駱小珊,謝 甦,朱曼荊,黃雅珍,朱久龍,馮豆豆,謝 青,蒙雁云,凌湘力

(1.貴州醫(yī)科大學(xué),貴州 貴陽 550004;2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院,貴州 貴陽 550004;3.寧波市北侖區(qū)人民醫(yī)院,浙江 寧波 315800;4.南方醫(yī)科大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,廣東 廣州 516006)

乳腺癌嚴(yán)重威脅著全球女性健康,2020年超過肺癌成為全球女性第一大癌癥[1]。如今乳腺癌的各種治療手段正在不斷進(jìn)步,但其治療后仍有較高的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率[2]。其中,三陰性乳腺癌(Triple negative breast cancer,TNBC)惡性程度高、侵襲性強(qiáng),手術(shù)聯(lián)合放化療是目前最主要的治療手段,但治療后患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高,遠(yuǎn)期生存率遠(yuǎn)低于其他類型乳腺癌[3-4]。紫杉醇作為TNBC的一線化療藥物廣泛應(yīng)用于臨床。有研究表明,持續(xù)的紫杉醇化療可能會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng),進(jìn)而增加患者治療后的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率[5-6]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)是患者在經(jīng)歷化療過程中腫瘤細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)移能力的重要機(jī)制之一[7]。通過EMT,腫瘤細(xì)胞可隨血液或淋巴系統(tǒng)浸潤至其他器官,并處于可逆的“潛伏”狀態(tài),此時(shí)腫瘤細(xì)胞會(huì)通過減緩分裂,爭取在化療造成的惡劣環(huán)境中生存,待治療停止后伺機(jī)繼續(xù)“作案”,最終導(dǎo)致腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶的形成[8]。如何抑制腫瘤化療中EMT的發(fā)生,降低腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力,進(jìn)而改善患者預(yù)后是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。

中藥聯(lián)合化療藥物在增效減毒、減少腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、改善患者預(yù)后等方面展現(xiàn)了獨(dú)特的優(yōu)勢[9-11]。課題組在前期的臨床研究中發(fā)現(xiàn)薯蕷丸能減輕TNBC患者化療的不良反應(yīng),降低Ki-67陽性表達(dá)[12-13];實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)薯蕷丸聯(lián)合化療藥環(huán)磷酰胺可抑制TNBC荷瘤小鼠腫瘤的生長、提高化療后荷瘤小鼠的免疫功能[14],降低腫瘤組織中EMT相關(guān)蛋白及mRNA的表達(dá)[15]。針對TNBC,薯蕷丸聯(lián)合紫杉醇能否通過抑制腫瘤細(xì)胞EMT,降低化療中腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力尚未得到驗(yàn)證。本研究運(yùn)用血清藥理學(xué)方法制備薯蕷丸含藥血清,并聯(lián)合紫杉醇共同干預(yù)MDA-MB-231細(xì)胞,體外模擬腫瘤細(xì)胞在經(jīng)歷化療藥物治療的同時(shí)聯(lián)合薯蕷丸治療,觀察MDA-MB-231細(xì)胞EMT相關(guān)指標(biāo)及侵襲遷移能力的變化,并進(jìn)一步探究其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞株:本次研究獲得貴州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)審批通過,動(dòng)物倫理審查號為1900650。40只健康SD大鼠,雌性,SPF級,體重(200±20)g,由長沙天勤生物科技有限公司提供[合格證號為:SCXK(湘)2019-0014],動(dòng)物飼養(yǎng)于貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院臨床研究中心動(dòng)物室,在標(biāo)準(zhǔn)的環(huán)境條件下,22～24 ℃恒溫,濕度45%～50%,普通飼料及蒸餾水喂養(yǎng),12 h晝夜節(jié)律。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)遵循“3R”原則。人源TNBC細(xì)胞系 MDA-MB-231購自上海中喬新舟生物科技有限公司,批號為:ZQ0118。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物:紫杉醇購自美國MedChemExpress公司,貨號HY-B0015/CS-1145。薯蕷丸按中藥飲片比例將其配制為顆粒劑,由廣東一方制藥有限公司提供。薯蕷丸顆粒劑組成:薯蕷(山藥)、干地黃各2 g,桂枝、豆蔻、芍藥、干姜各0.5 g,神曲、柴胡各0.7 g,麥門冬、白術(shù)各1.52 g,茯苓、白蘞各0.25 g,川芎1.3 g,當(dāng)歸3.03 g,阿膠6 g,桔梗1.25 g,杏仁0.35 g,人參1 g,防風(fēng)0.65 g,大棗7.5 g,甘草3 g。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)主要試劑:高效RIPA裂解液(R0010)、SDS-PAGE凝膠快速配置試劑盒(P1200)等購自北京索萊寶科技有限公司;BD基質(zhì)膠(356234)購于美國BD股份有限公司;胎牛血清(04-001-ACS)購于以色列BI公司;mTOR(ab32028)、PI3K(ab40776)、Vimentin(ab92547)等抗體均購自英國Abcam公司;N-cadherin(bs-1172R)、MMP2(bs-22503R)等購自北京博奧森生物技術(shù)公司;E-cadherin(20874-1-AP)、GAPDH(10494-1-AP)等抗體購于Proteintech Group,Inc公司。

