張 文，胡庭俊，于美玲

（ 廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530005 ）

中草藥辣蓼為蓼科蓼屬植物，廣泛分布于我國南北各省區(qū)，資源豐富，開發(fā)利用潛力大[1]。辣蓼的主要生物活性成分為黃酮類化合物，如金絲桃苷、槲皮苷、槲皮素等[2]，具有抗菌消炎、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化等多種功效，且安全性能高[3-5]。

不同植物所含黃酮類化合物的種類及含量差異較大，因此從不同植物中提取黃酮類化合物的研究備受關(guān)注。實驗室常用于優(yōu)化提取工藝的方法很多，包括單因素試驗、正交試驗[6]、Box-Behnken 響應(yīng)面試驗等[7]。與其他方法相比，響應(yīng)面法更準確高效，考慮到了試驗的隨機誤差，在尋求最優(yōu)結(jié)果時對各個因素進行連續(xù)性分析，因而廣泛應(yīng)用于中藥成分提取方面[8]?；诖?，本試驗采用單因素法和Box-Behnken 響應(yīng)面法，優(yōu)化提取過程中的液料比、乙醇含量、超聲時間，以期為辣蓼黃酮生產(chǎn)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗藥物辣蓼購自廣西壯族自治區(qū)玉林市中藥市場。蘆丁標準品（純度≥98%）購自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.2 主要儀器

SB-5200DTDN 超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）、UV-1750紫外分光光度計（島津公司）、CDUPT-1純水儀（成都純越科技有限公司）、EL204分析天平（METTLER TOLEDO）、HEI VAP ADVANTAGE 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（海道夫公司）、Himac CF16RN多用途冷凍離心機（日立公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 總黃酮含量測定

標準曲線建立：稱取蘆丁標準品10.0 mg，用60%乙醇定容至50.0 mL，制成0.2 g/L蘆丁標準溶液。

標準曲線繪制：將0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL蘆丁標準溶液加入10 mL容量瓶中，按照亞硝酸鈉—硝酸鋁—氫氧化鈉法測定510 nm處的吸光度。以蘆丁作為參照物計算辣蓼的總黃酮含量。

總黃酮含量=(C×V×n)/m×100%（1）

式中：C表示提取液中黃酮含量（g/mL）；V表示提取液體積（mL）；n表示提取液稀釋倍數(shù)；m表示辣蓼黃酮提取物的質(zhì)量（g）。

1.2.2 改良醇提法提取辣蓼總黃酮

準確稱取10.0 g辣蓼粉末，按照一定的料液比、乙醇含量、超聲時間和超聲溫度進行提取。將辣蓼粉末浸泡0.5 h，45 ℃超聲40 min，80 ℃水浴鍋加熱1.5 h，過濾。將濾渣加入乙醇溶液后再次水浴，重復(fù)3 次后合并濾液，以20～25 μm 定性濾紙抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至50 mL，冷凍干燥48 h后即得辣蓼黃酮提取物。根據(jù)《中華人民共和國藥典法》委員會規(guī)定的紫外分光光度法，在510 nm波長處測定吸光度。

1.2.2.1 單因素試驗

根據(jù)1.2.2 提取方法的參數(shù)進行液料比的選擇。固定乙醇濃度60%、超聲溫度40 ℃、超聲時間40 min，探究不同液料比（5、10、15、20、25 mL/g）對總黃酮含量的影響。

根據(jù)1.2.2 提取方法的參數(shù)進行乙醇濃度的選擇。固定液料比20 mL/g、超聲溫度40 ℃、超聲時間40 min，探究不同的乙醇濃度（40%、50%、60%、70%、80%）對總黃酮含量的影響。

根據(jù)1.2.2 提取方法的參數(shù)進行超聲時間的選擇。固定液料比20 mL/g、乙醇濃度60%、超聲溫度40 ℃，探究不同的超聲時間（30、40、50、60、70 min）對總黃酮含量的影響。

根據(jù)1.2.2 提取方法的參數(shù)進行超聲溫度的選擇。固定液料比20 mL/g、乙醇濃度60%、超聲時間40 min，探究不同的超聲溫度（20、30、40、50、60 ℃）對總黃酮含量的影響。

