■ 石 艷 彭 昊 李 珣 李 軍 李常挺 白慧麗 馬春霞 廖玉英*

（1.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530004；2.廣西獸醫(yī)研究所，廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530001）

在畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn)中，抗生素等抗菌藥物在預(yù)防疾病、治療疾病以及促進(jìn)動物生長中都發(fā)揮著極其重要的作用[1]。但近年來，抗生素的濫用導(dǎo)致了其殘留于肉產(chǎn)品或者糞污之中，最終通過食物鏈傳播，從而影響人類的健康[2]。我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部于2020年7月發(fā)布194 號公告，要求在飼料中全面禁止添加促生長類抗生素[3]。因此，亟需尋找代替抗生素的新型抗菌藥物以預(yù)防或治療動物疾病。此外，遵循科學(xué)、綠色養(yǎng)殖是畜禽養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要一步。益生菌作為“有助于腸道微生物平衡的生物體和物質(zhì)”的新型微生物制劑[4-5]，可以通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、限制病原體定植、控制炎癥性腸道疾病和代謝性疾病來影響免疫系統(tǒng)[6]。在預(yù)防或治療動物疾病等方面可作為抗菌藥物的良好代替品。

布氏乳桿菌（Lentilactobacillus buchneri）是一種自然存在于不同生態(tài)環(huán)境中的益生菌，通常與食品生產(chǎn)和發(fā)酵過程有關(guān)[7]。其具有獨(dú)特的代謝途徑，在厭氧和酸性條件下可將乳酸轉(zhuǎn)化為乙酸和1,2-丙二醇，有助于維持細(xì)胞活力[8]。這些特性使得布氏乳桿菌在許多農(nóng)場中成為一種有用的發(fā)酵劑，此外，布氏乳桿菌還可以防止霉菌和酵母引起的需氧變質(zhì)[9-12]。目前關(guān)于布氏乳桿菌的報道，多數(shù)都是在研究布氏乳桿菌發(fā)酵青貯飼料，而布氏乳桿菌益生特性及安全性研究鮮有報道。因此，本研究通過測定體外抑菌能力、生長曲線、產(chǎn)酸能力、耐酸、耐高溫及耐膽鹽等試驗(yàn)評估其益生特性，通過小鼠安全性試驗(yàn)以評估其生物安全性，以期為未來布氏乳桿菌在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株來源與試驗(yàn)動物

布氏乳桿菌GXNN20210328-6（以下簡稱GX0328-6），分離于廣西地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵食品酸菜中并保種于廣西獸醫(yī)研究所。4 周齡C57BL/6 小鼠20 只，無特定病原體（SPF）級，體重（15±2）g，購于長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，自由采食和飲水。

1.1.2 指示菌及試驗(yàn)試劑

大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC25922）及金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC6583），購于中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心；鼠傷寒沙門氏菌（SM022），由美國杜克大學(xué)分子遺傳學(xué)和微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室惠贈。培養(yǎng)基（MRS、LB、MH）及肉湯（MRS、LB），均購于北京陸橋技術(shù)股份有限公司；PBS 緩沖液，購于南京森貝伽生物科技有限公司；4%多聚甲醛，購自北京蘭杰柯科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒，購于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.1.3 儀器設(shè)備

電熱恒溫培養(yǎng)箱，購自上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司；2.5 L 厭氧產(chǎn)氣包，購自青島海博生物技術(shù)有限公司；可見分光光度計，購自上海棱光技術(shù)有限公司；pH 計購自上海Methler toledo 儀器有限公司；正置光學(xué)顯微鏡購自尼康映像儀器銷售有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)菌株的培養(yǎng)方法

取已分離純化后的GX0328-6 按5%接種量接種至含有MRS肉湯的15 mL無菌試管中，將已接種的菌懸液放入2.5 mL的厭氧產(chǎn)氣包中，于37 ℃下培養(yǎng)24 h。

1.2.2 體外抑菌試驗(yàn)

無菌條件下三種指示菌懸液分別取200 μL 涂布于MH 固體培養(yǎng)基上，將牛津杯置于已接種指示菌的MH 固體培養(yǎng)基內(nèi)，取200 μL GX0328-6 菌懸液放入牛津杯內(nèi)，4 ℃ 冰箱過夜。待菌懸液充分?jǐn)U散后，于37 ℃ 下培養(yǎng)24 h。用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，最終求3次試驗(yàn)的平均值。

