■ 鮑 坤 趙海平 李光玉*

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東青島 266109；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林長春 130112）

傳統(tǒng)動物營養(yǎng)學(xué)主要研究的內(nèi)容包括養(yǎng)分消化吸收、養(yǎng)分的功效、飼料的營養(yǎng)價(jià)值評定以及動物的營養(yǎng)需要量等。受后基因時代的到來以及科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步的影響，宏觀層次的營養(yǎng)信息傳遞機(jī)制、營養(yǎng)物質(zhì)調(diào)節(jié)機(jī)制、環(huán)境對機(jī)體營養(yǎng)代謝影響的機(jī)制以及動物機(jī)體自我營養(yǎng)調(diào)控功能等多個方面的研究，正成為動物營養(yǎng)學(xué)研究的新領(lǐng)域[1]。內(nèi)源性代謝物的綜合評估是通過代謝組學(xué)來體現(xiàn)的，通過代謝組學(xué)可以實(shí)現(xiàn)來自生物樣品的代謝物及其相關(guān)代謝途徑的分離、檢測、表征和定量，以此來反映生物機(jī)體的營養(yǎng)狀況、營養(yǎng)代謝變化甚至一些疾病的發(fā)展程度等都可以通過代謝組學(xué)來體現(xiàn)。鐘偉等[2]研究了飼糧脂肪水平對3 歲生茸期梅花鹿?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)消化率、血清生化指標(biāo)及瘤胃液揮發(fā)性脂肪酸組成的影響，研究認(rèn)為飼喂脂肪水平為2%的飼糧，可滿足3 歲生茸期梅花鹿生產(chǎn)需求。此項(xiàng)研究確定了梅花鹿日糧中脂肪的適宜添加水平，同時也為共軛亞油酸（conjugated linoleic acids，CLA）在梅花鹿日糧中的添加水平提供了數(shù)據(jù)參考。

CLA 是一種功能強(qiáng)大的脂肪酸，CLA 進(jìn)入動物體后具體的代謝產(chǎn)物差異研究較少，尤其是在作為經(jīng)濟(jì)價(jià)值比較大的梅花鹿上，相關(guān)的研究并未有人開展。在我國，梅花鹿是一種重要的特種反芻家畜，可以提供鹿茸等重要的中藥產(chǎn)品。鹿茸是一種非常珍貴的中藥，鹿茸的品質(zhì)是影響鹿茸價(jià)格的主要因素。梅花鹿在2020 年進(jìn)入《國家畜禽遺傳資源目錄》后，梅花鹿產(chǎn)業(yè)發(fā)展迎來了新的歷史機(jī)遇。研究如何增加鹿茸產(chǎn)量，提高鹿茸品質(zhì)，增加養(yǎng)殖者的經(jīng)濟(jì)效益，為社會提供優(yōu)質(zhì)鹿茸，具有十分重要的社會意義。因此，本研究探討了飼糧添加不同水平CLA后，梅花鹿鹿茸中脂肪酸代謝產(chǎn)物的變化情況，明確了鹿飼糧中CLA適宜的添加水平，該研究結(jié)果將為CLA在提高鹿茸品質(zhì)和梅花鹿精細(xì)化飼養(yǎng)中的應(yīng)用提供科學(xué)理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

動物試驗(yàn)在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所茸鹿實(shí)驗(yàn)基地完成。采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇16 頭平均體重為（40.25±2.38）kg 的1 歲雄性梅花鹿，隨機(jī)分為4組，每組4頭鹿，組間體重差異不顯著（P＞0.05）。對照組（G0 組）飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組分別在基礎(chǔ)飼糧中添加0.25%（G1組）、0.50%（G2組）和1.00%（G3 組）的CLA。CLA 純度為99.99%，主要成分為順-10 和反-12-CLA。試驗(yàn)期80 d?；A(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)，%）

