顧民華,顧 勇

(海南省中醫(yī)院心血管科,海南 海口 570203)

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病是冠狀動脈血管發(fā)生動脈粥樣硬化病變而引起血管腔狹窄或阻塞,造成心肌缺血、缺氧或壞死而導致的心臟病,起病急驟且病死率極高,冠心病早期診斷及治療對改善其預后具有重要價值[1-2]。冠心病根據臨床表現(xiàn)分為穩(wěn)定性冠心病和急性冠狀動脈綜合征,診療不及時往往導致患者發(fā)展成慢性心力衰竭而影響生存質量[3-4]。微小RNA(miRNA)為長度22 bp左右的非編碼小分子RNA,在基因轉錄后通過翻譯抑制或降解/裂解mRNA調控基因的表達。越來越多的研究證實miRNA參與了心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展及轉歸,在冠心病發(fā)病機制、病情及預后評估中具有重要價值[5-6]。川芎嗪有抑制心肌收縮的作用,并使心率減慢,增加心臟灌流量及降低全血黏度,緩解主動脈痙攣性收縮,對心肌具保護作用,但其具體分子機制尚未明確[7-8]。本實驗旨在探討川芎嗪通過miR-34a對氧化型低密度脂蛋白(Oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)誘導的人冠狀動脈內皮細胞(Human coronary artery endothelial cells,HCAECs)損傷的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 川芎嗪(純度98.5%)(中國藥品與生物制品檢定所);HCAECs(上海鈺博生物科技有限公司);ox-LDL(中國醫(yī)學科學院基礎研究所);DMEM培養(yǎng)基、FBS(北京Solarbio);丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所);Trizol試劑(大連寶生物公司);腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素1β(Interleukin-1β,IL-1β) ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物技術有限公司),實時熒光定量PCR相關試劑盒(北京天根公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng):HCAECs用含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基,于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 實驗分組:Con組(正常培養(yǎng)人HCAECs),ox-LDL組(用50 mg/L的ox-LDL干預HCAECs),1、10、100 mmol/L組(HCAECs用1、10、100 mmol/L川芎嗪處理+ox-LDL干預),ox-LDL+anti-miR-NC組、ox-LDL+anti-miR-34a組、ox-LDL+miR-NC組、ox-LDL+miR-34a組(ox-LDL干預HCAECs分別轉染anti-miR-NC、anti-miR-34a、miR-NC、miR-34a模擬物),ox-LDL+miR-NC+100 mmol/L組、ox-LDL+miR-34a+100 mmol/L組(將miR-NC、miR-34a模擬物分別轉染至ox-LDL干預HCAECs+100 mmol/L川芎嗪)。

1.2.3 MDA及SOD檢測:收集上述各組細胞上清液,采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測MDA及SOD,嚴格按照操作試劑盒說明書檢測。

1.2.4 miR-34a表達檢測:采用實時熒光定量PCR法(qRT-PCR)檢測miR-34a表達。采用Trizol試劑從HCAECs中提取總RNA后,微量核酸儀檢測RNA的純度和濃度。cDNA合成通過逆轉錄試劑盒進行,引物序列為上游引物5’-CTTGAACTCCTGGGGCCTGAAG-3’,下游引物為5’-GCCAAAGAAACACTCACAGCT-3’。按照95 ℃ 3 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s(35個循環(huán))的程序進行PCR擴增。選擇U6為內參,參照2-ΔΔCt法計算miR-34a相對表達量。

1.2.5 試劑盒檢測細胞炎癥反應指標:提取HCAECs的上清液,采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測TNF-α及IL-1β,嚴格按照操作試劑盒說明書檢測。

2 結 果

2.1 川芎嗪對ox-LDL干預的HCAECs氧化應激和炎癥反應的影響 見表1。與Con組比較,ox-LDL組HCAECs的MDA含量、TNF-α、IL-1β水平升高,SOD活力降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與ox-LDL組比較,1、10、100 mmol/L組細胞MDA含量及TNF-α、IL-1β水平降低,SOD活力升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 川芎嗪對ox-LDL干預的HCAECs氧化應激和炎癥反應的影響

2.2 川芎嗪對ox-LDL干預的HCAECs中miR-34a的影響 見表2。與Con組比較,ox-LDL組細胞miR-34a表達水平升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與ox-LDL組比較,1、10、100 mmol/L組細胞miR-34a表達水平降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表2 川芎嗪對ox-LDL干預的HCAECs中miR-34a的影響

2.3 抑制miR-34a表達對ox-LDL干預HCAECs氧化應激和炎癥反應的影響 見表3。與ox-LDL+anti-miR-NC組比較,ox-LDL+anti-miR-34a組細胞MDA含量以及TNF-α、IL-1β水平降低,SOD活力升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表3 抑制miR-34a表達對ox-LDL干預HCAECs氧化應激和炎癥反應的影響

2.4 過表達miR-34a對ox-LDL干預HCAECs氧化應激和炎癥反應的影響 見表4。與ox-LDL+miR-NC組比較,ox-LDL+miR-34a組細胞MDA含量以及TNF-α、IL-1β水平升高,SOD活力降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表4 過表達miR-34a對ox-LDL干預HCAECs氧化應激和炎癥反應的影響

