楊 晶, 李 莉, 梁健丹, 黃 珊, 蘇 煒, 韋雅淑, 韋 良*, 肖 琦*

1. 南寧師范大學(xué)化學(xué)與材料學(xué)院, 廣西 南寧 530100

2. 廣西壯族自治區(qū)生殖醫(yī)院, 廣西 南寧 530218

引 言

金屬基抗腫瘤藥物一直是研究的焦點(diǎn), 其中金屬釕配合物由于具有低毒、 易吸收、 抗腫瘤活性高、 靶向性好等優(yōu)點(diǎn), 被認(rèn)為是繼鉑之后最有前途的抗癌藥物[1-3]。 近年來氨基硫脲配體藥物的釕(Ⅱ)芳烴配合物對多種癌細(xì)胞顯示出明顯的體外抗腫瘤活性, 在藥物研發(fā)和化學(xué)生物學(xué)等方面發(fā)揮著重要作用[4-6]。 Su等[7]合成了一系列新型芳基釕(Ⅱ)-TSC配合物, 該抗腫瘤藥物對肝癌細(xì)胞(BEL-7404)和胃癌細(xì)胞(SGC-7901)有很好的抗腫瘤活性。 Floyd等[8]合成、 表征并研究了氨基硫脲配體的釕(Ⅱ)芳烴配合物的抗增殖和抗腫瘤活性, 發(fā)現(xiàn)配合物對人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7和MDA-MB-231)和結(jié)直腸癌細(xì)胞(HCT-116和HT-29)具有較好的抗癌效果。 這些結(jié)果表明, 釕(Ⅱ)芳烴和氨基硫脲配體的組合是開發(fā)新型釕(Ⅱ)基抗癌藥物有希望的起點(diǎn)[9-10]。

人血清白蛋白(human serum albumin, HSA)是人體內(nèi)最豐富的蛋白質(zhì)之一, 占人體血液中總蛋白的60%[11]。 HSA因其水溶性好、 穩(wěn)定性好、 制備簡單、 易純化等優(yōu)點(diǎn), 被廣泛選擇作為模型血清蛋白來研究釕配合物與血清蛋白之間的相互作用[12-13]。 近些年, Thangavel等[14]對N-(吡啶-2-基亞甲基)苯胺衍生物和咔唑Ru(Ⅱ)配合物與HSA的結(jié)合作用、 構(gòu)象變化和分子對接進(jìn)行研究, 結(jié)果表明, Ru(Ⅱ)配合物與HSA具有明顯的強(qiáng)相互作用。 Huang等[15]采用多種光譜分析方法和電分析法, 在生理?xiàng)l件下系統(tǒng)研究了[(η6-p-對傘花烴)Ru(Ⅱ)苯甲醛-N(4)苯基氨基硫脲)Cl]Cl抗癌藥物與HSA之間的相互作用。 由于釕配合物抗腫瘤藥物毒性小, 且更易被腫瘤組織吸收, 同時(shí)可以模擬鐵離子與血漿中的血清蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合, 從而使得藥物更容易進(jìn)入癌細(xì)胞內(nèi), 并顯示出對原發(fā)癌癥和轉(zhuǎn)移性腫瘤較高的的抗癌活性[16-17]。 本工作合成并采用多種光譜技術(shù)研究兩種氨基硫脲芳基釕(Ⅱ)配合物與HSA的相互作用機(jī)制, 同時(shí)結(jié)合熒光猝滅機(jī)理、 相互作用力及構(gòu)象研究, 探討這兩種氨基硫脲芳基釕配合物對HSA結(jié)構(gòu)的影響。 不僅從相應(yīng)作用層面進(jìn)一步分析了該類型配合物具有抗腫瘤活性的本質(zhì)原因, 并且對新型抗腫瘤藥物的設(shè)計(jì)與合成具有重要的理論指導(dǎo)意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑

[Ru(η6-cymene)Cl2]2, 4-甲基-3-硫代氨基脲和4-苯基-3-硫代氨基脲均從百靈威公司購買, 乙醇法制備配合物儲(chǔ)備液[13], 人血清白蛋白(human serum albumin, HSA)、 華法令阻凝劑、 異丁苯丙酸購自Sigma-aldrich公司(美國), HSA溶解于磷酸鹽緩沖鹽水(Phosphate buffered saline, PBS, 0.1 mol·L-1, pH 7.4), 置于冰箱中保存待用。 其他化學(xué)試劑均為分析試劑級(jí), 未經(jīng)進(jìn)一步純化即可使用。 超純水由Millipore-Q凈化裝置(18.2 MΩ)制備。