1.1.4 主要儀器:倒置熒光顯微鏡(德國Carl Zeiss公司,Axio);正置熒光顯微鏡(日本尼康,NIKON ECLIPSE CI);多功能酶標(biāo)儀(美國BioTec公司,ELX50);細(xì)胞培養(yǎng)箱(賽默飛世爾科技有限公司中國,FormaTM3111);熒光定量PCR儀(美國ABI公司,ViiA7Dx);臺(tái)式高速離心機(jī)(美國貝克曼庫爾特公司,Microfuge 20R);化學(xué)發(fā)光成像儀(上海勤翔科學(xué)儀器有限公司,ChemiScope3000Mini);水平電泳儀(北京六一儀器廠,DY-6C)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 含藥血清制備:隨機(jī)把SD大鼠分為薯蕷丸組和空白組各20只,參照文獻(xiàn)[16],空白組以10 ml/kg的0.9%氯化鈉溶液灌胃,每日2次;薯蕷丸組予以配置好的薯蕷丸藥液10 ml/kg灌胃 (含薯蕷丸生藥量 3.05 g),每日2次(用藥量按成人臨床用藥劑量每公斤體重為標(biāo)準(zhǔn),人鼠比例換算后10倍),兩組均連續(xù)灌胃7 d,末次給藥1.5 h后麻醉下腹主動(dòng)脈取血,無菌條件下分離血清,56 ℃水浴滅活30 min,使用0.22 μm無菌微孔過濾器過濾,于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng):人TNBC細(xì)胞株MDA-MB-231復(fù)蘇后,用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),將細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每1～2天更換培養(yǎng)基。取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 細(xì)胞分組與給藥方法:實(shí)驗(yàn)前我們驗(yàn)證了紫杉醇對MDA-MB-231細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)為991.2 nmol/L。本次研究共設(shè)置三組:空白組、紫杉醇組、薯蕷丸聯(lián)合紫杉醇組。藥物干預(yù)方法:取處于對數(shù)生長期MDA-MB-231細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 h后,空白組細(xì)胞給予10%空白血清、紫杉醇組細(xì)胞給予10%空白血清聯(lián)合紫杉醇溶液、薯蕷丸聯(lián)合紫杉醇組細(xì)胞給予10%含薯蕷丸含藥血清聯(lián)合紫杉醇溶液處理,各組均加入DMEM高糖培養(yǎng)基補(bǔ)足體系。以下實(shí)驗(yàn)分組均按上述分組設(shè)置處理。

