孫 磊，張明星，翟洪穩(wěn)，馬俊美，張春林，任曉偉，曹梅榮*

（河北省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（特殊食品監(jiān)管技術(shù)），特殊食品安全與健康河北省工程研究中心，河北省食品檢驗(yàn)研究院，河北 石家莊 050227）

季銨鹽是一類(lèi)陽(yáng)離子表面活性劑，該類(lèi)化合物具有良好的乳化、潤(rùn)濕、洗滌、殺菌等性能，在化工等工業(yè)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，同時(shí)在抗菌和消毒等領(lǐng)域也越來(lái)越受到重視[1]。在乳制品生產(chǎn)過(guò)程中，為使衛(wèi)生要求達(dá)標(biāo)，生產(chǎn)企業(yè)會(huì)使用臭氧、含氯消毒劑、季銨鹽類(lèi)消毒劑、乙醇、過(guò)氧化氫、過(guò)氧乙酸等消毒劑對(duì)擠奶設(shè)備、裝奶容器以及生產(chǎn)設(shè)備等進(jìn)行消毒，其中季銨鹽類(lèi)消毒劑副作用小、毒性低且價(jià)格低廉，在乳制品生產(chǎn)工藝中得到廣泛應(yīng)用[2-4]。但隨著各種研究的逐步深入，季銨鹽類(lèi)消毒劑被發(fā)現(xiàn)對(duì)水生生物有較強(qiáng)的毒性[5]，同時(shí)還可能引起人的哮喘、皮膚過(guò)敏性反應(yīng)以及視力減退等病癥[6-7]。特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品是以醫(yī)學(xué)或營(yíng)養(yǎng)學(xué)的研究結(jié)果為依據(jù)，為滿足特殊人群如進(jìn)食受限、消化吸收障礙、代謝紊亂以及其他特定疾病等人群對(duì)營(yíng)養(yǎng)、膳食的需要，加工而成的配方食品[8]。使用該類(lèi)產(chǎn)品的人群通常存在一定程度的身體機(jī)能障礙，自身免疫力較弱[9]，更容易受到殘留消毒劑的不良影響，因此研究建立含乳成分的特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中殘留消毒劑的檢測(cè)方法，并對(duì)特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中消毒劑殘留水平進(jìn)行檢測(cè)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估具有十分重要的意義。

季銨鹽類(lèi)消毒劑常用的檢測(cè)方法主要包括容量分析法[10]、分光光度法[11-12]、氣相色譜法-串聯(lián)質(zhì)譜法[13-14]、離子色譜法[15-16]、高效液相色譜法[17-19]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[20-21]等。其中液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法常見(jiàn)的研究對(duì)象主要有環(huán)境水樣[22-24]、嬰幼兒配方乳粉[25-27]、冷凍食品[28]、血清和尿液[29]以及復(fù)方消毒產(chǎn)品[30]等，但是針對(duì)特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中消毒劑殘留的研究基本空缺，特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品基質(zhì)較為復(fù)雜，容易對(duì)檢測(cè)造成干擾，且其中消毒劑殘留量較低，因此對(duì)檢測(cè)方法的精度要求較高。相比其他檢測(cè)方法，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有較高的靈敏度、選擇性以及出色的定性、定量能力，更適用于特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中低水平殘留消毒劑的檢測(cè)。故研究采用超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatographytandem triple quadrupole mass spectrometry，UPLC-MS/MS）技術(shù)，建立含有乳成分的特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中C12-苯扎氯銨、C14-苯扎氯銨、C16-苯扎氯銨、十二烷基三甲基溴化銨、二癸基二甲基氯化銨和四丁基硫酸氫銨6 種季銨鹽類(lèi)消毒劑殘留量的檢測(cè)方法，為掌握含有乳成分的特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中消毒劑的殘留水平以及對(duì)其風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供方法支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

所用樣品為含有乳成分的特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品，均購(gòu)自藥店和孕嬰店，共5 個(gè)品種、44 批次，其中嬰兒氨基酸配方食品7 批次、嬰兒乳蛋白部分水解配方食品11 批次、嬰兒乳蛋白深度水解配方食品9 批次、全營(yíng)養(yǎng)配方食品6 批次、早產(chǎn)/低出生體質(zhì)量嬰兒配方食品11 批次。

C12-苯扎氯銨（純度99.9%）、C14-苯扎氯銨（純度98.8%）、C16-苯扎氯銨（純度98.8%）、十二烷基三甲基溴化銨（純度99.9%）、二癸基二甲基氯化銨（純度99.9%）、四丁基硫酸氫銨（純度99.8%） 北京曼哈格生物科技有限公司；乙腈、甲醇 美國(guó)Fisher公司；甲酸（色譜純）、乙酸銨 美國(guó)Sigma公司；超純水由Milli-Q純水機(jī)制得，電阻率≥18.2 MΩ·cm。