1.2 儀器

LS-55型熒光分光光度計(jì)(美國, PerkinElmer Limited公司), Quanta Master 8000型穩(wěn)態(tài)瞬態(tài)熒光光譜儀(日本, HORIBA科學(xué)儀器事業(yè)部), Cary 100型紫外-可見分光光度計(jì)(澳大利亞, 安捷倫技術(shù)公司), Nicolet Avater FT-360型紅外光譜儀(美國, Thermo Scientific公司), Chirascan型圓二色光譜儀(英國, Applied Photophysics公司), PB-10型pH計(jì)(中國, 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)。

1.3 氨基硫脲基釕配合物的合成

根據(jù)文獻(xiàn)[2, 18]合成配合物1: 將4-甲基-3-硫代氨基脲(0.45 mmol)和9-蒽甲醛(0.3 mmol)溶于10 mL二氯甲烷中, 常溫?cái)嚢? h, 減壓蒸餾部分溶劑, 加石油醚至明顯分層, 靜置24 h, 重結(jié)晶2～3次, 得到配體。 取29.3 mg配體(0.1 mmol)溶于6 mL二氯甲烷, 加31 mg(0.05 mmol)[Ru(η6-cymene)Cl2]2, 常溫?cái)嚢? h, 將反應(yīng)液減壓蒸餾部分溶劑, 加石油醚(明顯分層)靜置24 h, 析出固體, 得到配合物1。 產(chǎn)量: 33 mg(86%)。

配合物2的合成: 將4-甲基-3-硫代氨基脲換成4-苯基-3-硫代氨基脲(0.45 mmol), 其他合成步驟與配合物1相同。 產(chǎn)量: 38 mg(74%)。

兩種氨基硫脲芳基釕(Ⅱ)配合物的結(jié)構(gòu)如圖1(a, b)所示。 配合物溶解在二甲基亞砜中, 超聲5 min后冷藏備用。

圖1 氨基硫脲芳基釕(Ⅱ)配合物1(a)和配合物2(b)的結(jié)構(gòu)

1.4 猝滅機(jī)理研究

時(shí)間分辨熒光光譜(熒光壽命)法: 激發(fā)波長為278 nm, 發(fā)射波長為350 nm, 狹縫為5 nm; 兩種配合物與HSA的濃度均為2.0×10-6mol·L-1。

穩(wěn)態(tài)熒光光譜法: 以295 nm為激發(fā)波長, 掃描波長范圍為300～450 nm, 激發(fā)與發(fā)射狹縫分別為10.0和7.5 nm, HSA的濃度為2.0×10-6mol·L-1; 配合物1的濃度為2.0×10-6mol·L-1, 配合物2的濃度為1.0×10-6mol·L-1。

1.5 二級(jí)構(gòu)象研究

紅外吸收光譜法: 在2 000～1 750 cm-1的波長范圍內(nèi)掃描記錄HSA溶液的差譜基線進(jìn)行校正; HSA和兩種配合物的濃度均為1.0×10-3mol·L-1。

圓二色光譜法: 掃描速度為500 nm·s-1, 響應(yīng)時(shí)間為0.5 s, 掃描波長范圍為200～280 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 氨基硫脲基釕配合物對HSA的熒光猝滅影響

HSA的內(nèi)源性熒光主要由色氨酸殘基、 酪氨酸殘基以及苯丙氨酸殘基等熒光基團(tuán)提供。 在小分子配合物與HSA結(jié)合作用后改變了HSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)及氨基酸殘基的微環(huán)境, 從而使HSA的熒光強(qiáng)度發(fā)生改變[15]。 圖2(a, b)分別為兩種氨基硫脲芳基釕配合物與HSA的熒光猝滅譜, 在相同的實(shí)驗(yàn)條件下, HSA在350 nm附近出現(xiàn)強(qiáng)烈的熒光發(fā)射峰, 而兩個(gè)配合物在相應(yīng)位置幾乎沒有發(fā)射峰出現(xiàn), 因此可忽略這兩個(gè)配合物自身對HSA的影響。 隨著兩個(gè)配合物濃度的增加, HSA的熒光強(qiáng)度有規(guī)律地下降, 說明配合物對HSA的熒光猝滅影響與配合物的濃度呈線性關(guān)系。 當(dāng)配合物1的濃度為2.0×10-7mol·L-1, 其對HSA的猝滅效率為47.00%, 配合物2為1.0×10-7mol·L-1, 其對HSA的猝滅效率為48.56%, 由此可見, 配合物2對HSA的熒光猝滅效率更強(qiáng)。