1.2.4 CCK8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖:取對數(shù)生長期的MDA-MB-231細(xì)胞,接種于96孔板,調(diào)整細(xì)胞密度為5×103個(gè)/孔,每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,待細(xì)胞貼壁后按上述1.2.3分組設(shè)置和藥液的配比處理細(xì)胞24、48、72 h后,吸出原藥液培養(yǎng)基,PBS洗,棄PBS,避光下加入CCK8工作液,37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育1～2 h;多功能酶標(biāo)儀設(shè)置溫度37 ℃,波長450 nm,測定各組OD值,并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 Transwell 小室實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲和遷移能力:按上述1.2.3分組設(shè)置和藥液的配比處理MDA-MB-231細(xì)胞48 h后,收集細(xì)胞重懸,調(diào)整細(xì)胞密度為3×105個(gè)/孔(侵襲實(shí)驗(yàn)時(shí)預(yù)先用matrige膠包被Transwell小室),于上室中加入200 μl細(xì)胞懸液,下層加入600 μl含30%FBS的培養(yǎng)基,置于培養(yǎng)箱中孵育48 h。取出小室,PBS輕洗后,用棉簽輕輕擦去matrige膠,4%多聚甲醛固定40 min,結(jié)晶紫染色30 min,PBS清洗,輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞,待其晾干后于100×倒置顯微鏡下取5個(gè)視野拍照,通過Image J計(jì)算細(xì)胞數(shù)量,求其平均值。實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次。

1.2.6 Western blot法檢測EMT和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平:按上述1.2.3分組設(shè)置和藥液的配比處理MDA-MB-231細(xì)胞48 h后,提取細(xì)胞總蛋白,按BCA蛋白定量法檢測蛋白濃度,確定各組上樣量,制10%分離膠,配電泳液、轉(zhuǎn)膜液,加上樣液,電泳分離,轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉或BSA封閉1.5 h,加入一抗,搖床4 ℃過夜?；厥找豢?洗膜3次,加入二抗,37 ℃孵育45 min,洗膜3次。取出PVDF膜,吸凈余液,放入成像儀中,滴加適量發(fā)光液(1∶1混合A液和B液),高敏模式自動(dòng)曝光。利用Image J軟件分析條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測EMT相關(guān)指標(biāo)mRNA的表達(dá):按上述1.2.3分組設(shè)置及藥液比例處理MDA-MB-231細(xì)胞48 h后,收集細(xì)胞,PBS洗3次,提取總RNA,檢測RNA濃度,稀釋后,將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,-80 ℃保存。以GAPDH為內(nèi)參基因,E-cadherin、Vimentin、N-cadherin和MMP2 為目標(biāo)基因。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,采用2-ΔΔCt方法計(jì)算mRNA相對表達(dá)量。引物序列見表1所示。

表1 引物序列

2 結(jié) 果

2.1 各組MDA-MB-231細(xì)胞增殖情況比較 與空白組相比,紫杉醇組和薯蕷丸聯(lián)合紫杉醇組細(xì)胞增殖受到明顯抑制(P<0.01);與紫杉醇組相比,薯蕷丸聯(lián)合紫杉醇組抑制細(xì)胞增殖能力增強(qiáng),其中除24 h外,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組MDA-MB-231細(xì)胞增殖情況比較(%)

2.2 各組MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力比較 與空白組相比,紫杉醇組和薯蕷丸聯(lián)合紫杉醇組細(xì)胞侵襲能力明顯受到抑制(P<0.01);與紫杉醇組相比,薯蕷丸聯(lián)合紫杉醇組抑制細(xì)胞侵襲的能力顯著增強(qiáng)(P<0.01),表明薯蕷丸聯(lián)合紫杉醇具有協(xié)同抑制MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力的作用。見圖1、表3。

圖1 各組MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力比較(結(jié)晶紫染色,×100)

表3 各組MDA-MB-231細(xì)胞侵襲、遷移能力比較(個(gè))

2.3 各組MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力能力比較 與空白組相比,紫杉醇組和薯蕷丸聯(lián)合紫杉醇組細(xì)胞遷移能力明顯受到抑制(P<0.01);與紫杉醇組相比,薯蕷丸聯(lián)合紫杉醇組抑制細(xì)胞遷移能力顯著增強(qiáng)(P<0.01),表明薯蕷丸聯(lián)合紫杉醇具有協(xié)同抑制MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力的作用。見圖2、表3。

