顧民華,顧 勇

(海南省中醫(yī)院心血管科,海南 海口 570203)

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病是冠狀動(dòng)脈血管發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化病變而引起血管腔狹窄或阻塞,造成心肌缺血、缺氧或壞死而導(dǎo)致的心臟病,起病急驟且病死率極高,冠心病早期診斷及治療對(duì)改善其預(yù)后具有重要價(jià)值[1-2]。冠心病根據(jù)臨床表現(xiàn)分為穩(wěn)定性冠心病和急性冠狀動(dòng)脈綜合征,診療不及時(shí)往往導(dǎo)致患者發(fā)展成慢性心力衰竭而影響生存質(zhì)量[3-4]。微小RNA(miRNA)為長(zhǎng)度22 bp左右的非編碼小分子RNA,在基因轉(zhuǎn)錄后通過(guò)翻譯抑制或降解/裂解mRNA調(diào)控基因的表達(dá)。越來(lái)越多的研究證實(shí)miRNA參與了心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸,在冠心病發(fā)病機(jī)制、病情及預(yù)后評(píng)估中具有重要價(jià)值[5-6]。川芎嗪有抑制心肌收縮的作用,并使心率減慢,增加心臟灌流量及降低全血黏度,緩解主動(dòng)脈痙攣性收縮,對(duì)心肌具保護(hù)作用,但其具體分子機(jī)制尚未明確[7-8]。本實(shí)驗(yàn)旨在探討川芎嗪通過(guò)miR-34a對(duì)氧化型低密度脂蛋白(Oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)誘導(dǎo)的人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human coronary artery endothelial cells,HCAECs)損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 川芎嗪(純度98.5%)(中國(guó)藥品與生物制品檢定所);HCAECs(上海鈺博生物科技有限公司);ox-LDL(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)研究所);DMEM培養(yǎng)基、FBS(北京Solarbio);丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所);Trizol試劑(大連寶生物公司);腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(Interleukin-1β,IL-1β) ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物技術(shù)有限公司),實(shí)時(shí)熒光定量PCR相關(guān)試劑盒(北京天根公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):HCAECs用含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基,于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組:Con組(正常培養(yǎng)人HCAECs),ox-LDL組(用50 mg/L的ox-LDL干預(yù)HCAECs),1、10、100 mmol/L組(HCAECs用1、10、100 mmol/L川芎嗪處理+ox-LDL干預(yù)),ox-LDL+anti-miR-NC組、ox-LDL+anti-miR-34a組、ox-LDL+miR-NC組、ox-LDL+miR-34a組(ox-LDL干預(yù)HCAECs分別轉(zhuǎn)染anti-miR-NC、anti-miR-34a、miR-NC、miR-34a模擬物),ox-LDL+miR-NC+100 mmol/L組、ox-LDL+miR-34a+100 mmol/L組(將miR-NC、miR-34a模擬物分別轉(zhuǎn)染至ox-LDL干預(yù)HCAECs+100 mmol/L川芎嗪)。

1.2.3 MDA及SOD檢測(cè):收集上述各組細(xì)胞上清液,采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)MDA及SOD,嚴(yán)格按照操作試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)。

1.2.4 miR-34a表達(dá)檢測(cè):采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(qRT-PCR)檢測(cè)miR-34a表達(dá)。采用Trizol試劑從HCAECs中提取總RNA后,微量核酸儀檢測(cè)RNA的純度和濃度。cDNA合成通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行,引物序列為上游引物5’-CTTGAACTCCTGGGGCCTGAAG-3’,下游引物為5’-GCCAAAGAAACACTCACAGCT-3’。按照95 ℃ 3 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s(35個(gè)循環(huán))的程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增。選擇U6為內(nèi)參,參照2-ΔΔCt法計(jì)算miR-34a相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞炎癥反應(yīng)指標(biāo):提取HCAECs的上清液,采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)TNF-α及IL-1β,嚴(yán)格按照操作試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 川芎嗪對(duì)ox-LDL干預(yù)的HCAECs氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響 見(jiàn)表1。與Con組比較,ox-LDL組HCAECs的MDA含量、TNF-α、IL-1β水平升高,SOD活力降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與ox-LDL組比較,1、10、100 mmol/L組細(xì)胞MDA含量及TNF-α、IL-1β水平降低,SOD活力升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 川芎嗪對(duì)ox-LDL干預(yù)的HCAECs氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響

2.2 川芎嗪對(duì)ox-LDL干預(yù)的HCAECs中miR-34a的影響 見(jiàn)表2。與Con組比較,ox-LDL組細(xì)胞miR-34a表達(dá)水平升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與ox-LDL組比較,1、10、100 mmol/L組細(xì)胞miR-34a表達(dá)水平降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 川芎嗪對(duì)ox-LDL干預(yù)的HCAECs中miR-34a的影響

2.3 抑制miR-34a表達(dá)對(duì)ox-LDL干預(yù)HCAECs氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響 見(jiàn)表3。與ox-LDL+anti-miR-NC組比較,ox-LDL+anti-miR-34a組細(xì)胞MDA含量以及TNF-α、IL-1β水平降低,SOD活力升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3 抑制miR-34a表達(dá)對(duì)ox-LDL干預(yù)HCAECs氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響

2.4 過(guò)表達(dá)miR-34a對(duì)ox-LDL干預(yù)HCAECs氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響 見(jiàn)表4。與ox-LDL+miR-NC組比較,ox-LDL+miR-34a組細(xì)胞MDA含量以及TNF-α、IL-1β水平升高,SOD活力降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表4 過(guò)表達(dá)miR-34a對(duì)ox-LDL干預(yù)HCAECs氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響

