溫曉萍

【摘要】? 目的? ? 探討熒光PCR探針熔解曲線法檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌群（MTBC）對利福平、異煙肼耐藥性的價(jià)值。方法? ? 回顧性分析2018年6月—2021年4月惠州市職業(yè)病防治院收治的528例肺結(jié)核與耐多藥結(jié)核病患者的臨床資料。所有患者均進(jìn)行痰液標(biāo)本采集，采集后進(jìn)行送檢，之后進(jìn)行分離培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)，采用熒光PCR探針熔解曲線法對MTBC對利福平、異煙肼的耐藥性進(jìn)行測定分析，最終獲得211份陽性菌株，再經(jīng)鑒定為MTBC 208份，3份為非結(jié)核分枝桿菌。對熒光PCR探針熔解曲線法檢測MTBC耐藥性的效能進(jìn)行分析。結(jié)果? ? 經(jīng)比例法進(jìn)行的藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，208份MTBC菌種標(biāo)本中，120份對利福平具有耐藥性，146例對異煙肼具有耐藥性；經(jīng)熒光PCR探針熔解曲線法檢查后，135份對利福平耐藥，敏感73份，其中僅有114份確定對利福平具有耐藥性；經(jīng)熒光PCR探針熔解曲線法檢查后，134份對異煙肼耐藥，敏感74份，其中有131份確定對異煙肼具有耐藥性。熒光PCR探針熔解曲線法檢測MTBC對利福平、異煙肼耐藥性的特異度分別為76.14%，95.16%，對異煙肼耐藥性的檢測特異度高于利福平，差異具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；對異煙肼耐藥性的檢測靈敏度低于利福平，準(zhǔn)確度高于利福平，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論? ? 熒光PCR探針熔解曲線法檢測MTBC耐藥性的效能較高，可應(yīng)用于快速發(fā)現(xiàn)耐藥基因位點(diǎn)突變，篩查耐多藥肺結(jié)核，并在治療中進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測，進(jìn)而可指導(dǎo)臨床調(diào)整治療方案。

【關(guān)鍵詞】? 結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌群； 熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)； 探針熔解曲線法； 利福平； 異煙肼； 耐藥性

中圖分類號：R446? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1672-1721（2023）16-0101-03

DOI：10.19435/j.1672-1721.2023.16.034

臨床中結(jié)核病屬于一種多發(fā)疾病，其主要是因?yàn)楦腥窘Y(jié)核分枝桿菌導(dǎo)致，為嚴(yán)重威脅人類健康的傳染性疾病。結(jié)核病的主要傳播途徑為飛沫傳染，在人口密集大、人口流動大的公共場所中極易傳播，所以積防治結(jié)核病具有十分重要的意義。臨床呼吸內(nèi)科中，重癥結(jié)核病屬于一種常見疾病，具有較高的發(fā)生率和病死率，需及時(shí)采取有效的治療措施，從而降低患者的病死率。結(jié)核病主要經(jīng)呼吸道飛沫傳播所致，主要癥狀包括咳嗽、咳痰、咯血、胸痛、呼吸困難、長期午后潮熱等，部分患者會有倦怠乏力、盜汗、食欲減退和體重減輕等癥狀[1]。結(jié)核分枝桿菌包括麻風(fēng)分枝桿菌、非結(jié)核分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌群（MTBC），其中MTBC又包含人型結(jié)核分枝桿菌、鼠型分枝桿菌、牛型分枝桿菌等，MTBC可侵犯整個身體的各個器官，以肺部最為多見[2]。由于目前我國的結(jié)核病感染者數(shù)量較多，且發(fā)病率、病死率及耐藥率均處于較高水平。因此，探究MTBC對各類結(jié)核病的常用藥，如利福平、異煙肼的耐藥性，對于結(jié)核病的防治具有深遠(yuǎn)意義[3]。熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）探針熔解曲線法可快速檢測出MTBC的藥敏結(jié)果，具有較高的操作靈活性[4]。本研究旨在探討熒光PCR探針熔解曲線法檢測MTBC對利福平、異煙肼耐藥性的價(jià)值，報(bào)道如下。