1.2 鹿茸采集

試驗(yàn)現(xiàn)場技術(shù)人員檢驗(yàn)鹿茸生長成熟并達(dá)到收茸標(biāo)準(zhǔn)后，適時收取鮮鹿茸。

1.3 標(biāo)品配制及樣品處理

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品配制

參照胡揚(yáng)清[3]的方法，并對方法進(jìn)行了改進(jìn)。11個混合標(biāo)準(zhǔn)濃度梯度分別為0.5、1、5、10、25、50、100、250、500、1 000、2 500 μg/mL，正己烷作為溶劑配制而成。母液于-80 ℃條件下保存，使用時的工作標(biāo)準(zhǔn)液要現(xiàn)配現(xiàn)用。37 種脂肪酸甲酯的標(biāo)準(zhǔn)品中各物質(zhì)信息及濃度占比情況如表2所示。

表2 脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品組成信息

1.3.2 樣品前處理

參照胡揚(yáng)清[3]的方法處理鹿茸。

1.3.3 GC-MS檢測

色譜條件如表3所示。質(zhì)譜條件為電子轟擊電離（EI）源，SIM 掃描模式，電子能量70 eV。

表3 色譜條件

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示。采用SAS（2008）軟件中的Duncan’s方法進(jìn)行多重比較和顯著性分析，其中P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法驗(yàn)證

2.1.1 總離子流色譜圖（TIC）

從圖1可以看出，共識別到34種脂肪酸。未檢測出C11：0 和C4：0，將兩組未分離的同分異構(gòu)體C18：1、C18：1T、C18：2 及C18：2TT 的濃度進(jìn)行合并計(jì)算。由于脂肪酸標(biāo)品與內(nèi)標(biāo)分離明顯，表明按照此方法建立的檢測條件良好。

圖1 色譜圖（上：空白；中：標(biāo)準(zhǔn)品；下：樣本）

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

通過氣質(zhì)聯(lián)用檢測脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)液的系列濃度，橫坐標(biāo)表示檢測的標(biāo)準(zhǔn)品濃度，縱坐標(biāo)表示標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值。表4 列出了檢測到的各脂肪酸的線性回歸方程，相關(guān)系數(shù)符合標(biāo)準(zhǔn)。

表4 34種脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸方程、精密度、重復(fù)性

2.1.3 精密度和重復(fù)性

精密度以RSD 表示，將混標(biāo)濃度為250 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)樣品連續(xù)進(jìn)樣五次，以此結(jié)果來計(jì)算精密度。從檢測到的精密度結(jié)果來看，儀器的精密度良好。表4列出了詳細(xì)的精密度結(jié)果。

按“1.3.2 樣本前處理”的步驟，重復(fù)處理樣本，計(jì)算重復(fù)性。表4列出了詳細(xì)的重復(fù)性檢測結(jié)果。

2.2 鹿茸脂肪酸定量檢測結(jié)果

根據(jù)建立的樣品前處理及儀器分析方法，對所有鹿茸樣品進(jìn)行定量分析。檢測結(jié)果如表5所示。

表5 鹿茸脂肪酸定量檢測結(jié)果（μg/g）

檢測了鹿茸中37 種脂肪酸的含量，丁酸（C4：0）和十一酸（C11：0）未檢測出，其余各脂肪酸均有檢出。在檢測出的脂肪酸中，中鏈脂肪酸（碳鏈中碳原子6～12 個）含量各組間差異不顯著（P＞0.05），且含量變化規(guī)律不明顯；對長鏈脂肪酸而言，鹿茸中大部分脂肪酸含量不受飼糧添加CLA 的影響（P＞0.05），僅有棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、反式油酸、亞油酸和反式亞油酸受飼糧中添加CLA 的顯著影響，由于添加CLA 后，鹿茸中的以上脂肪酸含量均顯著高于對照組（P＜0.05），其中棕櫚油酸、硬脂酸、油酸和亞油酸含量達(dá)到差異極顯著水平（P＜0.01），而當(dāng)添加量為0.50%時，各組鹿茸中脂肪酸含量最高；添加CLA后，二十碳二烯酸和花生四烯酸含量亦明顯增加（P＜0.05），尤以0.50%添加組含量最高。其余各長鏈脂肪酸含量差異不顯著（P＞0.05），但基本上可以看出明顯的變化規(guī)律，即添加CLA 后，鹿茸中長鏈脂肪酸的含量除二十碳烯酸、二十碳三烯酸外均有所增加。

