥樣本，取肌肉與肝臟組織保存于無(wú)水乙醇與生理鹽水（體積比1∶1）組織保存液中，-20 ℃保存，用于后續(xù)分子試驗(yàn)。塔里木盆地5個(gè)區(qū)域的南疆沙蜥樣本采樣點(diǎn)見(jiàn)表1。

表1 塔里木盆地5個(gè)區(qū)域的南疆沙蜥樣本采樣點(diǎn)Tab.1 Sampling point of P. forsythii samples in five regions of Tarim Basin

1.2 基因組DNA的提取

使用SteadyPure 通用型基因組DNA 提取試劑盒提取樣本的基因組DNA，并用1.4%瓊脂糖凝膠電泳及分光光度計(jì)檢測(cè)DNA完整性及純度，保存-20 ℃。

1.3 引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增

參照已發(fā)表的沙蜥文獻(xiàn)中選取其中4個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)[10-11]，引物信息見(jiàn)表2。

表2 南疆沙蜥多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)信息Tab.2 Information of polymorphic microsatellite loci for P. forsythii

PCR 反應(yīng)體系（12 μL）：5×buffer （Mg2+free）2.4 μL、TakapaHs 酶0.06 μL、tag F 0.09 μL、tag R 0.09 μL、Primers特異性引物2.4 μL、無(wú)菌水4.96 μL、DNA樣本含量2 μL。

PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；92 ℃變性60 s，50 ℃退火90 s，72 ℃延伸60 s，5 個(gè)循環(huán)；92 ℃變性30 s，63 ℃退火90 s，72 ℃延伸60 s，20 個(gè)循環(huán)；92 ℃變性15 s，54 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，40 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，25 ℃ 10 min。

擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并在凝膠成像儀上觀察結(jié)果。成功擴(kuò)增的合格PCR 產(chǎn)物送至蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序分析，得到原始數(shù)據(jù)FASTA文件。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用Genemarker[12]對(duì)測(cè)序儀得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行基因分型，分型后的數(shù)據(jù)使用MicroChecker 2.2.3[13]檢測(cè)是否存在無(wú)效等位基因。使用GenAlex V 6.5[14]分析等位基因數(shù)（number of allele，Na）、有效等位基因數(shù)（effective number of allele，Ne）、觀測(cè)雜合度（observed heterozygosity，Ho）、期望雜合度（expected heterozygosity，He）、近交系數(shù)（Fis）、Shannon 指數(shù)（I）、群體間Nei's 遺傳距離和遺傳相似度、群體間的遺傳分化指數(shù)（Fst）、基因流（Nm）和分子方差分析（AMOVA）。使用Cervus3.0[15]計(jì)算各位點(diǎn)的多態(tài)信息含量（PIC）。使用MEGA X[16]繪制基于群體間的Nei's 遺傳距離的UPGMA（unweighted pair-group method with arithmetic mean，UPGMA）聚類樹(shù)。主成分判別分析（discriminant analysis of principal components，DAPC）使用R中的“adegenet”包[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳多樣性（見(jiàn)表3、表4）

表3 4個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳多樣性Tab.3 Genetic parameters of four microsatellite loci

表4 5個(gè)南疆沙蜥種群在4個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳多樣性參數(shù)Tab.4 Genetic diversity parameters at four microsatellite loci in five populations of P. forsythii

MicroChecker 檢驗(yàn)微衛(wèi)星基因分型數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示，4個(gè)位點(diǎn)在5個(gè)群體均未檢出大量等位基因缺失或無(wú)效等位基因，因此選取的4個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的基因分型數(shù)據(jù)可用于后續(xù)分析。4個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)在5個(gè)群體內(nèi)共檢測(cè)到98個(gè)等位基因。

由表3可知，各位點(diǎn)的平均Ho介于0.025～0.737之間，平均值為0.464。He 最低為0.250（Phr30），最高為0.886（Pvms20）。PIC介于0.375～0.950之間，平均值為0.788，其中PIC≥0.50 的高度多態(tài)性位點(diǎn)有3 個(gè)，分別為Phr79、Pvms20、Pvms38；0.25≤PIC≤0.50 的中度多態(tài)性位點(diǎn)有1 個(gè)，為Phr30。Fis和群體間的Fst分別介于0.327～0.900 和0.068～0.426。Nm 最低為0.337（Phr30），最高為3.418（Pvms20）。

由表4 可知，在5 個(gè)南疆沙蜥群體中，Na 和Ne 最多的為PS 群體，分別為11.500 和7.882，較少的為YT 和HT 群體，說(shuō)明南疆沙蜥的5個(gè)群體的等位基因數(shù)存在一定差異。Na、Ho、He、PIC 等參數(shù)反映群體遺傳多樣性水平。根據(jù)5個(gè)群體的基礎(chǔ)遺傳參數(shù)表明，MF群體表現(xiàn)出比其他群體較高的雜合性且具有豐富的遺傳多樣性。

2.2 群體遺傳分化水平（見(jiàn)表5、表6）

表5 南疆沙蜥種群遺傳變異的分子方差分析Tab.5 Analysis of molecular variance of population genetic variation of P. forsythii

表6 各群體間的遺傳分化指數(shù)Tab.6 Coefficient of population differentiation among populations

由表5 可知，5 個(gè)南疆沙蜥群體的遺傳變異主要來(lái)自群體內(nèi)（92%），群體間的遺傳變異僅有8%，表明南疆沙蜥群體之間遺傳分化程度較小。

由表6可知，各群體間的Fst介于0.043（HT-PS）～0.191（MF-YT）之間，表明群體間存在中等程度的遺傳分化（Fst＜0.15）。此外，HT 群體與PS 群體的群體分化程度最小，為0.043，表明兩群體間較其他群體最有可能存在基因交流現(xiàn)象。