1? ? 資料與方法

1.1? ? 一般資料? ? 回顧性分析2018年6月—2021年4月惠州市職業(yè)病防治院收治的528例肺結(jié)核與耐多藥結(jié)核病患者的臨床資料，男289例，女239例，年齡31～67歲，平均年齡（44.67±5.91）歲。診斷標(biāo)準(zhǔn)：以《臨床診療指南·結(jié)核病分冊》[5]中的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)作為參照。納入標(biāo)準(zhǔn)：滿足上述診斷標(biāo)準(zhǔn)者；非精神疾病，可進(jìn)行正常溝通；無嚴(yán)重心、肝等功能異常等。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并腦腫瘤者；依從性差者；存在免疫功能障礙者；存在造血系統(tǒng)功能異常者；對研究所用藥物過敏者等。

1.2? ? 方法? ? 所有患者均進(jìn)行痰液標(biāo)本采集，采集后進(jìn)行送檢，嚴(yán)格按照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》[6]進(jìn)行分離培養(yǎng)。使用至善全自動細(xì)菌鑒定及藥敏分析儀進(jìn)行菌種鑒定及藥敏試驗(yàn)。使用比例法檢測MTBC對利福平、異煙肼的耐藥性，并按照2004年美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會藥敏試驗(yàn)判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)；參照抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)推薦的篩選試驗(yàn)和確證試驗(yàn)進(jìn)行超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）檢測，所用質(zhì)控菌株均采購自原衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。之后采用熒光PCR探針溶解曲線法MTBC對利福平、異煙肼的耐藥性進(jìn)行測定分析，最終獲得211份陽性菌株，再經(jīng)鑒定為MTBC 208份，3份為非結(jié)核分枝桿菌。

1.3? ? 觀察指標(biāo)? ? （1）熒光PCR探針熔解曲線法檢測MTBC對利福平、異煙肼的耐藥性結(jié)果。（2）熒光PCR探針熔解曲線法與金標(biāo)準(zhǔn)的檢出結(jié)果比較，其中金標(biāo)準(zhǔn)為比例法藥敏試驗(yàn)。（3）熒光PCR探針熔解曲線法檢測MTBC耐藥性的效能，包括特異度=真敏感例數(shù)/（假耐藥+真敏感）例數(shù)×100%，靈敏度=真耐藥例數(shù)/（真耐藥+假敏感）例數(shù)×100%，準(zhǔn)確度=（真耐藥+真敏感）例數(shù)/總例數(shù)×100%。

1.4? ? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法? ? 使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以百分比表示，采用χ²檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? ? 結(jié)果

2.1? ? 熒光PCR探針熔解曲線法檢測MTBC對利福平、異煙肼的耐藥性結(jié)果? ? 經(jīng)比例法進(jìn)行的藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，208份MTBC菌種標(biāo)本中，120份對利福平具有耐藥性，146份對異煙肼具有耐藥性。經(jīng)熒光PCR探針熔解曲線法檢查后，135份對利福平耐藥，敏感73份，其中僅有114份確定對利福平具有耐藥性；經(jīng)熒光PCR探針熔解曲線法檢查后，134份對異煙肼耐藥，敏感74份，其中有131份確定對異煙肼具有耐藥性，見表1。

2.2? ? 熒光PCR探針熔解曲線法檢測MTBC耐藥性的效能? ? 熒光PCR探針熔解曲線法檢測MTBC對利福平、異煙肼耐藥性的特異度分別為76.14%，95.16%，對異煙肼耐藥性的檢測特異度高于利福平，差異具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；對異煙肼耐藥性的檢測靈敏度低于利福平，準(zhǔn)確度高于利福平，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表2。