圖2 (a)不同濃度配合物1與HSA在298 K處相互作用的熒光猝滅圖, 1—11: c配合物1=0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2.0×10-6 mol·L-1, cComplex 1 only=2.0×10-6 mol·L-1; (b)不同濃度配合物2與HSA在298 K處相互作用的熒光猝滅圖, c配合物2=0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0×10-6 mol·L-1, cComplex 2 only=1.0×10-6 mol·L-1, 其中, cHSA=2.0×10-6 mol·L-1

2.2 氨基硫脲基釕配合物對HSA的熒光猝滅機(jī)理

熒光猝滅主要發(fā)生在猝滅劑與熒光基團(tuán)之間的碰撞或基態(tài)復(fù)合物的形成過程, 因此猝滅機(jī)理可分為靜態(tài)猝滅和動(dòng)態(tài)猝滅, 其區(qū)別在于對溫度的依賴性不同, 靜態(tài)猝滅的猝滅常數(shù)隨溫度的升高而降低, 而動(dòng)態(tài)猝滅反之[11-12]。 為了探討可能的猝滅機(jī)理, 進(jìn)行了三種不同溫度(298, 304, 310 K)下的熒光猝滅實(shí)驗(yàn), 并根據(jù)Stern-Volmer方程(1)式分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

(1)

式(1)中,F0和F分別是小分子配體加入前后的熒光強(qiáng)度,Ksv為猝滅常數(shù), [Q]為配合物的濃度。

兩個(gè)配合物與HSA相互作用的Stern-Volmer結(jié)果見圖3(a, b)所示, 相關(guān)數(shù)據(jù)列于表1。 298 K時(shí), 配合物1的Ksv為4.28×105L·mol-1, 配合物2的Ksv為10.03×105L·mol-1, 隨著溫度的不斷升高, 兩種配合物與HSA相互作用的猝滅常數(shù)逐漸降低, 這說明氨基硫脲基芳基釕配合物與HSA相互作用的熒光猝滅機(jī)理為靜態(tài)猝滅。 在相同條件下,配合物2與HSA的熒光猝滅常數(shù)更大, 可進(jìn)一步說明配合物2的熒光猝滅能力更強(qiáng)。

表1 兩種氨基硫脲芳基釕配合物與HSA相互作用的猝滅常數(shù)、 結(jié)合常數(shù)與熱力學(xué)參數(shù)

圖3 不同溫度下氨基硫脲芳基釕配合物1(a)和配合物2(b)與HSA相互作用的熒光猝滅Stern-Volmer圖

靜態(tài)猝滅機(jī)理還可以根據(jù)修正的Stern-Volmer方程(2)式進(jìn)一步分析驗(yàn)證該結(jié)果[13]。

(2)

式(2)中,Ka為小分子配體與HSA相互作用的結(jié)合常數(shù), [Q]為小分子配體的濃度,fa為HSA熒光分子可接近猝滅劑的分?jǐn)?shù)。

如圖4(a, b)所示, 兩種氨基硫脲芳基釕配合物與HSA之間相互作用修正后的Stern-Volmer方程的線性關(guān)系良好,Ka值列于表1。 當(dāng)溫度從298 K升到310 K, 兩種氨基硫脲芳基釕配合物與HSA相互作用的Ka值卻隨之下降, 這可以進(jìn)一步確定為靜態(tài)猝滅過程。 在相同條件下, 配合物2與HSA的Ka值更大, 進(jìn)一步說明配合物2與HSA的結(jié)合能力更強(qiáng)。

圖4 不同溫度下氨基硫脲芳基釕配合物1(a)和配合物2(b)與HSA相互作用修正的Stern-Volmer方程圖

除了穩(wěn)態(tài)熒光光譜法, 時(shí)間分辨熒光光譜法也是探究熒光猝滅機(jī)理的一種常用方法。 熒光團(tuán)的熒光壽命通常在動(dòng)態(tài)猝滅過程中發(fā)生變化, 而在靜態(tài)猝滅過程中保持不變[19]。 如圖5及表2所示, 加入兩種配合物后, HSA的平均熒光壽命變化很小, 揭示了這兩種配合物與HSA作用均為靜態(tài)猝滅[15]。

