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        ROO·氧化對核桃蛋白結(jié)構(gòu)的影響

        2023-09-11 02:36:30王旭敏陳潔如王瑞狄建兵
        中國調(diào)味品 2023年9期
        關(guān)鍵詞:巰基溶解度核桃

        王旭敏,陳潔如,王瑞,狄建兵

        (山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,山西 晉中 030801)

        蛋白質(zhì)氧化第一次出現(xiàn)在人們的視野中是在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,后來慢慢引入食品領(lǐng)域,在醫(yī)學(xué)上,血漿、組織細(xì)胞中的蛋白質(zhì)被氧化后,蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)被破壞,發(fā)生變化,導(dǎo)致細(xì)胞功能受損[1]。在食品領(lǐng)域中,蛋白質(zhì)氧化是指在直接或間接氧化作用下,蛋白質(zhì)內(nèi)部發(fā)生變化,原本的共價結(jié)構(gòu)被破壞,發(fā)生改變,并且有分子間的鏈接、肽鏈斷裂等現(xiàn)象發(fā)生,使蛋白質(zhì)的功能特性進(jìn)一步惡化,風(fēng)味下降,營養(yǎng)損失[2]。

        近年來,使用植物蛋白代替動物蛋白引起人們的廣泛關(guān)注,植物蛋白對人體健康有生理調(diào)節(jié)作用,具有降低心血管疾病風(fēng)險、延長慢性腎病患者生命周期、預(yù)防糖尿病等作用[3]。我國是核桃種植及生產(chǎn)大國,2021年,我國核桃種植面積達(dá)1.2億畝,產(chǎn)量達(dá)540.4萬噸[4]。核桃蛋白營養(yǎng)均衡,深受大眾喜愛,是人們重點(diǎn)關(guān)注的植物蛋白資源,核桃蛋白富含活性肽,具有很好的抗氧化活性[5]。近年來,許多水解后的植物蛋白被加工成各種增加產(chǎn)品風(fēng)味的調(diào)味品[6],榨油后的核桃粕保留了核桃的主要營養(yǎng)成分,以核桃粕為原料生產(chǎn)核桃醬油,提高了核桃的綜合利用率,也為生產(chǎn)高檔醬油提供了方向[7]。

        脂質(zhì)過氧化是一個非常復(fù)雜的反應(yīng)過程,其主要的中間產(chǎn)物包括R·、RO·、ROO·等,在不同的氧化過程中,都有ROO·的存在與參與,它的存在使脂質(zhì)過氧化與蛋白質(zhì)氧化密切相連,而且ROO·的擴(kuò)散距離遠(yuǎn)、半衰期長,造成的損害也較大,因此常研究ROO·氧化對核桃蛋白的影響[8]。

        為了了解ROO·氧化對核桃蛋白的影響,本文利用不同濃度AAPH形成的不同程度的脂質(zhì)過氧化系統(tǒng)對核桃蛋白進(jìn)行了不同程度的氧化,對氧化后的不同指標(biāo)進(jìn)行了一系列分析,為抑制核桃蛋白氧化、提高核桃的綜合利用率提供了理論依據(jù)。

        1 材料、試劑與設(shè)備

        1.1 主要材料

        核桃粕粉:秋香核桃榨油后的粕粉。

        1.2 主要試劑

        實(shí)驗(yàn)試劑見表1。其他試劑均為實(shí)驗(yàn)室用分析純。

        表1 實(shí)驗(yàn)試劑Table 1 The experimental reagents

        1.3 主要設(shè)備

        實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備見表2。

        2 實(shí)驗(yàn)方法

        2.1 核桃分離蛋白的制備

        根據(jù)劉巖等[9]的方法略加修改,脫脂核桃粉與水按1∶26的比例混合,調(diào)節(jié)蛋白溶液的pH至11,磁力攪拌1.5 h,離心(5 000×g,20 min),用鹽酸調(diào)節(jié)上清液的pH,當(dāng)pH達(dá)到4.5時停止,室溫下磁力攪拌1 h,離心(9 000×g,20 min),得沉淀,用氫氧化鈉溶液將沉淀的pH調(diào)節(jié)至7.0,倒入液氮快速冷凍,在超低溫冰箱中放置24 h,取出放入真空凍干機(jī)進(jìn)行干燥,得到核桃分離蛋白,于4 ℃冰箱中保存。