2.3 對鹿茸脂肪酸組成的影響

由表6 可以看出，飼糧添加CLA 后鹿茸中多不飽和脂肪酸（PUFA）和飽和脂肪酸（SFA）所占比例均有所提高，其中G2 組與對照組相比達(dá)到差異顯著水平（P＜0.05）；單不飽和脂肪酸（MUFA）所占比例下降，其中G2組與對照組相比達(dá)到差異顯著水平（P＜0.05）。

表6 飼糧CLA水平對鹿茸脂肪酸組成的影響（%）

3 討論

化學(xué)分析法、平衡試驗(yàn)、消化代謝試驗(yàn)以及飼養(yǎng)試驗(yàn)技術(shù)等傳統(tǒng)的動物營養(yǎng)分析手段，已不能滿足人們在動物營養(yǎng)研究領(lǐng)域的技術(shù)需求[4-5]。復(fù)雜的生物反應(yīng)過程以及代謝通路中的代謝規(guī)律，可以通過代謝組技術(shù)來揭示，這種方法可以有效地開發(fā)潛在的營養(yǎng)評定生物標(biāo)記物，是動物營養(yǎng)研究的一個新領(lǐng)域[6-7]。靶向代謝組學(xué)（targeted metabolomics）主要應(yīng)用的技術(shù)手段為氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)，其顯著特點(diǎn)是特異性強(qiáng)、檢測靈敏度高和定量準(zhǔn)確等。GC-MS 技術(shù)適用于檢測分子質(zhì)量比較小的代謝物，標(biāo)準(zhǔn)譜的圖庫比較完整、分辨率高以及分離效果好是GC-MS 技術(shù)的主要優(yōu)點(diǎn)。分析成功的關(guān)鍵因素是準(zhǔn)確度、高通量和可靠性。

在動物營養(yǎng)領(lǐng)域，靶向代謝組學(xué)技術(shù)已經(jīng)得到了較大范圍的推廣和應(yīng)用，代謝組學(xué)可以研究營養(yǎng)干預(yù)對內(nèi)源性代謝物變化的影響，通過調(diào)整營養(yǎng)干預(yù)促使動物達(dá)到最佳健康狀況。動物體內(nèi)正常的代謝平衡失調(diào)，有時是由于營養(yǎng)物質(zhì)攝入不足或過多引起的，動物營養(yǎng)研究中必須要面對的問題是考量和制定動物對營養(yǎng)的需要量標(biāo)準(zhǔn)[8]。在單胃動物上，肖英平[9]研究了早期斷奶仔豬飼糧中補(bǔ)充谷氨酰胺對血清代謝物的影響，應(yīng)用GC-MS 代謝組學(xué)技術(shù)研究了谷氨酰胺對仔豬生長發(fā)育中的作用機(jī)理，同時發(fā)現(xiàn)了仔豬在早期斷奶下碳水化合物、氨基酸和脂質(zhì)的代謝途徑?；贕C-MS 代謝組學(xué)技術(shù)，Zhou 等[10]研究觀察發(fā)現(xiàn)，豬長期采食蛋白含量低的飼糧后，顯著影響了異戊酸酯和異丁酸酯的濃度，表明這2 種物質(zhì)可能為豬的蛋白質(zhì)需要量的確定提供參考依據(jù)。以上試驗(yàn)表明，構(gòu)建基于代謝標(biāo)識物的營養(yǎng)需要量評估模型，通過代謝組學(xué)技術(shù)可以對動物營養(yǎng)物質(zhì)的需要量進(jìn)行輔助評價(jià)和科學(xué)描述。