1.2.2.2 響應(yīng)面試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以液料比（A）、乙醇含量（B）、超聲時間（C）為試驗因素，總黃酮含量為指標，進行響應(yīng)面試驗。試驗設(shè)計見表1。

表1 Box-Behnken試驗因素與水平設(shè)計Tab.1 Factors and levels of Box-Behnken experimental design

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標準曲線（見圖1）

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 Standard curve of rutin

由圖1 可知，回歸方程為y=4.057 1x+0.001 6，R2=0.990 2，線性關(guān)系良好。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 液料比對總黃酮含量的影響（見圖2）

圖2 液料比對總黃酮含量的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on total flavonoid content

由圖2可知，在乙醇含量、超聲時間和超聲溫度一定的條件下，當(dāng)液料比由5 mL/g 提高至20 mL/g 時，總黃酮含量隨之增加。分析原因是當(dāng)液料比小于20 mL/g 時，料液比越高，傳質(zhì)過程越快，越利于黃酮的提?。划?dāng)液料比大于20 mL/g時，總黃酮含量相對穩(wěn)定，可能是黃酮已被最大限度提取。由此可知，液料比為20 mL/g 時可在獲得較高黃酮含量的同時減少溶劑的消耗。因此，選擇15、20、25 mL/g作為響應(yīng)面試驗的因素水平。

2.2.2 乙醇含量對總黃酮含量的影響（見圖3）

圖3 乙醇含量對總黃酮含量的影響Fig.3 Effect of ethanol content on total flavonoid content

由圖3可知，在其他3個因素一定的條件下，當(dāng)乙醇含量由10%提高至60%時，總黃酮含量隨之增加；乙醇含量高于60%時，總黃酮含量呈下降趨勢。因此，選擇50%、60%、70%作為響應(yīng)面試驗的因素水平。

2.2.3 超聲時間對總黃酮含量的影響（見圖4）

圖4 超聲時間對總黃酮含量的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on total flavonoid content

由圖4可知，在液料比、乙醇含量和超聲溫度一定的條件下，超聲時間為30～40 min 時，總黃酮含量上升，40 min達到峰值，之后急劇下降，在50～70 min 趨于平緩。因此，選擇30、40和50 min作為響應(yīng)面試驗的因素水平。

2.2.4 超聲溫度對總黃酮含量的影響（見圖5）

圖5 超聲溫度對總黃酮含量的影響Fig.5 Effect of ultrasonic temperature on total flavonoid content

由圖5可知，在液料比、乙醇含量和超聲時間一定的條件下，超聲溫度在20～60 ℃時，總黃酮含量趨于平緩，其中超聲溫度在40 ℃時總黃酮含量最高。因此，將超聲溫度設(shè)定為40 ℃，考察其他變量。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

采用Box-Behnken設(shè)計試驗，以液料比（A）、乙醇濃度（B）和超聲時間（C）為自變量，總黃酮含量為因變量，響應(yīng)面試驗結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗結(jié)果Tab.2 Box-Behnken experimental results

2.3.1 多元二次回歸方程

總黃酮含量（Y）與試驗因素的回歸方程：Y=19.03+1.39A+0.758 8B+1.45C-0.407 5AB-1.3AC-0.74BC-2.61A2-1.91B2-1.3C2

該回歸方程模型中，F(xiàn)值=233.33，P＜0.01，表明模型的整個回歸區(qū)域擬合很好；P＞0.05，表明相對于純誤差差異無統(tǒng)計學(xué)意義，R2=0.996 7，表明試驗相關(guān)性較好，能夠使用此模型對總黃酮含量進行分析和預(yù)測，結(jié)果見表3。

表3 回歸模型的方差分析Tab.3 Analysis of variance for regression mode

由表3 可知，各因素對總黃酮含量大小的影響依次是A＞B＞C，液料比和乙醇含量對總黃酮含量的影響達到極顯著水平，超聲時間不顯著；A2、B2和C2影響極顯著。

2.3.2 各因素交互作用對總黃酮含量的影響（見圖6）

圖6 各因素交互作用對總黃酮含量的影響Fig.6 Effect of interaction of various factors on total flavonoid content