        2.2 ROO·氧化蛋白的制備

        將2.1制得的分離蛋白用磷酸緩沖液配制成25 mg/mL的溶液備用,加入濃度分別為0,0.04,0.2,1,5,25 mmol/L的AAPH,放入恒溫振蕩器中,37 ℃、避光條件下振蕩24 h,取出后迅速放于冰浴中,使溫度快速降至4 ℃以下,將不同溶度的溶液各取出5 mL備用,隨后將溶液透析72 h,期間每6 h換一次水,目的是除去未參與反應(yīng)的AAPH,透析結(jié)束后用液氮快速冷凍,隨后放入凍干機(jī)中,獲得ROO·核桃氧化蛋白,于4 ℃冰箱中貯藏備用。

        2.3 回收率的測定

        取5 mL 2.2中的溶液進(jìn)行回收率的測定,將樣品離心(4 ℃、10 000×g、30 min),測定上清液中蛋白含量,計(jì)算回收率。

        2.4 溶解度的測定

        將2.2制得的核桃氧化蛋白配制成10 mg/mL的溶液,離心(25 ℃、10 000×g、20 min),取出上清液備用,測定上清液中蛋白含量,進(jìn)一步計(jì)算其溶解度。

        2.5 巰基含量的測定

        采用DTNB比色法[10]。稱取15 mg核桃ROO·氧化蛋白加入5 mL Tris-Gly-8 mol Urea緩沖液中,使用漩渦振蕩儀在高速模式下對其進(jìn)行振蕩分散,然后加入4 mg/mL的DTNB溶液50 μL,迅速搖勻,保溫30 min,以緩沖液為空白對照,測定其A412 nm,公式如下:

        式中:SH為巰基含量,μmol/g;c為蛋白質(zhì)溶液的濃度,mg/mL。

        2.6 粒徑、電位的測定

        將2.2制得的核桃氧化蛋白用配好的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行溶解,得到0.02%的蛋白溶液,離心(25 ℃、10 000×g、20 min),取上清液,過0.45 μm水膜,用納米粒度及Zeta電位分析儀進(jìn)行測定。

        2.7 表面疏水性的測定

        將2.2制得的ROO·核桃氧化蛋白溶解于PBS緩沖液中,配成1%的溶液,攪拌,離心(25 ℃、10 000×g、20 min),取上清液,測定其蛋白含量,繼續(xù)用磷酸鹽緩沖液對上清液進(jìn)行稀釋,稀釋后在其中再加入5 μL 8 mmol/L的ANS溶液,設(shè)定激發(fā)波長與吸收波長分別為395 nm和470 nm,測定熒光強(qiáng)度,用熒光強(qiáng)度對蛋白質(zhì)濃度作圖,曲線斜率即為蛋白質(zhì)表面疏水指數(shù)。

        2.8 二級結(jié)構(gòu)的測定

        稱取0.01 g核桃氧化蛋白,加入溴化鉀,研磨,壓片,采用傅里葉紅外光譜儀對核桃氧化蛋白進(jìn)行全波段掃描,對蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析[11]。

        2.9 內(nèi)源熒光光譜的測定

        將2.2制得的核桃氧化蛋白樣品溶解于10 mmol/L、pH 7.0的PBS緩沖液中,配制成1%的蛋白溶液,25 ℃離心(10 000×g,20 min),以PBS緩沖液為空白對照測定其光譜。熒光光譜為295 nm,發(fā)射光譜為300~400 nm[12]。

        2.10 數(shù)據(jù)處理分析

        每個實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn),使用SPSS 26.0、Origin 21.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析繪圖。