關(guān)于鹿茸中脂肪酸的代謝的研究，主要集中在近五年。劉文媛[11]首次對商業(yè)上劃分的鹿茸4 個區(qū)段（蠟片、粉片、蜂片、骨片）進(jìn)行了代謝組學(xué)研究，通過代謝組學(xué)手段研究將認(rèn)為，鹿茸4 個區(qū)段的高表達(dá)量代謝物主要是脂肪酸，脂肪酸是鹿茸4 個相鄰區(qū)段的主要差異代謝物。王燕華等[12]進(jìn)行了不同加工方式及不同部位區(qū)段脂肪酸的氣相色譜法分析，研究發(fā)現(xiàn)，排血鹿茸中的脂肪酸含量高于帶血鹿茸，凍干加工的鹿茸中的脂肪酸含量高于煮炸處理鹿茸；鹿茸中飽和脂肪酸以棕櫚酸和硬脂酸為主，單不飽和脂肪酸主要為油酸，多不飽和脂肪酸組分中亞油酸、亞麻酸、二十碳二烯酸、花生四烯酸的量較高，沒有檢出含量較低的短鏈脂肪酸和中鏈脂肪酸。劉松鑫等[13]利用代謝組技術(shù)，研究了梅花鹿頭茬鹿茸和二茬鹿茸中脂肪酸的含量情況，研究結(jié)果表明2 種鹿茸中均檢測到25 種脂肪酸，其含量在5.89～3 964.85 mg/kg。頭茬鹿茸、二茬鹿茸中脂肪酸的總量分別為13.01、11.64 g/kg，頭茬鹿茸中脂肪酸含量顯著高于二茬鹿茸脂肪酸的含量（P＜0.05）。頭茬茸和二茬茸中SFA 主要成分相似，均以棕櫚酸和硬脂酸為主，約占脂肪酸總量的30.15%、17.73%；MUFA 主要成分亦相似，均以油酸（C18：1，cis-9）為主，約占脂肪酸總量的20.27%；PUFA 均以亞油酸（C18：2，cis-9，12）、花生四烯酸（C20：4，cis-5，8，11，14）為主，分別占脂肪酸總量的7.09%、6.16%。劉松鑫等[14]對不同形態(tài)梅花鹿茸中脂肪酸含量進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明鹿茸中的脂肪酸組成具有一定的規(guī)律。毛桃茸、二杠茸、三杈茸含有的脂肪酸種類有所差異，三杈鹿茸脂肪酸種類較多。三種鹿茸中飽和脂肪酸均以C16：0 和C18：0 為主，單不飽和脂肪酸均以C18：1，cis-9為主，多不飽和脂肪酸均以C18∶2，cis-9，12、C20：4，cis-5，8，11，14為主。

本試驗(yàn)利用靶向代謝組技術(shù)檢測了毛桃鹿茸中37 種脂肪酸的含量，其中丁酸和十一酸未檢測出，其余35 種脂肪酸均有檢出。從檢測結(jié)果可以看出，相對于長鏈脂肪酸，中鏈脂肪酸含量比較低。對長鏈脂肪酸而言，鹿茸中僅有棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、反式油酸、亞油酸和反式亞油酸受飼糧中添加CLA 的顯著影響，由于添加CLA 后，鹿茸中的以上脂肪酸含量均極顯著高于對照組（P＜0.01），其中棕櫚油酸、硬脂酸、油酸和亞油酸含量達(dá)到差異極顯著水平（P＜0.01），而添加量為0.5%時，各組鹿茸中脂肪酸含量最高；添加CLA 后，二十碳二烯酸和花生四烯酸含量亦明顯增加（P＜0.05），尤以0.5%添加組含量最高。其余各長鏈脂肪酸含量差異不顯著（P＞0.05）。此結(jié)果與劉松鑫等[14]研究結(jié)果稍有不同，主要體現(xiàn)在檢測出的脂肪酸種類有所增加，這說明梅花鹿飼糧中添加CLA 能夠增加鹿茸中脂肪酸的種類，進(jìn)而提升鹿茸的品質(zhì)。