1.2.3 生長曲線及產(chǎn)酸能力測定

參照謝曈等[13]的益生菌產(chǎn)酸能力測定方法，取5 mL 已純化的GX0328-6 菌懸液于45 mL 的MRS 肉湯中，37 ℃、160 r/min 條件下培養(yǎng)，分別在0、4、8、12、16、20、24、28 h取樣以評價其產(chǎn)酸能力及菌體生長繁殖能力。

1.2.4 耐酸試驗(yàn)

取200 μL純化的GX0328-6菌懸液接種至10 mL MRS 肉湯中，37 ℃靜置培養(yǎng)至對數(shù)期。將菌體懸浮于等體積、pH 分別為2.0、2.5、3.0、3.5、7.4的MRS肉湯中，37 ℃培養(yǎng)，分別于0、2、4、6 h 取樣，取100 μL GX0328-6 菌懸液均勻涂布于MRS 固體培養(yǎng)基上，37 ℃ 培養(yǎng)，24 h后活菌計數(shù)。

1.2.5 耐高溫試驗(yàn)

前處理方法同1.2.4，將菌體懸浮于等體積的MRS中，于37、40、50、60、70、80 ℃分別培養(yǎng)0、30、60、90 min后取樣檢測。

1.2.6 耐膽鹽試驗(yàn)

前期處理方法同1.2.5，將菌體懸浮于等體積、豬膽鹽濃度為0、0.1%、0.3%、0.5%、1.0%、1.5%的PBS中，37 ℃恒溫振蕩器培養(yǎng)，于0、2、4、6 h 分別取樣檢測。以0 h的活菌數(shù)為對照。

存活率（%）=A2/A1×100

式中：A1——在不同膽鹽濃度的PBS緩沖液中培養(yǎng)0 h的活菌數(shù)（CFU/mL）；

A2——在不同膽鹽濃度的PBS溶液中培養(yǎng)2、4、6 h的活菌數(shù)（CFU/mL）。

1.2.7 小鼠安全性試驗(yàn)

20 只小鼠適應(yīng)環(huán)境7 d 后隨機(jī)分為兩組，對照組（CON 組）：每只小鼠灌胃0.2 mL 生理鹽水，試驗(yàn)組（LB 組）：每只灌胃0.2 mL 濃度為1×109CFU/mL 的GX0328-6 活菌液，持續(xù)10 d[14]。自由采食和飲水。每隔2 d于灌胃前記錄小鼠體重、毛色、整體精神狀態(tài)及糞便形態(tài)。10 d 后，安樂死小鼠并取其胸腺、脾臟稱重，計算免疫器官指數(shù)；采集肝臟、空腸及結(jié)腸組織放于4%多聚甲醛中固定，石蠟切片制作，蘇木精-伊紅（H.E.）染色，顯微鏡下觀察小鼠肝臟及腸道組織形態(tài)學(xué)變化。

免疫器官指數(shù)（%）=100×免疫器官重（g）/小鼠體重（g）

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用SPSS25.0 進(jìn)行平均值、T檢驗(yàn)及two-way ANOVA 分析，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義；使用GraphPad Prism 8.4.2軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果

由表1 可知，GX0328-6 對三種指示菌均有抑菌效果，尤其對鼠傷寒沙門氏菌其抑菌效果最佳，抑菌圈可達(dá)17.5 mm。

表1 GX0328-6的體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果（mm）

2.2 GX0328-6的生長曲線及產(chǎn)酸試驗(yàn)結(jié)果

如圖1所示，GX0328-6在0～4 h為遲緩期，4～20 h對數(shù)生長期，20 h 后為穩(wěn)定期。自開始GX0328-6 生長培養(yǎng)液pH 逐漸降低，0～8 h pH迅速下降，8～20 h趨于平穩(wěn)，20 h后再一次迅速下降。

圖1 GX0328-6 的生長曲線及其產(chǎn)酸能力

2.3 GX0328-6的耐酸結(jié)果

如圖2所示，GX0328-6活菌數(shù)在0～6 h、pH 為7.4的環(huán)境下穩(wěn)定性最好；在0～6 h、pH 為2.5、3.0、3.5 的環(huán)境下呈劑量依賴性下降。此外，在pH 為3.0 及3.5的環(huán)境下，GX0328-6的活菌數(shù)在4 h內(nèi)損耗較少。當(dāng)pH為2，在2～6 h時GX0328-6活菌數(shù)已完全失活。

圖2 GX0328-6在不同pH下的耐受情況

2.4 GX0328-6的耐膽鹽結(jié)果

如圖3 所示，膽鹽濃度保持不變時，GX0328-6 存活率隨時間的延長而降低。此外時間相同時，GX0328-6 存活率呈濃度依賴性，隨著濃度的增加而降低。2 h 時，GX0328-6 存活率在膽鹽濃度為0.1%、0.3%、0.5%的膽鹽環(huán)境下仍能達(dá)到50%以上。