1.2 儀器與設(shè)備

UPLC-QTrap?5500 UPLC-MS/MS儀 美國(guó)Sciex公司；CR22N高速冷凍離心機(jī) 日本Hitachi公司；Elmasonic P300H超聲波清洗器 德國(guó)Elma公司；Vortex Genius 3旋渦混合器 德國(guó)IKA公司；0.22 μm PTFE微孔濾膜 美國(guó)Pall公司；Milli-Q純水機(jī) 美國(guó)Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取適量的C12-苯扎氯銨、C14-苯扎氯銨、C16-苯扎氯銨、十二烷基三甲基溴化銨、二癸基二甲基氯化銨和四丁基硫酸氫銨6 種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于100 mL棕色容量瓶中，用50%甲醇水溶液溶解并定容至刻度，得到質(zhì)量濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于0～4 ℃冷藏保存，可保存3 個(gè)月。

吸取適量的6 種消毒劑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用50%甲醇水溶液稀釋成質(zhì)量濃度為1.0、0.1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，于0～4 ℃冷藏保存，可保存1 個(gè)月。

1.3.2 樣品前處理

1.3.2.1 固體試樣

準(zhǔn)確稱取1 g（精確至0.001 g）試樣置于15 mL離心管中，加入2 mL加熱至50 ℃左右的超純水，渦旋振蕩10 s，再加入8 mL乙腈，渦旋混勻1 min，超聲提取10 min后，放入-18 ℃冰箱中放置1 h，在0～4 ℃下10 000 r/min離心10 min，上清液過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜后，待測(cè)定。

1.3.2.2 液體試樣

準(zhǔn)確稱取1 g（精確至0.001 g）試樣置于15 mL離心管中，加入9 mL 80%乙腈水溶液，渦旋混勻1 min，超聲提取10 min后，放入-18 ℃冰箱中放置1 h，在0～4 ℃下10 000 r/min離心10 min，上清液過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜后，待測(cè)定。

1.3.3 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制

稱取多份空白試樣，每份1 g（精確至0.001 g），置于15 mL具塞離心管中，加入適量混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，按照1.3.2節(jié)的步驟進(jìn)行相同操作，分別配制質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 ng/mL的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作曲線所需溶液。

1.3.4 色譜條件

色譜柱：安捷倫RRHD Eclipse Plus C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相：20 mmol/L乙酸銨溶液（含0.2%甲酸）、甲醇體積比15∶85；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量2 μL；柱溫25 ℃。

1.3.5 質(zhì)譜條件

離子源參數(shù)：電噴霧離子源正離子模式；噴霧電壓4 000 V；離子源溫度450 ℃；氣簾氣壓力30 psi；霧化氣壓力55 psi；輔助氣壓力55 psi。

在優(yōu)化好的儀器條件下，6 種季銨鹽類(lèi)消毒劑的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 6 種季銨鹽類(lèi)消毒劑的MRM參數(shù)Table 1 MRM parameters for six quaternary ammonium disinfectants

1.4 數(shù)據(jù)處理

儀器操作、分析控制與數(shù)據(jù)收集通過(guò)Analyst?軟件（Version 1.6.3，美國(guó)AB Sciex公司）完成；儀器數(shù)據(jù)處理及消毒劑殘留物的含量計(jì)算通過(guò)MultiQuantTM軟件（Version 3.0.8664.0，美國(guó)AB Sciex公司）完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中通常含有較高的蛋白質(zhì)、脂肪和糖類(lèi)等物質(zhì)，而季銨鹽在水和有機(jī)溶劑中都有良好的溶解度，用水提取樣品中的季銨鹽時(shí)，提取液會(huì)形成懸濁液，無(wú)法開(kāi)展后續(xù)的分析測(cè)定工作，因此常用乙腈和甲醇作為提取溶劑來(lái)提取特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中的季銨鹽類(lèi)消毒劑。采用乙腈作為提取溶劑時(shí)，由于乙腈對(duì)脂肪的溶解度比甲醇低，且比甲醇有更強(qiáng)的沉淀蛋白能力，因此提取溶液相比使用甲醇時(shí)更為清澈，回收率較高并且可以很大程度降低提取液中基質(zhì)的干擾。

本研究考察體積分?jǐn)?shù)60%、70%、80%乙腈溶液和純乙腈作為提取溶劑時(shí)的提取效果。對(duì)于脂肪、蛋白含量較高的樣品，采用60%乙腈溶液進(jìn)行提取時(shí)，提取液經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象。隨著提取液中乙腈的比例不斷提高，對(duì)蛋白的沉淀效果也不斷提升，提取溶液的渾濁度逐漸下降。但使用純乙腈進(jìn)行提取時(shí)，迅速沉淀的蛋白等雜質(zhì)會(huì)與待測(cè)樣品凝結(jié)成團(tuán)狀，不能很好地分散，導(dǎo)致提取效率下降。綜合分析后，最終提取溶劑采用80%乙腈溶液。同時(shí)優(yōu)化固體試樣的提取方式，先用2 mL水充分溶解，再加入8 mL乙腈進(jìn)行提取。同時(shí)采用冷凍提取液的方式，進(jìn)一步促進(jìn)脂類(lèi)和蛋白的沉淀。此外，樣品定量測(cè)定時(shí)采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作曲線進(jìn)行校正，能夠有效降低樣品基質(zhì)的干擾，保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