        3 結(jié)果與分析

        3.1 蛋白質(zhì)氧化對核桃氧化蛋白回收率的影響

        蛋白質(zhì)的回收率是影響其能否廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)的關(guān)鍵因素之一[13]。由圖1可知,當(dāng)樣品中不加入AAPH時,回收率為77.79%,AAPH濃度為0.04,0.2 mmol/L時,即低濃度氧化時,回收率略微升高,分別為80.67%、79.98%;當(dāng)核桃氧化蛋白中AAPH濃度達(dá)到1 mmol/L時,蛋白回收率達(dá)到最高,為87.56%;隨著AAPH濃度的進(jìn)一步提高,蛋白回收率出現(xiàn)快速下降的現(xiàn)象,下降到41.11%;當(dāng)濃度為25 mmol/L時,蛋白回收率降到最低值,為25.54%。由此可知,低濃度氧化能夠提高核桃蛋白的回收率,但是隨著氧化程度的逐漸加深,蛋白回收率明顯降低,蛋白結(jié)構(gòu)被破環(huán),蛋白變性,產(chǎn)生了不溶性聚集物,進(jìn)一步影響核桃蛋白在食品工業(yè)中的應(yīng)用。

        圖1 不同AAPH濃度對回收率的影響Fig.1 Effect of different AAPH concentrations on the recovery rate

        3.2 蛋白質(zhì)氧化對核桃氧化蛋白溶解度的影響

        溶解度通常指某種物質(zhì)在溶劑中的溶解程度,對功能特性有重要的影響,也常常被用來表示核桃蛋白的聚集程度。不同AAPH濃度對核桃氧化蛋白溶解度的影響見圖2。

        圖2 不同AAPH濃度對溶解度的影響Fig.2 Effect of different AAPH concentrations on the solubility

        由圖2可知,核桃氧化蛋白中不加入AAPH時,溶解度為77.59%,低濃度氧化時,蛋白溶解度升高,在AAPH濃度為0.2 mmol/L時溶解度達(dá)到最高,為92.12%;當(dāng)AAPH濃度進(jìn)一步增加,氧化程度進(jìn)一步加深,溶解度開始降低,最終下降到68.60%。由此可知,低濃度氧化可以提高溶解度,氧化進(jìn)一步進(jìn)行,溶解度開始降低。這可能是因?yàn)镽OO·可以氧化主肽鏈以及側(cè)鏈基團(tuán),使得疏水作用被改變,暴露出來的基團(tuán)相互作用,形成聚集體,繼續(xù)氧化,聚集體會再度聚集,溶解度上升;而當(dāng)AAPH濃度高、氧化加深時,聚集體會轉(zhuǎn)變成不溶性聚集物,溶解度會隨之降低。

        3.3 蛋白質(zhì)氧化對核桃氧化蛋白巰基含量的影響

        巰基在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中是一種比較重要的官能團(tuán),它不僅可以維持蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu),而且可以反映蛋白質(zhì)的變性程度[14],所以經(jīng)常用來評判蛋白質(zhì)的氧化程度。不同AAPH濃度對核桃氧化蛋白巰基含量的影響見圖3。

        圖3 不同AAPH濃度對巰基含量的影響Fig.3 Effect of different AAPH concentrations on the sulfhydryl content

        由圖3可知,當(dāng)核桃氧化蛋白中AAPH濃度越來越大時,巰基含量呈現(xiàn)下降的趨勢,從82.593 μmol/g最終下降到40.983 μmol/g??赡苁且?yàn)锳APH裂解,產(chǎn)生ROO·,其與游離巰基發(fā)生反應(yīng)后會生成一種新的物質(zhì)——亞磺酰基自由基,然后與氧分子結(jié)合,誘導(dǎo)蛋白質(zhì)氧化,巰基含量下降。

        3.4 蛋白質(zhì)氧化對核桃氧化蛋白粒徑的影響

        粒徑通常用來反映蛋白的聚集程度[15]。由圖4可知,核桃蛋白粒徑峰值都出現(xiàn)在300 nm左右。當(dāng)AAPH濃度為0.2 mmol/L時,峰值的范圍變寬,此時顆粒分布比較分散;當(dāng)AAPH濃度從0.2 mmol/L上升至1 mmol/L時,小的可溶性聚合體發(fā)生斷裂,生成了更小的小分子物質(zhì),出現(xiàn)粒徑變小的現(xiàn)象,氧化濃度增加時,可溶性部分發(fā)生共價交聯(lián)和非共價聚合,轉(zhuǎn)化為不溶性物質(zhì),粒徑變大;當(dāng)AAPH濃度達(dá)到25 mmol/L時,在接近1 000 nm處出現(xiàn)一個小峰,說明在高濃度氧化時,會導(dǎo)致不溶性物質(zhì)的出現(xiàn),聚集在一起,粒徑變大。