圖2 各組對MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力比較(結(jié)晶紫染色,×100)

2.4 各組MDA-MB-231細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 與空白組相比,紫杉醇組和薯蕷丸聯(lián)合紫杉醇組細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05,P<0.01),Vimentin、N-cadherin和MMP2蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05,P<0.01),其中紫杉醇組的MMP2蛋白表達(dá)未見明顯下調(diào)。與紫杉醇組比較,薯蕷丸聯(lián)合紫杉醇組細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05),Vimentin、MMP2蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05,P<0.01)。見表4。

表4 各組MDA-MB-231細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

2.5 各組MDA-MB-231細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 與空白組相比,紫杉醇組和薯蕷丸聯(lián)合紫杉醇組細(xì)胞中PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05,P<0.01),其中紫杉醇組的p-Akt、p-mTOR蛋白表達(dá)未見明顯下調(diào)。與紫杉醇組相比,薯蕷丸聯(lián)合紫杉醇組PI3K、Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05,P<0.01)。見表5。

表5 各組MDA-MB-231細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

2.6 各組MDA-MB-231細(xì)胞EMT相關(guān)mRNA表達(dá)比較 與空白組相比,紫杉醇組、薯蕷丸聯(lián)合紫杉醇組均能上調(diào)E-cadherin、下調(diào)Vimentin、MMP2 mRNA的表達(dá)(P<0.01),薯蕷丸聯(lián)合紫杉醇組能下調(diào)N-cadherin mRNA的表達(dá)(P<0.01),而紫杉醇組上調(diào)了N-cadherin mRNA的表達(dá);與紫杉醇組相比,薯蕷丸聯(lián)合紫杉醇組上調(diào)E-cadherin mRNA,下調(diào)N-cadherin、MMP2 mRNA表達(dá)能力增強(qiáng)(P<0.01,P<0.05)。見表6。

表6 各組MDA-MB-231細(xì)胞EMT相關(guān)mRNA表達(dá)比較

3 討 論

TNBC是乳腺癌中預(yù)后最差的類型,約占乳腺癌總發(fā)病率的20%,因其缺乏激素受體及Her2的表達(dá),故對內(nèi)分泌和分子靶向治療均不敏感[17],在經(jīng)歷系統(tǒng)治療后仍有很大部分患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移,這是導(dǎo)致患者治療后死亡最主要的原因之一。紫杉醇是一種具有抗腫瘤活性的天然藥物,其可以通過促進(jìn)微管蛋白聚合、阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程和有絲分裂,從而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[18],是目前廣泛應(yīng)用于乳腺癌的一線化療藥物。然而,越來越多的研究表明,紫杉醇在殺死癌細(xì)胞的同時(shí),也會(huì)增加癌細(xì)胞對化療藥物的抗性并促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[5,19];還可通過激活PI3K/Akt信號通路誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)的表達(dá)促使腫瘤細(xì)胞遷移能力提升[20],這些是紫杉醇治療后患者腫瘤仍舊復(fù)發(fā)的可能因素。在眾多促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制中,EMT是上皮來源的腫瘤細(xì)胞獲得侵襲轉(zhuǎn)移能力的關(guān)鍵步驟,其發(fā)生的重要標(biāo)志是上皮細(xì)胞標(biāo)志物 E-cadherin缺失,間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin及MMPs分泌表達(dá)的增加,使細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變、黏附力降低,進(jìn)而促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生遷移、侵襲[21]。PI3K/Akt/mTOR傳導(dǎo)通路控制著腫瘤細(xì)胞的多種生物學(xué)行為,如調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、自噬等[22],在約70%的乳腺癌患者中被過度激活,該通路過度激活后促使EMT發(fā)生是TNBC細(xì)胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制[23-24]。

