趙少添,陳樹泓,吳凌偉,王水興*

(1.南昌大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院,南昌 330031;2.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院,南昌 330047)

雞肉美味營養(yǎng),富含人體所需的各種氨基酸,是優(yōu)質(zhì)的動(dòng)物蛋白質(zhì)來源[1-2]。雞湯在熬制過程中,雞肉中的部分水溶性成分會(huì)溶解于雞湯中,隨著燉煮時(shí)間的增加,雞湯中的營養(yǎng)含量也隨之增加[3]。雞湯的營養(yǎng)含量雖不如雞肉高,但經(jīng)過長時(shí)間燉煮的湯中營養(yǎng)物質(zhì)經(jīng)過初步水解,更容易被人體消化吸收。

痛風(fēng)是人體內(nèi)嘌呤代謝障礙引發(fā)的疾病[4]。在痛風(fēng)患者中,因遺傳因素而痛風(fēng)的患者僅占總患者的10%～20%,多數(shù)患者是不正確飲食或其他疾病而引發(fā)痛風(fēng),其中攝入嘌呤含量過多是重要原因之一。由于雞湯中嘌呤含量較高,痛風(fēng)患者在痛風(fēng)急性階段應(yīng)避免食用雞湯[5-6]。研究表明,低嘌呤飲食對(duì)高尿酸血癥及痛風(fēng)患者的癥狀有明顯的改善作用[7-8]。因此,飲食治療是痛風(fēng)患者的重要治療方式之一。

當(dāng)前對(duì)低嘌呤食品的研究較少,目前方法有吸附法[9-10]、鹽析吸附法[11-12]、酶法[13-14]、超聲波法[15]、微生物法[16-17]。樹脂吸附分離由于吸附量大、操作簡便、選擇性好、可反復(fù)使用和成本低等特點(diǎn)[18-19],被廣泛應(yīng)用于多數(shù)天然產(chǎn)物的分離提取中[20-21],且目前鮮有應(yīng)用樹脂脫除食品中嘌呤物質(zhì)的研究。為此,本研究以崇仁麻雞湯為原料篩選合適型號(hào)的樹脂并探究吸附工藝參數(shù)。降低雞湯嘌呤含量既符合消費(fèi)者的保健要求,又提高了產(chǎn)品的附加值,同時(shí)為后期工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

崇仁麻雞:江西崇仁縣麻雞發(fā)展有限公司;樹脂:江蘇蘇青水處理工程集團(tuán)有限公司;10%四丁基氫氧化銨溶液(色譜純):上海麥克林生化科技股份有限公司;腺嘌呤、鳥嘌呤、黃嘌呤、次黃嘌呤、甲酸、三氟乙酸(均為分析純):上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1260高效液相色譜儀 安捷倫科技(中國)有限公司;RV05旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海萬捷科技有限公司;JSM-6701F冷場發(fā)射掃描電鏡能譜儀 日本JEOL公司;Nicolet iS50傅里葉變換紅外光譜儀 賽默飛世爾科技(中國)有限公司;HWY-200全溫?fù)u床 常州諾基儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 雞湯樣品制備

將新鮮崇仁麻雞宰殺,除去血、毛、內(nèi)臟后,用自來水沖洗干凈置于砂鍋中燉煮(肉和水的質(zhì)量比為 1∶3),先用大火煮沸,待煮開后用小火燉煮120 min, 冷卻后去除上層黏稠雞油,用濾網(wǎng)過濾大部分雜質(zhì)后將雞湯分批保存使用。

1.3.2 樣品嘌呤測定前處理

取 5 mL雞湯,置于 50 mL 離心管中,加入 10 mL 甲酸和三氟乙酸(體積比為1∶1),立即置于沸水浴中,100 ℃下水解45 min,水解結(jié)束后迅速冰浴冷卻;用 10 mol/L KOH溶液調(diào)至中性,以5 000 r/min離心10 min,取上清液用稀磷酸將濾液的 pH 調(diào)至 3.8以下,以5 000 r/min離心15 min,取上清液定容,經(jīng)過 0.22 μm 微膜過濾后,在 256 nm 波長處根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出雞湯中嘌呤水解后的嘌呤含量[22]。