        圖4 不同AAPH濃度對粒徑的影響Fig.4 Effect of different AAPH concentrations on the particle size

        3.5 蛋白質(zhì)氧化對核桃氧化蛋白電位的影響

        由圖5可知,當(dāng)AAPH濃度從0 mmol/L上升到0.04 mmol/L時,Zeta電位并未發(fā)生顯著變化,當(dāng)AAPH濃度上升到1 mmol/L時,Zeta電位明顯降低,達(dá)到了-11.09 mV,AAPH濃度為5 mmol/L時,Zeta電位發(fā)生小幅度變化,上升為-7.53 mV。當(dāng)AAPH濃度為1 mmol/L時,Zeta電位絕對值最大,此時體系最穩(wěn)定,隨著氧化的進(jìn)一步加深,絕對值逐漸變小,吸引力明顯超過了排斥力,核桃蛋白體系的分散被破壞,發(fā)生凝聚現(xiàn)象,體系變得不穩(wěn)定。

        圖5 不同AAPH濃度對電位的影響Fig.5 Effect of different AAPH concentrations on the potential

        3.6 蛋白質(zhì)氧化對核桃氧化蛋白表面疏水性的影響

        疏水基之間的相互作用對于維持蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)是不可或缺的一環(huán),在天然蛋白質(zhì)中,疏水鍵的生成起到了避免水相的作用,從而疏水作用在蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和構(gòu)象中起著非常重要的作用[16]。通過對表面疏水性的測定與分析,可以得到疏水性氨基酸在其表面的分布情況[17]。不同AAPH濃度對核桃氧化蛋白表面疏水性的影響見圖6。

        圖6 不同AAPH濃度對表面疏水性的影響Fig.6 Effect of different AAPH concentrations on the surface hydrophobicity

        由圖6可知,表面疏水指數(shù)與AAPH濃度成反比。其原因可能是蛋白質(zhì)氧化導(dǎo)致構(gòu)象破壞、結(jié)構(gòu)展開、疏水基暴露,疏水基相互作用形成聚集體,疏水指數(shù)下降;或者氧化作用使核桃蛋白的結(jié)構(gòu)展開和重組,疏水基嵌入并形成新的親水基團(tuán),疏水指數(shù)下降[18]。

        3.7 蛋白質(zhì)氧化對核桃氧化蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響

        圖7 不同AAPH濃度對二級結(jié)構(gòu)的影響Fig.7 Effect of different AAPH concentrations on the secondary structure

        圖8 不同AAPH濃度在酰胺I帶處的影響Fig.8 Effect of different AAPH concentrations on the amide I band

        由圖7可知,不同AAPH濃度對紅外譜圖的走勢沒有大的影響,說明不同程度的蛋白質(zhì)氧化并未改變核桃蛋白中的特定基團(tuán)。對酰胺I帶進(jìn)行二階求導(dǎo),可以得到各個特征峰,其中1 612~1 641 cm-1處為β-折疊;1 641~1 656 cm-1處為無規(guī)則卷曲;1 656~1 664 cm-1處為α-螺旋;1 664~1 678 cm-1處為β-轉(zhuǎn)角;1 678~1 687 cm-1處為β-折疊;1 687~1 700 cm-1處為β-轉(zhuǎn)角[20]。

        由圖8可知,隨著AAPH濃度的增加,圖中的峰越發(fā)明顯,說明蛋白質(zhì)的氧化可以形成核桃蛋白聚集體,但當(dāng)AAPH濃度達(dá)到5,25 mmol/L時,即高濃度氧化時,圖譜發(fā)生變化,可能是因?yàn)楦邼舛妊趸沟煤颂业鞍纂逆湴l(fā)生變化,破裂,結(jié)構(gòu)進(jìn)一步發(fā)生變化。