圖3 GX0328-6在不同豬膽鹽濃度下的活菌存活率

2.5 GX0328-6的耐高溫結(jié)果

如圖4所示，GX0328-6在40～60 ℃高溫下90 min活菌數(shù)大于6 CFU/mL 仍能保持較高的活性；在70 ℃高溫下60 min 時及80 ℃高溫下30 min 時仍能存活，但80 ℃ 60 min后完全失活。

圖4 GX0328-6在不同溫度下的耐受情況

2.6 GX0328-6的安全性試驗(yàn)結(jié)果

2.6.1 小鼠體重變化免疫器官指數(shù)變化

安全性試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)CON 組（連續(xù)灌胃生理鹽水10 d）與LB組（連續(xù)灌胃GX0328-6 10 d）小鼠的毛色、精神狀態(tài)和糞便均正常。剖檢觀察發(fā)現(xiàn)，兩組小鼠腹腔內(nèi)肝臟、脾臟等主要器官均無明顯肉眼可見病變。如圖5a 和圖5b 所示，與CON 組相比，LB 組小鼠體重及免疫器官指數(shù)均未顯著下降（P＞0.05）。

圖5 GX0328-6對小鼠體重及免疫器官的影響

2.6.2 小鼠組織切片

如圖6 所示，CON 組與LB 組的小鼠肝臟組織均完整，清晰可見肝索，肝臟組織均無明顯病變。由圖7所示，CON 組與LB 組的小鼠空腸及結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)完整，均未見明顯病理變化，腸道絨毛完整。

圖6 GX0328-6對小鼠肝臟組織的影響（10×）

圖7 GX0328-6對小鼠腸道組織的影響（10×）

3 討論

金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及鼠傷寒沙門氏菌引起的感染不僅給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，還嚴(yán)重威脅人類健康[15-17]。越來越多的國家要求禁止在食用性動物的飼料中添加抗生素，而目前作為抗生素的替代品，益生菌已被廣泛研究[18-20]。研究發(fā)現(xiàn)，益生菌可以通過產(chǎn)生代謝物或抗菌化合物[21]、改變胃腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)、抑制食源性病原體的產(chǎn)生等方式促進(jìn)機(jī)體腸道微生物群的平衡[22-23]。益生菌的益生特性是評估益生菌生物活性的重要因素，而具有潛在益生特性的益生菌需要具備耐酸性、膽鹽耐受性、無獲得性耐藥、對潛在致病菌有抗菌活性等特點(diǎn)[24]。本試驗(yàn)通過檢測GX0328-6 的抑菌能力、生物學(xué)特性及安全性以研究GX0328-6的益生潛力。

布氏乳桿菌可產(chǎn)生細(xì)菌素、有機(jī)酸等抗菌物質(zhì)，表現(xiàn)出廣譜抑菌活性[25-26]。貢漢生等[27]報道，從傳統(tǒng)乳制品中分離的布氏乳桿菌對這大腸桿菌、沙門氏菌及金黃色葡萄球菌均有抑菌效果，且對金黃色葡萄球菌及沙門氏菌抑菌效果最佳。這與本試驗(yàn)中從傳統(tǒng)發(fā)酵食品酸菜中分離出的GX0328-6的試驗(yàn)結(jié)果一致。本試驗(yàn)中，GX0328-6 對三種指示菌均有不同的抑菌作用，尤其是對鼠傷寒沙門氏菌的抑菌效果最強(qiáng)，抑菌圈高至17.50 mm。此外，測定微生物生長和代謝產(chǎn)物生成曲線有助于微生物制劑研制中對數(shù)生長期和穩(wěn)定期的選擇及了解微生物的生長特性[28]。由于對數(shù)生長期的菌株活力較好，益生菌制劑的制備及使用通常選取該時期的菌[29]。研究表明，乳酸菌在37 ℃下培養(yǎng)6～16 h 為對數(shù)生長期[30]。在本試驗(yàn)中，GX0328-6在37 ℃培養(yǎng)4 h即可進(jìn)入對數(shù)生長期且持續(xù)時間長。在環(huán)境適宜的情況下乳酸菌能迅速繁殖,并能分泌大量有機(jī)酸類,使發(fā)酵液pH 迅速下降[31]。GX0328-6在0～8 h 時pH 緩慢下降，在8～20 h 時變化比較平穩(wěn)，此時正是其生長對數(shù)期，于20 h 后又開始緩慢降低。GX0328-6的產(chǎn)酸能力不顯著。布氏乳桿菌可產(chǎn)生細(xì)菌素或有機(jī)酸等抗菌物質(zhì)[25-26]，而本研究中GX0328-6 產(chǎn)酸能力不顯著，但他卻能表現(xiàn)出廣譜的抑菌活性。提示GX0328-6的抑菌機(jī)制可能是產(chǎn)生細(xì)菌素等抗菌物質(zhì)以抑制病原菌的生長，但其抑菌機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