同時統(tǒng)計(jì)了鹿茸中MUFA、PUFA 和SFA 所占比例，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明飼糧添加CLA 后鹿茸中PUFA 和SFA 所占比例均有所提高，MUFA 所占比例下降。在其他動物中的多項(xiàng)研究表明，飼糧添加CLA能夠改變脂肪酸在動物組織或產(chǎn)品中所占的比例。Ahn 等[15]研究了CLA 對白萊航蛋雞蛋黃脂肪酸組成的影響，研究結(jié)果表明隨著飼糧CLA 含量的提高，蛋黃中的SFA 的含量逐漸增加，而MUFA 含量逐漸降低。其他學(xué)者也發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果[16-17]。以上試驗(yàn)結(jié)果均可以說明飼糧添加CLA 確實(shí)具有改變動物產(chǎn)品中SFA 與MUFA 比例的生理效應(yīng)。CLA 如何抑制MUFA 合成的具體機(jī)制目前還不清楚。Choi 等[18]在小鼠上的試驗(yàn)結(jié)果表明，硬脂酞輔酶A 去飽和酶（SCD）基因的表達(dá)顯著地受到反-10，順-12 CLA 的抑制，使得SCD 的活性降低。而硬脂酰輔酶A 去飽和酶是體內(nèi)SFA 向MUFA 轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶。猜測可能是由于CLA 降低了SCD 的生物活性，SFA 向MUFA 的轉(zhuǎn)化受阻，使SFA在鹿茸內(nèi)蓄積，含量升高。但是在鹿科動物方面，幾乎未見到類似報(bào)道。CLA 是否能夠抑制鹿茸中SCD的活性，進(jìn)而影響了SFA 與MUFA 的比例，仍需要進(jìn)一步研究和探討。

研究表明，飼糧添加CLA 對動物產(chǎn)品中的PUFA和SFA 的沉積有促進(jìn)作用。齊明江等[19]研究了飼糧中添加CLA 對灘羊二毛期羔羊肉品質(zhì)及不同部位脂肪酸含量及種類的影響，研究認(rèn)為CLA對肌肉脂肪酸組成有改善作用，提高了羊尾、背長肌中PUFA 和SFA的含量。而尚秀國[17]在蛋雞上的研究表明，隨著飼糧中CLA 添加量的提高，蛋黃中多PUFA 的總量呈線性提高的趨勢。本試驗(yàn)的研究結(jié)果與以上研究結(jié)果相似。飼糧添加CLA 促進(jìn)了PUFA 和SFA 在鹿茸中的沉積。據(jù)報(bào)道，PUFA 具有降血脂、預(yù)防心腦血管疾病、促進(jìn)生長發(fā)育、抗氧化、抗衰老等功效。試驗(yàn)鹿茸中測得的PUFA 有11 種，主要以C18：2 和C18：2TT為主，含量占PUFA 總量的比重較大，作為鹿茸中的主要營養(yǎng)成分之一，其含量的沉積對鹿茸品質(zhì)的提升有積極的促進(jìn)作用，尤以0.5% CLA 添加組的效果最為明顯。

4 結(jié)論

梅花鹿飼糧中添加CLA 能夠增加鹿茸中脂肪酸的含量，其中棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、反式油酸、亞油酸、反式亞油酸、二十碳二烯酸和花生四烯酸含量顯著增加。鹿茸中PUFA 和SFA 所占比例亦明顯增加。鹿茸中PUFA 的沉積對鹿茸品質(zhì)的提升有積極的促進(jìn)作用，其中CLA添加量為0.5%時效果最為明顯。