2.5 過(guò)表達(dá)miR-34a表達(dá)逆轉(zhuǎn)川芎嗪對(duì)ox-LDL干預(yù)HCAECs氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響 見(jiàn)表5。與ox-LDL+miR-NC+100 mmol/L組比較,ox-LDL+miR-34a+100 mmol/L組細(xì)胞MDA含量以及TNF-α、IL-1β水平升高,SOD活力降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表5 過(guò)表達(dá)miR-34a表達(dá)逆轉(zhuǎn)川芎嗪對(duì)ox-LDL干預(yù)HCAECs氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響

3 討 論

ox-LDL由低密度脂蛋白在氧化反應(yīng)下產(chǎn)生,參與機(jī)體多種生理過(guò)程,在體外的主要用途已被用于建立動(dòng)脈粥樣硬化模型,但大量證據(jù)表明即使在低濃度下也能成功誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化前的HCAECs功能障礙、死亡和病理性新血管形成,血清ox-LDL被鑒定為人類早期冠心病的危險(xiǎn)因素[9-10]。ox-LDL可通過(guò)損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞、形成泡沫細(xì)胞、誘導(dǎo)免疫復(fù)合物產(chǎn)生免疫損傷等多種機(jī)制參與冠心病發(fā)病機(jī)制[11]。目前發(fā)現(xiàn)多種藥物可通過(guò)ox-LDL參與冠心病發(fā)病機(jī)制,ox-LDL可作為藥物及信號(hào)通路靶點(diǎn)[12]。冠心病是臨床最常見(jiàn)的心血管疾病,現(xiàn)代藥理研究將冠心病心絞痛分為虛實(shí)證,其中益氣活血通絡(luò)、益氣養(yǎng)陰、溫陽(yáng)通絡(luò)等方法是治療虛證的主要手段;疏肝理氣化瘀、活血化瘀、祛痰化瘀等是治療實(shí)證的主要手段。川芎嗪是中藥川芎的有效成分之一,具有活血通絡(luò)等功效,可抗血小板聚集擴(kuò)張小動(dòng)脈,改善微循環(huán)以及活血化瘀,對(duì)冠心病及血管炎也有很好的治療作用[13]。劉英等[14]研究發(fā)現(xiàn)川芎嗪可減輕冠心病大鼠炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng),在一定程度上改善心肌損傷,可能與激活A(yù)MPK/Nrf-2/HO-1信號(hào)通路有關(guān)。李一[15]研究表明,丹參川芎嗪注射液可減少冠心病發(fā)作的次數(shù),縮短心絞痛持續(xù)的時(shí)間,提高其臨床療效,且用藥的安全性較高。李敏等[16]研究表明,丹參川芎嗪注射液對(duì)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化具有較好的效果。王國(guó)峰等[17]研究表明,川芎嗪降低ox-LDL誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)。闞科佳等[18]研究表明,舒洛地特對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷的具有一定程度的保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),ox-LDL干預(yù)增加HCAECs的MDA、TNF-α、IL-1β水平,但降低SOD活力;而川芎嗪可以拮抗ox-LDL干預(yù)的HCAECs的MDA、TNF-α、IL-1β水平增加和SOD活力降低。

miRNA為長(zhǎng)度22 bp左右的非編碼小分子RNA,在基因轉(zhuǎn)錄后通過(guò)翻譯抑制或降解/裂解mRNA調(diào)控基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)miR-34a與心臟病存在關(guān)聯(lián),miR-34a參與心臟病發(fā)病機(jī)制[19]。黃仲略等[20]研究發(fā)現(xiàn)高糖刺激可促使H9c2心肌細(xì)胞凋亡,整個(gè)過(guò)程與miR-34a的高表達(dá)密切相關(guān),可在臨床為糖尿病心肌病的預(yù)防與治療上提供新的思路。范麗等[21]發(fā)現(xiàn)miR-34a可抑制缺氧復(fù)氧損傷的人H9C2心肌細(xì)胞凋亡,其機(jī)制可能與促進(jìn)PI3K磷酸化,活化PI3K/Akt信號(hào)通路,抑制細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)有關(guān)?；谀壳暗难芯堪l(fā)現(xiàn),推測(cè)miR-34a參與心臟相關(guān)疾病機(jī)制包括抑制心肌細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激及促進(jìn)心肌細(xì)胞修復(fù)等。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示,HCAECs中miR-34a表達(dá)水平在ox-LDL干預(yù)后增加,但在川芎嗪給藥后顯著降低。與ox-LDL+anti-miR-NC組比較,ox-LDL+anti-miR-34a組細(xì)胞MDA含量以及TNF-α、IL-1β水平顯著降低,SOD活力顯著升高。驗(yàn)證 ox-LDL干預(yù)后,HCAECs 中miR-34a 表達(dá)與正常對(duì)照組比較,水平顯著升高;給予miR-34a 抑制劑后,細(xì)胞凋亡顯著降低[22]。miR-34a通過(guò)靶向SIRT1蛋白調(diào)控氧化型低密度脂蛋白介導(dǎo)的HCAECs凋亡。已經(jīng)有研究報(bào)道,葡萄籽原花青素通過(guò)下調(diào)miR-34a減輕過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。本實(shí)驗(yàn)研究顯示,過(guò)表達(dá)miR-34a表達(dá)逆轉(zhuǎn)川芎嗪對(duì)ox-LDL干預(yù)HCAECs氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響。說(shuō)明川芎嗪通過(guò)下調(diào)miR-34a減輕ox-LDL干預(yù)HCAECs損傷。

綜上所述,川芎嗪通過(guò)抑制miR-34a降低ox-LDL誘導(dǎo)的人HCAECs炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激,川芎嗪可能為潛在的冠心病治療藥物。