3? ? 討論

結(jié)核病是由于結(jié)核桿菌感染人體所導(dǎo)致，根據(jù)感染部位的不同，可分為肺結(jié)核、淋巴結(jié)核、骨骼結(jié)核，且腎臟等其他部位也有可能感染結(jié)核[7]。具體而言，結(jié)核桿菌會入侵人體多個臟器官，其中肺部為主要累及部位，所以通常將其稱之為肺結(jié)核。肺結(jié)核以青年人為主要高發(fā)人群，具有慢性和緩發(fā)傳染病的特點(diǎn)，四季均可能發(fā)病，潛伏期在4～8周之間，除了感染肺部外，還可能感染骨骼、皮膚、腸、腹膜、腦膜以及頸淋巴等[7]。人和人之間的傳播方式主要為呼吸道傳染，傳染源是接觸到已經(jīng)被感染的肺結(jié)核患者。近幾年來，隨著環(huán)境污染問題的日益嚴(yán)重和艾滋病傳播率上升等多種因素的影響，結(jié)核病的發(fā)生率呈現(xiàn)出逐年上升趨勢。結(jié)核病的臨床表現(xiàn)以呼吸系統(tǒng)癥狀為主，如咳嗽、咯血等，同時(shí)伴隨全身癥狀，如乏力、低熱等。抗結(jié)核藥物包括異煙肼、利福平、吡嗪酰胺及乙胺丁醇等[8-9]，但隨著抗結(jié)核藥物的使用，有耐藥性的結(jié)核病患者數(shù)量逐漸增加。當(dāng)患者同時(shí)至少對兩種一線抗結(jié)核藥物——利福平和異煙肼均出現(xiàn)耐藥性，即被稱為耐多藥結(jié)核病[10]。傳統(tǒng)MTBC耐藥性的檢測方法為絕對濃度法，不僅操作繁瑣、耗時(shí)較長，同時(shí)對菌株分離培養(yǎng)的速度慢，進(jìn)而影響對MTBC耐藥性的診斷結(jié)果[11]。

熒光PCR探針熔解曲線法是目前廣泛應(yīng)用于食源性致病菌檢測的方法，是一種體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，以DNA為模板，在體外合適條件下和耐熱DNA聚合酶作用下，對人工合成的寡核苷酸為引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增目的DNA片段。傳統(tǒng)方法檢測致病菌檢出限僅為104 cfu/mL，而大多數(shù)PCR體系的檢出限可達(dá)到10～104 cfu/mL，具有較高的靈敏度[12]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)比例法進(jìn)行的藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，208份MTBC菌種標(biāo)本中，120份對利福平具有耐藥性，146例對異煙肼具有耐藥性。經(jīng)熒光PCR探針熔解曲線法檢查后，135份對利福平耐藥，敏感73份，其中有114份確定對利福平具有耐藥性；經(jīng)熒光PCR探針熔解曲線法檢查后，134份對異煙肼耐藥，敏感74份，其中有131份確定對異煙肼具有耐藥性。熒光PCR探針熔解曲線法檢測MTBC對利福平、異煙肼耐藥性的特異度分別為76.14%，95.16%，對異煙肼耐藥性的檢測特異度高于利福平，差異具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；對異煙肼耐藥性的檢測靈敏度低于利福平，準(zhǔn)確度高于利福平，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。分析原因可能為：在MTBC對異煙肼的耐藥性檢測中，可覆蓋接近90%的異煙肼耐藥性菌株，要多于利福平，與郭紅革等[13]研究結(jié)論相符。

綜上所述，經(jīng)熒光PCR探針熔解曲線法檢測MTBC耐藥性的效能較高，可應(yīng)用于快速發(fā)現(xiàn)耐藥基因位點(diǎn)突變，篩查耐多藥肺結(jié)核，并在治療中進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測，進(jìn)而可指導(dǎo)臨床調(diào)整治療方案。但本研究未對敏感結(jié)核分枝桿菌菌株進(jìn)行檢測，且未明確有無外源性再感染情況發(fā)生，還需進(jìn)行多中心的深入研究。

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（收稿日期：2023-03-11）