        3.8 蛋白質(zhì)氧化對核桃氧化蛋白內(nèi)源熒光的影響

        內(nèi)源熒光光譜通常通過反映色氨酸殘基的微環(huán)境變化來表示蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化[21]。用芳香族氨基酸暴露的程度來表示熒光強(qiáng)度,并進(jìn)一步反映蛋白質(zhì)的三級構(gòu)象變化,當(dāng)芳香族氨基酸暴露較多時,熒光波長轉(zhuǎn)移到長波長處;當(dāng)更多發(fā)色團(tuán)嵌入時,熒光波長轉(zhuǎn)移到更短波長處[14]。不同AAPH濃度對核桃氧化蛋白內(nèi)源熒光的影響見表3。

        表3 不同AAPH濃度對內(nèi)源熒光的影響Table 3 Effect of different AAPH concentrations on the endogenous fluorescence

        由表3可知,當(dāng)AAPH濃度低于1 mmol/L時,最大吸收波長均在335 nm處,隨著AAPH濃度的增加,最大吸收波長發(fā)生藍(lán)移,可能是因?yàn)殡S著氧化的加深,色氨酸發(fā)生轉(zhuǎn)移,進(jìn)入到更加疏水的環(huán)境中。當(dāng)AAPH濃度增加時,熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)持續(xù)降低的趨勢,這可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)中的烷過氧自由基發(fā)生反應(yīng),使得分子聚集在一起,色氨酸殘基被包埋,顯示不出來,也有可能是因?yàn)橥檫^氧自由基對色氨酸殘基有熒光淬滅作用[22]。

        4 小結(jié)

        ROO·氧化改變了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。隨著AAPH濃度的增加,巰基含量與表面疏水指數(shù)呈現(xiàn)降低的趨勢,蛋白質(zhì)構(gòu)象被破壞,內(nèi)部結(jié)構(gòu)展開,發(fā)生結(jié)合,數(shù)值下降;回收率與溶解度均先上升后下降,都在1 mmol/L時達(dá)到最大值,說明低濃度氧化對核桃蛋白的回收率與溶解度都有一定的提升作用,但在高濃度氧化作用下,可溶性聚集物轉(zhuǎn)化成不溶性聚集物,回收率與溶解度開始降低;由粒徑結(jié)果可以看出,低濃度氧化時粒徑變小,這是由于小的可溶性聚集體斷裂,變成更小的小分子,隨著氧化濃度的增加,粒徑變大,可能是其中可溶性的部分通過共價交聯(lián)和非共價聚集轉(zhuǎn)變成不溶性物質(zhì);Zeta電位絕對值先升高后降低,說明適當(dāng)?shù)难趸沟煤颂业鞍左w系更加穩(wěn)定;高濃度氧化時,吸引力大于排斥力,核桃蛋白體系分散被破壞;由紅外光譜圖可以看出,低濃度氧化可以形成核桃蛋白聚集體,所以圖譜中的峰變得越發(fā)明顯,而在高濃度氧化時,蛋白質(zhì)肽鏈斷裂,結(jié)構(gòu)發(fā)生變化;由熒光結(jié)果可以看出,高濃度氧化時蛋白質(zhì)最大吸收波長發(fā)生藍(lán)移,蛋白質(zhì)內(nèi)部的色氨酸轉(zhuǎn)移到更加疏水的環(huán)境中,熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)持續(xù)降低的趨勢,說明烷過氧自由基導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子發(fā)生聚集,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化。

        近年來,對于核桃的研究都圍繞著的核桃蛋白進(jìn)行,張雪春等[23]研究了沒食子酸、兒茶素、楊梅素對核桃蛋白氧化穩(wěn)定性的影響,經(jīng)過氧自由基氧化后,核桃蛋白的功能性質(zhì)下降,經(jīng)過3種多酚干預(yù)后,一定程度上降低了核桃蛋白的氧化程度,其中兒茶素的效果最明顯。張雪春等[24]建立了羥自由基氧化體系,對核桃蛋白結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)行研究,結(jié)果表明適度的氧化可以改善核桃蛋白的乳化性能及起泡性能。孫領(lǐng)鴿等[25]采用不同濃度的丙二醛處理核桃蛋白,結(jié)果表明適度的氧化可以改變核桃蛋白的界面性質(zhì),過度氧化對核桃蛋白的泡沫性質(zhì)產(chǎn)生負(fù)面影響。本研究表明ROO·氧化對核桃蛋白的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定的影響,對核桃蛋白的綜合利用及貯藏有一定的理論意義。

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