乳腺癌在中醫(yī)學(xué)里屬“乳巖”“乳石癰”等范疇,總病機(jī)主要概括為“瘀”“毒”“虛”三個(gè)方面,其中“虛”貫穿整個(gè)疾病的始終,也是乳腺癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的決定因素。乳腺癌患者在化療過程中氣血陰陽被耗傷,癌毒殘留,極易復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。針對TNBC患者在手術(shù)及化療后正氣耗傷,無力抗邪,虛不受補(bǔ)的病機(jī),課題組前期在“護(hù)場”理論指導(dǎo)下從后天脾胃入手,選用薯蕷丸進(jìn)行臨床及實(shí)驗(yàn)室研究獲得良效[12-15,25]。薯蕷丸出自張仲景《金匱要略-血痹虛勞病脈證并治第六》,方中以“薯蕷”(山藥)為君統(tǒng)領(lǐng)全方,健脾益氣,益胃養(yǎng)陰,平補(bǔ)陰陽,同調(diào)氣血;合以八珍湯補(bǔ)益氣血;阿膠、麥門冬養(yǎng)血滋陰;柴胡、桂枝、防風(fēng)、白蘞祛風(fēng)散邪疏絡(luò);杏仁、桔梗疏利氣機(jī)。整方著眼于培補(bǔ)后天之本,“執(zhí)中州而灌四旁”,集補(bǔ)脾益氣、養(yǎng)血滋陰、驅(qū)邪理氣于一方,攻補(bǔ)兼施、寒熱并用、陰陽氣血共調(diào),可共奏“護(hù)場”之功,限制腫瘤的發(fā)展。近年來,薯蕷丸多用于改善患者化療焦慮抑郁、疲乏、厭食、降低慢性腎功能衰竭患者腎衰進(jìn)程等[26],但鮮見協(xié)同化療藥物抑制腫瘤發(fā)展的相關(guān)報(bào)道。

本研究通過體外實(shí)驗(yàn)?zāi)M人TNBC細(xì)胞經(jīng)歷化療藥物時(shí)加入薯蕷丸共同干預(yù),探索其對MDA-MB-231細(xì)胞增殖、侵襲、遷移的影響,探尋中醫(yī)藥聯(lián)合化療藥物對腫瘤細(xì)胞發(fā)揮的作用,并從EMT及PI3K/Akt/mTOR信號通路入手,探究其可能的機(jī)制。本次研究結(jié)果表明,MDA-MB-231細(xì)胞在受到紫杉醇及紫杉醇聯(lián)合薯蕷丸干預(yù)后,可顯著抑制細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力,其中薯蕷丸聯(lián)合紫杉醇效果更佳,這表明薯蕷丸聯(lián)合紫杉醇具有協(xié)同增效抑制乳腺癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的作用;在調(diào)控EMT方面,單用紫杉醇并不能顯著調(diào)節(jié)EMT關(guān)鍵蛋白MMP2,甚至增強(qiáng)了N-cadherin mRNA的表達(dá)。MMP2是基質(zhì)金屬蛋白酶家族的明膠酶類,能夠降解細(xì)胞外基質(zhì),在腫瘤細(xì)胞生長、分化、侵襲、轉(zhuǎn)移、調(diào)節(jié)腫瘤血管生成及免疫監(jiān)視中起到關(guān)鍵作用[27];N-cadherin則是間充質(zhì)細(xì)胞典型的分子標(biāo)記物,被認(rèn)為是腫瘤侵襲的啟動(dòng)子;此外,在調(diào)控PI3K/Akt/mTOR信號通路時(shí),單用紫杉醇不能有效抑制關(guān)鍵位點(diǎn)p-Akt、p-mTOR的表達(dá)。而將薯蕷丸聯(lián)合紫杉醇共同干預(yù)后則有效的抑制腫瘤EMT及PI3K/Akt/mTOR信號通路相關(guān)分子的發(fā)展。

綜上所述,薯蕷丸聯(lián)合紫杉醇可以抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖、遷移及侵襲,且具有協(xié)同紫杉醇增效的作用,其機(jī)制可能與下調(diào)PI3K/Akt/mTOR通路進(jìn)而抑制EMT有關(guān)。應(yīng)用于臨床中,薯蕷丸聯(lián)合化療藥物可能降低TNBC患者治療后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移率,將有益于乳腺癌患者預(yù)后,提高生存率。