2.5 過表達miR-34a表達逆轉川芎嗪對ox-LDL干預HCAECs氧化應激和炎癥反應的影響 見表5。與ox-LDL+miR-NC+100 mmol/L組比較,ox-LDL+miR-34a+100 mmol/L組細胞MDA含量以及TNF-α、IL-1β水平升高,SOD活力降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表5 過表達miR-34a表達逆轉川芎嗪對ox-LDL干預HCAECs氧化應激和炎癥反應的影響

3 討 論

ox-LDL由低密度脂蛋白在氧化反應下產生,參與機體多種生理過程,在體外的主要用途已被用于建立動脈粥樣硬化模型,但大量證據表明即使在低濃度下也能成功誘導動脈粥樣硬化前的HCAECs功能障礙、死亡和病理性新血管形成,血清ox-LDL被鑒定為人類早期冠心病的危險因素[9-10]。ox-LDL可通過損傷血管內皮細胞、形成泡沫細胞、誘導免疫復合物產生免疫損傷等多種機制參與冠心病發(fā)病機制[11]。目前發(fā)現(xiàn)多種藥物可通過ox-LDL參與冠心病發(fā)病機制,ox-LDL可作為藥物及信號通路靶點[12]。冠心病是臨床最常見的心血管疾病,現(xiàn)代藥理研究將冠心病心絞痛分為虛實證,其中益氣活血通絡、益氣養(yǎng)陰、溫陽通絡等方法是治療虛證的主要手段;疏肝理氣化瘀、活血化瘀、祛痰化瘀等是治療實證的主要手段。川芎嗪是中藥川芎的有效成分之一,具有活血通絡等功效,可抗血小板聚集擴張小動脈,改善微循環(huán)以及活血化瘀,對冠心病及血管炎也有很好的治療作用[13]。劉英等[14]研究發(fā)現(xiàn)川芎嗪可減輕冠心病大鼠炎癥反應和氧化應激反應,在一定程度上改善心肌損傷,可能與激活AMPK/Nrf-2/HO-1信號通路有關。李一[15]研究表明,丹參川芎嗪注射液可減少冠心病發(fā)作的次數(shù),縮短心絞痛持續(xù)的時間,提高其臨床療效,且用藥的安全性較高。李敏等[16]研究表明,丹參川芎嗪注射液對冠狀動脈粥樣硬化具有較好的效果。王國峰等[17]研究表明,川芎嗪降低ox-LDL誘導內皮細胞炎癥反應。闞科佳等[18]研究表明,舒洛地特對ox-LDL誘導人臍靜脈內皮細胞損傷的具有一定程度的保護作用。本實驗發(fā)現(xiàn),ox-LDL干預增加HCAECs的MDA、TNF-α、IL-1β水平,但降低SOD活力;而川芎嗪可以拮抗ox-LDL干預的HCAECs的MDA、TNF-α、IL-1β水平增加和SOD活力降低。

miRNA為長度22 bp左右的非編碼小分子RNA,在基因轉錄后通過翻譯抑制或降解/裂解mRNA調控基因的表達。研究發(fā)現(xiàn)miR-34a與心臟病存在關聯(lián),miR-34a參與心臟病發(fā)病機制[19]。黃仲略等[20]研究發(fā)現(xiàn)高糖刺激可促使H9c2心肌細胞凋亡,整個過程與miR-34a的高表達密切相關,可在臨床為糖尿病心肌病的預防與治療上提供新的思路。范麗等[21]發(fā)現(xiàn)miR-34a可抑制缺氧復氧損傷的人H9C2心肌細胞凋亡,其機制可能與促進PI3K磷酸化,活化PI3K/Akt信號通路,抑制細胞凋亡蛋白表達有關?；谀壳暗难芯堪l(fā)現(xiàn),推測miR-34a參與心臟相關疾病機制包括抑制心肌細胞凋亡、氧化應激及促進心肌細胞修復等。本實驗數(shù)據顯示,HCAECs中miR-34a表達水平在ox-LDL干預后增加,但在川芎嗪給藥后顯著降低。與ox-LDL+anti-miR-NC組比較,ox-LDL+anti-miR-34a組細胞MDA含量以及TNF-α、IL-1β水平顯著降低,SOD活力顯著升高。驗證 ox-LDL干預后,HCAECs 中miR-34a 表達與正常對照組比較,水平顯著升高;給予miR-34a 抑制劑后,細胞凋亡顯著降低[22]。miR-34a通過靶向SIRT1蛋白調控氧化型低密度脂蛋白介導的HCAECs凋亡。已經有研究報道,葡萄籽原花青素通過下調miR-34a減輕過氧化氫誘導的心肌細胞損傷。本實驗研究顯示,過表達miR-34a表達逆轉川芎嗪對ox-LDL干預HCAECs氧化應激和炎癥反應的影響。說明川芎嗪通過下調miR-34a減輕ox-LDL干預HCAECs損傷。

綜上所述,川芎嗪通過抑制miR-34a降低ox-LDL誘導的人HCAECs炎癥反應和氧化應激,川芎嗪可能為潛在的冠心病治療藥物。