1.3.3 嘌呤含量測定

采用高效液相色譜法測定樣品中嘌呤含量。色譜柱規(guī)格為Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm,5.0 μm)。結(jié)合李婷婷等[23]、曲欣等[24]的方法,將高效液相色譜條件設(shè)定為柱溫32 ℃、檢測波長254 nm;流速1.0 mL/min;進(jìn)樣體積10 μL;流動(dòng)相水∶甲醇∶冰乙酸∶10% 四丁基氫氧化銨970∶20∶5∶5。取等體積的4種嘌呤標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,配制混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。以超純水稀釋成質(zhì)量濃度分別為5,10,20,30,40,50 mg/L,用 0.22 μm 濾膜過濾至進(jìn)樣瓶中,在上述液相條件下上機(jī)檢測,以峰面積(Y)及樣品質(zhì)量濃度(X)作線性回歸,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:腺嘌呤y=50.76x+33.728(R2=0.998 2);鳥嘌呤y=36.109x+0.783 3(R2=0.999 9);次黃嘌呤y=39.657x+6.569 6(R2=0.999 7);黃嘌呤y=26.323x+20.926(R2=0.998 0)。計(jì)算4種嘌呤含量之和得到總嘌呤含量。

1.3.4 樹脂型號(hào)篩選

將10種樹脂按照所處類型分別進(jìn)行預(yù)處理,用濾紙吸干預(yù)處理后的樹脂表面的水分,分別稱取3.0 g,置于200 mL的錐形瓶中,各加入50 mL雞湯,置于全溫?fù)u床中,在30 ℃的恒溫條件下振蕩6 h,每組重復(fù)3次,測定不同樹脂嘌呤吸附率。

1.3.5 樹脂形態(tài)結(jié)構(gòu)的表征

1.3.5.1 SEM

取吸附前后001×8樹脂置于附有碳導(dǎo)電膠的載物臺(tái)上,在真空噴鍍儀上鍍一層金屬薄膜以便導(dǎo)電,在掃描電鏡上進(jìn)行觀察,條件為電壓5 kV、工作距離 12.3～12.7 mm[25]。

1.3.5.2 FT-IR

將吸附前后001×8樹脂研磨粉碎后與KBr混合,壓制成薄片,掃描范圍為4 000～400 cm-1,儀器分辨率為4 cm-1,掃描次數(shù)為64次。

1.3.6 單因素實(shí)驗(yàn)

1.3.6.1 樹脂用量

在錐形瓶中分別投加0.5,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 g的001×8離子交換樹脂,移取50 mL雞湯于錐形瓶中,在30 ℃、160 r/min條件下振蕩吸附6 h,取吸附后的溶液測定樹脂嘌呤吸附量與吸附率。

1.3.6.2 吸附溫度

在樹脂最優(yōu)用量條件下,保持其他條件與前面一致,將其分別置于15,20,25,30,35,40 ℃全溫?fù)u床上,測定嘌呤吸附率。

1.3.6.3 吸附時(shí)間

在樹脂最優(yōu)用量及吸附溫度條件下,保持其他條件與前面一致,分別振蕩0.5,1,2,3,4,5,6 h后測定嘌呤吸附率。

1.3.6.4 振蕩速度

在前面探究的基礎(chǔ)上,分別調(diào)節(jié)搖床振蕩速度為80,100,120,140,160,180 r/min,測定嘌呤吸附率。

1.3.7 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),對(duì)雞湯總嘌呤的去除率進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素及水平見表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment design

1.3.8 樹脂的再生及循環(huán)實(shí)驗(yàn)

探討樹脂的再生效果和循環(huán)利用效果。在響應(yīng)面探究的最優(yōu)條件下進(jìn)行吸附實(shí)驗(yàn),將吸附后的樹脂用50 mL 2% HCl 溶液脫附5 h,將脫附后的樹脂再進(jìn)行嘌呤吸附實(shí)驗(yàn),重復(fù) 10次,測定每次實(shí)驗(yàn)樹脂對(duì)雞湯嘌呤的去除率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同樹脂的吸附效果分析

分別采用10種樹脂靜態(tài)吸附雞湯,探究不同樹脂對(duì)雞湯嘌呤物質(zhì)的吸附率,結(jié)果見圖1。

圖1 不同型號(hào)樹脂對(duì)嘌呤的吸附率Fig.1 The adsorption rates of different types of resins on purines

實(shí)驗(yàn)測試了目前應(yīng)用較廣泛的10種型號(hào)樹脂,其中包括5種陽離子交換樹脂、3種陰離子交換樹脂以及2種大孔吸附樹脂。由圖1可知,001×7樹脂和001×8樹脂是吸附效果最好的兩種樹脂,吸附率均超過55%,型號(hào)上均屬于凝膠型陽離子交換樹脂,在多項(xiàng)樹脂理化性質(zhì)上二者具有高度的相似性。001×8樹脂相比001×7樹脂在嘌呤物質(zhì)的吸附率上更勝一籌,推測是由于其交聯(lián)度更高,相比前者有著更高的體積交換容量和更低的含水率,使其對(duì)嘌呤物質(zhì)的吸附效果更佳。因此,選擇001×8樹脂作為雞湯中嘌呤物質(zhì)的吸附劑進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 樹脂表征分析