響應(yīng)面坡度越陡峭，表示相應(yīng)的響應(yīng)值對相關(guān)條件越為敏感，該因素對總黃酮含量影響越大。

由圖6 可知，A和C之間交互作用對總黃酮含量影響最明顯，與方差分析中回歸模型系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果一致。三者之間的等高線呈橢圓形，表明各因素兩兩之間交互作用顯著。

2.3.3 最佳提取條件及驗證試驗

利用Design-Expert軟件對提取工藝參數(shù)進行優(yōu)化，得到最佳工藝參數(shù)為：液料比21.430 mL/g、乙醇含量61.955%、超聲時間38.592 min，預(yù)測總黃酮含量為19.292%。為方便試驗操作，將優(yōu)化后的工藝條件四舍五入為液料比21 mL/g、乙醇含量62%、超聲時間39 min，試驗重復(fù)3次，結(jié)果見表4。

由表4 可知，在上述條件下得到總黃酮的平均含量為19.108%，與預(yù)測值接近，表明優(yōu)化的工藝參數(shù)準確可靠，具有實用價值。

3 討論

辣蓼廣泛分布于我國廣西、湖南、貴州等地區(qū)，具有良好的抗氧化效果。辣蓼富含的黃酮類化合物是一類具有2-苯基色原酮結(jié)構(gòu)的植物次級代謝產(chǎn)物，在植物界中廣泛存在[9]。黃酮類化合物不僅影響植物的生長發(fā)育，而且還具有抗病毒和抗氧化等多種活性[10]。

吳永玲等[11]研究表明，響應(yīng)面法優(yōu)化提取的蛇床子總黃酮不僅對蘋果黃蚜和朱砂葉螨的48 h 校正死亡率均大于50%，且對蘋果腐爛病菌和油菜菌核病菌也具有較強的抑菌活性。李克香等[12]試驗表明，超聲波酶法輔助提取的紫萁黃酮能夠有效清除自由基，且清除率呈劑量依賴性。蘇慧慧等[7]研究發(fā)現(xiàn)，采用單因素結(jié)合Box-Behnken 響應(yīng)面法提取的三葉木通總黃酮對DPPH自由基的清除率與維生素C接近，抗氧化活性作用較高。王振偉等[13]提取的線葉金雀花總黃酮作用于大腸桿菌后，大腸桿菌的生長對數(shù)期消失，細胞形態(tài)出現(xiàn)明顯損傷，抑菌效果顯著。龍林等[14]優(yōu)化提取的青稞秸稈總黃酮對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性具有一定的抑制作用。

目前，提取黃酮的方法有酶解法、醇提法、水提法、超聲提取法、微波提取法等[15]，但單一提取方法效率較低。因此，本試驗結(jié)合醇提法和超聲法，在醇提的基礎(chǔ)上將超聲波提取作為提取手段，具有高效率、操作簡單、對設(shè)備要求低等優(yōu)點。在單因素試驗基礎(chǔ)上，結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，利用統(tǒng)計學(xué)試驗方法找出各因素水平的最佳條件[16]，得到多元二次回歸模型，計算出最優(yōu)條件，優(yōu)化工藝可靠，具有重復(fù)性。結(jié)果表明，試驗建立的方法不僅能夠提高總黃酮的含量，還可減少試驗成本，操作簡便，為辣蓼黃酮的研究及開發(fā)提供一定參考。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，優(yōu)化后最佳工藝為料液比21 mL/g、乙醇含量62%、超聲時間39 min，超聲溫度40 ℃，此條件下制備的總黃酮平均含量為19.108%，提取工藝穩(wěn)定，重現(xiàn)性良好。本試驗為辣蓼黃酮的提取提供了新思路，可為進一步研究發(fā)掘辣蓼黃酮的藥理作用及深入開發(fā)利用辣蓼黃酮提供理論依據(jù)和實踐參考，也可為其他植物中黃酮的提取提供有益參考。