本研究比較3 種流動(dòng)相對(duì)峰型和響應(yīng)值的影響，分別為水-甲醇、20 mmol/L乙酸銨溶液-甲醇及20 mmol/L乙酸銨溶液（含0.2%甲酸）-甲醇。使用水-甲醇體系時(shí)，得到的峰型較差，且出現(xiàn)了拖尾。使用20 mmol/L乙酸銨溶液-甲醇體系時(shí)，能夠有效改善峰型較寬和拖尾的問(wèn)題。流動(dòng)相加入甲酸后，促進(jìn)待測(cè)物在離子源中的電離，6 種消毒劑的響應(yīng)值均有一定程度的提高，因此最終選擇20 mmol/L乙酸銨溶液（含0.2%甲酸）-甲醇體系作為流動(dòng)相。

2.3 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

在質(zhì)譜上使用基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)6 種季銨鹽類(lèi)消毒劑的碰撞能量和去簇電壓進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)確定適合的駐留時(shí)間，優(yōu)化后的參數(shù)詳見(jiàn)表1。6 種季銨鹽類(lèi)消毒劑均具有良好的峰型和響應(yīng)值，具體的MRM離子色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 6 種季銨鹽類(lèi)消毒劑（1 ng/mL）的MRM離子色譜圖Fig.1 MRM ion chromatograms of six disinfectants (1 ng/mL)

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系、方法檢出限和定量限

通過(guò)向空白基質(zhì)中加標(biāo)的方式，獲得方法的檢出限和定量限。選取信噪比（RS/N）=3時(shí)待測(cè)物的質(zhì)量濃度為方法的檢出限，選取RS/N=10時(shí)待測(cè)物的質(zhì)量濃度為方法的定量限。文獻(xiàn)中的類(lèi)似相關(guān)方法線性相關(guān)系數(shù)通常大于0.995，檢出限為0.2～1.0 μg/kg，定量限為0.5～5.5 μg/kg。由表2可知，本研究中6 種季銨鹽類(lèi)消毒劑殘留量的質(zhì)量濃度為0.1～5.0 ng/mL時(shí)，線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)（R2）≥0.996 0，檢出限為0.5 μg/kg，定量限為1 μg/kg，方法的靈敏度優(yōu)于大部分其他文獻(xiàn)中的方法。

表2 6 種季銨鹽類(lèi)消毒劑的線性關(guān)系、檢出限和定量限Table 2 Linear equations, LODs and LOQs of six disinfectants

2.5 準(zhǔn)確度和精密度

向空白基質(zhì)中添加6 種季銨鹽類(lèi)消毒劑的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)回收率的測(cè)定，分別添加低、中、高3 個(gè)梯度，每個(gè)梯度進(jìn)行6 次重復(fù)測(cè)定。文獻(xiàn)中的類(lèi)似方法加標(biāo)回收率范圍通常為65%～115%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為0.64%～16.80%。由表3可知，6 種季銨鹽類(lèi)消毒劑在固體試樣基質(zhì)中加標(biāo)回收率為72.8%～102.3%，RSD為0.25%～3.88%，在液體試樣基質(zhì)中加標(biāo)回收率為71.8%～100.8%，RSD為0.19%～2.51%，與文獻(xiàn)中的其他方法相比，該方法加標(biāo)回收率穩(wěn)定，且精密度更佳。

表3 6 種季銨鹽類(lèi)消毒劑的加標(biāo)回收率和RSD（n=6）Table 3 Recoveries and RSDs of six disinfectants from spiked samples (n = 6)

2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定

為進(jìn)一步驗(yàn)證本方法的適用性，分別選擇在售的5 個(gè)品種44 批次含乳成分的特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品進(jìn)行實(shí)際樣品檢測(cè)，其中嬰兒氨基酸配方食品7 批次、嬰兒乳蛋白部分水解配方食品11 批次、嬰兒乳蛋白深度水解配方食品9 批次、全營(yíng)養(yǎng)配方食品6 批次、早產(chǎn)/低出生體質(zhì)量嬰兒配方食品11 批次。測(cè)定過(guò)程中方法穩(wěn)定性良好，結(jié)果顯示，該44 個(gè)批次產(chǎn)品中均未檢出6 種季銨鹽類(lèi)消毒劑殘留，表明含乳特醫(yī)食品中消毒劑殘留水平控制的較好。

3 結(jié) 論

該研究基于UPLC-MS/MS技術(shù)建立了含乳成分的特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中6 種季銨鹽類(lèi)消毒劑殘留的檢測(cè)方法。該方法前處理簡(jiǎn)單快速、準(zhǔn)確度高、精密度好，適用于含乳成分的特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中6 種季銨鹽類(lèi)消毒劑殘留量的檢測(cè)。目前對(duì)于特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中季銨鹽消毒劑殘留量的檢測(cè)研究還較少，該研究可以同時(shí)為其他種類(lèi)的特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中季銨鹽類(lèi)消毒劑的檢測(cè)提供技術(shù)參考，并為特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中消毒劑殘留水平的檢測(cè)以及對(duì)其風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供方法支持。