2.2.1 SEM

SEM是一種較常用的觀測吸附劑表面形貌表征的手段。001×8樹脂在不同放大倍數(shù)下的掃描電鏡圖見圖2,其中a、c放大倍數(shù)為200倍,b、d放大倍數(shù)為2 000倍。

圖2 001×8樹脂的SEM圖Fig.2 SEM images of 001×8 resin注:a、b為吸附前;c、d為吸附后。

由圖2可知,在嘌呤雞湯體系中樹脂吸附前后的表面形態(tài)發(fā)生顯著變化,樹脂表面由光滑變得粗糙,出現(xiàn)不規(guī)則帶狀物,說明雞湯中部分物質(zhì)被吸附而附著于樹脂表面,001×8離子交換樹脂對(duì)雞湯體系具有較好的吸附作用。

2.2.2 FT-IR

001×8樹脂對(duì)雞湯中嘌呤物質(zhì)吸附前后的FT-IR圖見圖3。

圖3 001×8樹脂吸附前后的FT-IR 圖Fig.3 FT-IR spectra of 001×8 resin before and after adsorption

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.3.1 樹脂用量對(duì)雞湯嘌呤的影響

由圖4可知,001×8樹脂用量增加過程中,前期隨著樹脂用量的增加吸附率呈現(xiàn)快速增加的趨勢;當(dāng)樹脂用量增加到3 g后,繼續(xù)增加樹脂用量對(duì)嘌呤吸附率的提升有限。從吸附量Qe 的變化可以看出,樹脂用量的增大固然會(huì)提供更多的活性吸附位點(diǎn)從而提升吸附率,但吸附容量的利用程度也隨樹脂用量的增加而降低。確定一個(gè)合適的樹脂用量在考慮嘌呤吸附率的同時(shí)也應(yīng)顧及到經(jīng)濟(jì)適用性,故采用3 g的樹脂用量進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化。

圖4 樹脂用量對(duì)嘌呤吸附率及吸附容量的影響Fig.4 Effect of resin dosage on the adsorption rate and adsorption capacity of purine

2.3.2 吸附時(shí)間對(duì)雞湯嘌呤的影響

由圖5可知,嘌呤吸附率隨反應(yīng)時(shí)間的延長而提升。反應(yīng)前期吸附快速進(jìn)行,這一階段的推動(dòng)力主要源于固-液兩相較大的嘌呤濃度差以及離子交換樹脂001×8前期存在的大量空白吸附位點(diǎn)[29]。反應(yīng)時(shí)間在4 h后樹脂表面的活性吸附位點(diǎn)減少,固-液兩相嘌呤濃度差趨近動(dòng)態(tài)平衡,樹脂的嘌呤吸附率增加趨近于零,此時(shí)繼續(xù)增加反應(yīng)時(shí)間對(duì)嘌呤吸附率已經(jīng)難以提升,故吸附時(shí)間定為4 h。

圖5 樹脂處理時(shí)間對(duì)嘌呤吸附率的影響Fig.5 Effect of resin treatment time on the adsorption rate of purine

2.3.3 吸附溫度對(duì)雞湯嘌呤的影響

由圖6可知,整體上溫度的升高對(duì)嘌呤物質(zhì)的吸附過程有所阻礙。推測樹脂對(duì)嘌呤的吸附是放熱反應(yīng),但溫度過低也會(huì)增加吸附劑與吸附質(zhì)之間的傳質(zhì)阻力[28],影響吸附反應(yīng)的發(fā)生。因此,一味地提升或降低溫度都無法達(dá)到樹脂吸附條件的最優(yōu)值,故采用20 ℃進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化。

圖6 吸附溫度對(duì)嘌呤吸附率的影響Fig.6 Effect of adsorption temperature on the adsorption rate of purine

2.3.4 振蕩速度對(duì)雞湯嘌呤的影響

由圖7可知,一定范圍內(nèi)振蕩速度的提高能有效地提前吸附平衡的時(shí)間。在轉(zhuǎn)速較低時(shí),溶液中部分樹脂沉淀在瓶底,與雞湯中的嘌呤物質(zhì)得不到充分接觸,導(dǎo)致吸附速率較慢。隨著轉(zhuǎn)速的提高,樹脂與嘌呤物質(zhì)的接觸頻率得到明顯提升,吸附平衡的時(shí)間也隨之提前;之后繼續(xù)增加振蕩速度對(duì)吸附促進(jìn)無明顯效果;同時(shí)過高的振蕩速度可能會(huì)導(dǎo)致樹脂的空間結(jié)構(gòu)破裂,阻礙嘌呤的吸附。振蕩速度的提升也會(huì)提升工業(yè)化的成本,故振蕩速度采用120 r/min。

圖7 振蕩速度對(duì)嘌呤吸附率的影響Fig.7 Effect of oscillation velocity on the adsorption rate of purine