2.3 群體遺傳結(jié)構(gòu)（見(jiàn)圖1、圖2）

圖1 基于Nei's遺傳距離構(gòu)建的5個(gè)南疆沙蜥群體UPGMA聚類樹(shù)Fig.1 UPGMA clustering tree of five populations of P. forsythii based on Nei's genetic distance

圖2 南疆沙蜥的DAPC聚類圖Fig.2 DAPC cluster diagram of P. forsythii

由圖1 可知，5 個(gè)南疆沙蜥群體分為3 個(gè)聚類。其中CL和YT群體聚為一類，HT和PS群體聚為一類，MF群體單獨(dú)聚為一類。

由圖2 可知，MF 群體明顯區(qū)別于其他群體，CL 與YT群體混雜在一起，HT 與PS 群體混雜一起。DAPC 聚類結(jié)果與UPGMA聚類樹(shù)結(jié)果基本一致。

3 討論

3.1 南疆沙蜥的群體遺傳多樣性

遺傳多樣性對(duì)物種的生存和適應(yīng)性具有重要影響，是物種進(jìn)化演變的遺傳基礎(chǔ)。種群的遺傳多樣性水平越高，表明該群體適應(yīng)環(huán)境變化的能力越強(qiáng)；反之，遺傳多樣性低下或下降很可能會(huì)導(dǎo)致物種的環(huán)境適應(yīng)力和抵擋疾病的能力降低、雌雄性別比例失衡，甚至物種滅絕[18-19]。南疆沙蜥作為荒漠化地區(qū)的優(yōu)勢(shì)物種，研究其遺傳多樣性對(duì)評(píng)估群體豐富度及其遺傳資源科學(xué)化保護(hù)尤為重要。本研究中，5 個(gè)南疆沙蜥群體在4 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上均檢測(cè)到Na 高于Ne，說(shuō)明等位基因存在差異，分布不均勻，可能受到群體間潛在的近交現(xiàn)象影響。雜合性作為評(píng)估遺傳多樣性的重要遺傳參數(shù)，能夠較好地反映群體遺傳變異程度。本研究中，5個(gè)南疆沙蜥群體的Ho均低于He，表明遺傳多樣性水平較低，可能導(dǎo)致南疆沙蜥群體規(guī)模下降等潛在風(fēng)險(xiǎn)，但由于采集的樣本量不夠，有待進(jìn)一步研究。

3.2 南疆沙蜥的遺傳分化

Fst的取值范圍0～1，最大值為1 表明兩個(gè)群體完全分化，最小值為0 表明群體間無(wú)分化。0＜Fst＜0.05 時(shí)，說(shuō)明群體間遺傳分化很小，可忽略不計(jì)；0.05＜Fst＜0.15 時(shí)，表明群體間存在中等程度的遺傳分化；0.15＜Fst＜0.15 及Fst＞0.25時(shí)，表明群體間普遍存在較大及以上的遺傳分化[20-21]。本研究中，除CL-YT、CL-PS 及HT-PS 外，其余兩群體間均存在中等及以上的遺傳分化程度?？傮w來(lái)說(shuō)，5 個(gè)南疆沙蜥的群體分化仍處于中等的遺傳分化水平，其群體間的差異較大。

3.3 南疆沙蜥群體遺傳結(jié)構(gòu)

除了基于Nei's遺傳距離構(gòu)建的UPGMA聚類樹(shù)外，基于DAPC 也是分析聚類關(guān)系的常用方法之一[22]。本研究中，UPGMA 聚類樹(shù)與DAPC 聚類圖中的聚類關(guān)系基本一致，均顯示MF群體明顯單獨(dú)聚為一類。MF群體與其他群體無(wú)混雜，可能與存在人為干擾等影響導(dǎo)致的基因交流屏障有關(guān)。在全球氣候變暖的背景下，對(duì)于變溫動(dòng)物尤其是爬行動(dòng)物的影響尤為顯著。因此，探究環(huán)境溫度對(duì)南疆沙蜥遺傳結(jié)構(gòu)及適應(yīng)性遺傳變異的影響，對(duì)棲息在塔里木盆地及少部分高原地區(qū)的南疆沙蜥而言，是否存在更大生存風(fēng)險(xiǎn)挑戰(zhàn)有待后續(xù)進(jìn)一步研究加以驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本研究利用4個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)探究塔里木盆地5個(gè)區(qū)域的南疆沙蜥群體的遺傳多樣性及種群結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)5個(gè)南疆沙蜥群體在4 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的Ho、He 為0.464、0.692。多態(tài)信息含量均值為0.788，F(xiàn)is及Fst均值分別為0.433、0.180?；贒APC聚類分析結(jié)果顯示，MF群體單獨(dú)聚類為一支，與UPGMA 聚類樹(shù)結(jié)果一致。結(jié)果表明，5 個(gè)南疆沙蜥群體的遺傳多樣性水平低下，群體間存在較大的遺傳分化。

南疆沙蜥作為塔里木盆地內(nèi)的爬行優(yōu)勢(shì)物種，群體遺傳多樣性仍處于較低水平，群體分化水平受到人為因素和地質(zhì)事件等多重影響，因而亟須加強(qiáng)對(duì)南疆沙蜥群體的保護(hù)。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)塔里木盆地部分區(qū)域南疆沙蜥遺傳多樣性及種群結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，為南疆沙蜥的科學(xué)化保護(hù)提供參考意見(jiàn)，也為塔克拉瑪干沙漠等荒漠化地區(qū)物種保護(hù)提供一定參考。