表2 兩種氨基硫脲芳基釕配合物與HSA相互作用的熒光壽命數(shù)據(jù)

圖5 兩種氨基硫脲芳基釕配合物與HSA相互作用的熒光壽命圖

2.3 氨基硫脲基釕配合物與HSA的相互作用力研究

內(nèi)源性配體或外源性配體與HSA的結(jié)合力通常包括疏水作用力、 范德華相互作用力、 氫鍵、 靜電相互作用力等, 可以通過改變某些熱力學(xué)參數(shù)來闡明其主要作用力類型[16]。 如果焓變(ΔH)在研究溫度范圍內(nèi)保持不變, 熵變(ΔS)和吉布斯自由能變化(ΔG)可以用方程(3)和方程(4)計(jì)算[17]。

(3)

ΔG=ΔH-TΔS

(4)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, lnKa與1/T之間存在著良好的線性關(guān)系, 如圖6所示。 ΔH, ΔS和ΔG等相關(guān)數(shù)據(jù)匯總于表1。 ΔG為負(fù)值, 表明兩種配合物與HSA之間的結(jié)合過程是自發(fā)的; ΔH和ΔS均為負(fù)值, 表明范德華力和氫鍵在氨基硫脲芳基釕配合物與HSA的相互作用中起主要作用。

圖6 氨基硫脲芳基釕配合物1(a), 配合物2(b)與HSA相互作用的van’t Hoff關(guān)系

2.4 氨基硫脲基釕配合物與HSA作用的構(gòu)象研究

圖7 兩種氨基硫脲芳基釕配合物與HSA的紅外吸收光譜圖

圓二色光譜也是驗(yàn)證HSA與其他小分子配體相互作用后結(jié)構(gòu)是否發(fā)生變化的一種有效方法。 如圖8(a, b, c)所示, HSA在208和222 nm附近有兩個(gè)α-螺旋結(jié)構(gòu)的特征吸收峰[19]。 待加入兩種配合物后, HSA在上述位置的特征吸收峰峰值均明顯下降, 這表明HSA的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化, 尤其是α-螺旋結(jié)構(gòu)含量變化最大[15]。 為了量化HSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量, 結(jié)合CDNN軟件進(jìn)行計(jì)算, 其結(jié)果列于表3。 隨著配合物1濃度的增加, HSA的α-螺旋結(jié)構(gòu)含量從63.5%降到55.4%, 但β-折疊、 β-轉(zhuǎn)角及無規(guī)則卷曲量卻均不同程度增加; 而加入配合物2時(shí), 除β-折疊等量均不同程度增加外, HSA的α-螺旋結(jié)構(gòu)含量從63.5%降到46.4%, 結(jié)果表明這兩種配合物的加入均改變了HSA原有的二級(jí)結(jié)構(gòu), 使其α-螺旋結(jié)構(gòu)向β-折疊、 β-轉(zhuǎn)角、 無規(guī)則卷曲轉(zhuǎn)變, 從而使HSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性降低。 相比于配合物1, 配合物2對HSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)影響更大。

表3 兩種氨基硫脲芳基釕配合物與HSA相互作用的圓二色光譜數(shù)據(jù)

圖8 兩種氨基硫脲芳基釕配合物與HSA相互作用的圓二色光譜

3 結(jié) 論

通過熒光光譜、 熒光壽命、 紅外吸收光譜、 圓二色光譜等方法系統(tǒng)研究了兩種氨基硫脲芳基釕(Ⅱ)配合物與HSA的相互作用機(jī)制。 結(jié)果表明, 兩種配合物通過濃度依賴的靜態(tài)猝滅機(jī)理有效地猝滅了HSA的內(nèi)源熒光; 熱力學(xué)參數(shù)表明, 兩種配合物主要通過范德華相互作用力和氫鍵自發(fā)地與HSA相互作用, 采用紅外吸收光譜和圓二色光譜研究了這兩種配合物對HSA的構(gòu)象均有影響。 配合物2對HSA的熒光猝滅效率更強(qiáng), 對二級(jí)結(jié)構(gòu)變化的影響更大。 研究結(jié)論有助于更好地理解芳基釕配合物抗腫瘤藥物與HSA之間的相互作用, 對以氨基硫脲為配體的抗腫瘤芳基釕配合物在生物醫(yī)學(xué)和治療領(lǐng)域的應(yīng)用發(fā)展具有重要意義。