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2.4.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果與方差分析

以崇仁麻雞湯的嘌呤去除率為評(píng)價(jià)指標(biāo),在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),對(duì)樹脂用量(A)、吸附時(shí)間(B)、吸附溫度(C)、振蕩速度(D)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Response surface experiment design and results

通過 Design-Expert對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析,得到回歸方程:Y=64.98+3.25A+0.37B-0.43C+0.34D-0.093AB+0.15AC+0.065AD-0.44BC-0.033CD-1.63A2-0.14B2-0.93C2-0.15D2。

對(duì)該響應(yīng)面回歸模型進(jìn)行方差分析,結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面回歸模型及方差分析Table 3 Response surface regression model and variance analysis

由表3可知,模型的P值< 0.000 1,表明模型高度顯著。失擬項(xiàng)的P值=0.200 6>0.05(不顯著),說明該響應(yīng)面模型誤差小。R2=0.988 5,RAdj2=0.977 1,說明模型的擬合度較高,只有2.29%的情況該模型無法解釋。通過比較響應(yīng)面中F值與P值大小可知,4個(gè)因素對(duì)雞湯中嘌呤物質(zhì)去除率的影響大小為A>C>B>D。

2.4.2 響應(yīng)面分析與最佳優(yōu)化條件的確定

在3D圖中,單因素所對(duì)應(yīng)的曲線的陡峭程度反映了其對(duì)響應(yīng)值的影響程度。由圖8可知,雞湯嘌呤物質(zhì)去除率的優(yōu)化工藝中樹脂用量的影響>吸附溫度的影響>吸附時(shí)間的影響>振蕩速度的影響,與前面方差分析結(jié)果一致。

圖8 各因素交互作用的響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface diagrams of interaction of various factors

通過 Design-Expert 8.0分析處理得到雞湯嘌呤物質(zhì)去除率的最佳反應(yīng)條件為樹脂用量4 g、吸附時(shí)間4.4 h、吸附溫度15.4 ℃、振蕩速度120 r/min,在此條件下測得樹脂對(duì)雞湯嘌呤的去除率為66.7%,與預(yù)測結(jié)果相接近,表明建立的回歸模型對(duì)001×8樹脂用于雞湯嘌呤物質(zhì)去除效果影響的分析是準(zhǔn)確可靠的。

2.5 樹脂再生和重復(fù)利用分析

由圖9可知,對(duì)001×8樹脂進(jìn)行10次吸附-洗脫重復(fù)實(shí)驗(yàn)后,樹脂對(duì)雞湯嘌呤的去除率由最初的66.7%下降至62.3%,樹脂在吸附-洗脫過程中對(duì)數(shù)值小幅降低,可能是由于每次再生過程都有微量的嘌呤物質(zhì)未被解吸,導(dǎo)致可用的活性位點(diǎn)略有降低。總體來說,經(jīng)過10次吸附-洗脫實(shí)驗(yàn),樹脂對(duì)雞湯嘌呤的去除率仍在60%以上,表明001×8樹脂具有很好的再生和重復(fù)利用效果,適合多次使用,具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

圖9 樹脂的再生循環(huán)次數(shù)Fig.9 Regeneration cycle times of resin

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)先以嘌呤去除率為指標(biāo)篩選適合降低崇仁麻雞湯嘌呤的樹脂,經(jīng)SEM掃描電鏡及FT-IR紅外光譜探測,相比吸附前的樹脂,吸附后的樹脂紅外光譜圖新增嘌呤的特征吸收峰,樹脂表面由光滑變得粗糙且出現(xiàn)較多不規(guī)則帶狀物,驗(yàn)證了001×8樹脂對(duì)嘌呤物質(zhì)具有特異性吸附作用,確定001×8離子交換樹脂作為后續(xù)研究樹脂。然后應(yīng)用單因素實(shí)驗(yàn)確定了各個(gè)因素的最佳條件,通過響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)確定了4個(gè)因素對(duì)崇仁麻雞湯嘌呤去除率的影響大小為樹脂用量>吸附溫度>吸附時(shí)間>振蕩速度。得到嘌呤吸附工藝條件為樹脂用量4 g、吸附時(shí)間4.4 h、吸附溫度15.4 ℃、振蕩速度120 r/min,此時(shí)樹脂對(duì)雞湯中嘌呤的吸附率可達(dá)65%以上。在此條件下考察樹脂的再生和重復(fù)利用性,經(jīng)過10 次吸附-脫附實(shí)驗(yàn),吸附率與脫附率依然保持在較高水平,表明 001×8樹脂具有很好的再生和重復(fù)利用效果,在嘌呤的去除應(yīng)用中具有很好的工業(yè)使用性能及使用壽命。