益生菌對酸性環(huán)境及膽鹽耐受性也是其益生特性的重要指標(biāo)，益生菌需通過胃酸環(huán)境到達(dá)機(jī)體消化吸收的主要場所小腸，小腸的腸腔內(nèi)為膽鹽環(huán)境[32]。因此，益生菌能否在胃腸道存活取決于其對胃腸道環(huán)境中酸和膽鹽的耐受能力[33]。本試驗(yàn)中，0～4 h 時，GX0328-6在pH為2.5～3.5的環(huán)境下降較緩慢，于4 h時還能保持較高濃度的活菌數(shù)。在0～4 h 時，GX0328-6 在0.1%、0.3%膽汁酸鹽環(huán)境下存活率在50%以上，具有較高的存活率。該特性保證了GX0328-6在胃腸道環(huán)境存活的可能。GX0328-6 在膽鹽濃度中的存活率呈濃度依賴性降低，這可能與高膽鹽濃度在細(xì)胞外產(chǎn)生高滲透壓導(dǎo)致菌株耐受力下降有關(guān)[34]。盡管益生菌耐高溫試驗(yàn)的研究相對比較少，但研究表明菌株耐高溫能力的比較反映了菌種在后期儲存、加工過程中的穩(wěn)定性[13]。因此，本試驗(yàn)測定了GX0328-6 在高溫環(huán)境下的耐受性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GX0328-6 在40～60 ℃高溫下孵育90 min 仍能保持較高的活性。在70 ℃高溫下60 min時及80 ℃高溫下30 min時仍能存活。提示GX0328-6 具有較高的高溫耐受能力，這表明GX0328-6在存儲及加工過程中具有較大的優(yōu)勢。綜上GX0328-6具有潛在的益生潛力。

盡管GX0328-6 具有潛在的益生特性，但其安全性也是不可忽視的。益生菌候選菌株的必備前提條件是具備良好的生物安全性能[35]。歐盟專家組認(rèn)為，將布氏乳桿菌添加至飼料中，能產(chǎn)生較多的乙酸并提高飼料的有氧穩(wěn)定性，延長飼料的保存期[36]。但布氏乳桿菌飼喂后對動物機(jī)體的安全性卻鮮少有報道。研究報道，干酪IMV B-7280 菌株在小鼠口服給藥后是安全的，并對腸道微生物群具有積極影響[37]。朱廣素等[38]研究發(fā)現(xiàn)飼喂青春雙歧桿菌Z25 和羅伊氏乳桿菌138-1 對妊娠期大鼠生殖功能及胚胎形成無影響，未見胎仔內(nèi)臟和外觀畸形。本試驗(yàn)給小鼠持續(xù)灌胃10 d GX0328-6，發(fā)現(xiàn)其對小鼠生長和飲食均無不良影響，小鼠的生理狀態(tài)及糞便形狀均正常，未出現(xiàn)腹瀉等癥狀，且小鼠活潑，無精神沉郁等不良癥狀，無發(fā)病和死亡。此外，小鼠免疫器官指數(shù)及體重變化與對照組相比無顯著差異。研究表明，益生菌對斷奶仔豬的平均日增重和飼料利用率具有顯著的促進(jìn)作用[39]，本試驗(yàn)在灌胃GX0328-6 菌液第4 天后，發(fā)現(xiàn)與CON 組相比，LB 組的體重呈增加的趨勢，但無顯著差異。推測這可能與飼喂時間過短有關(guān)。通過形態(tài)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)GX0328-6 對小鼠體內(nèi)臟器均無影響，肝臟組織H.E.染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠肝索清晰，肝細(xì)胞完整，無細(xì)胞變性、炎性病灶及充血等病理現(xiàn)象；小鼠腸道組織切片結(jié)果顯示小鼠空腸及結(jié)腸絨毛未有損傷，紋狀緣較完整。上述結(jié)果均表明GX0328-6對小鼠具有安全且無致病性的特征。

4 結(jié)論

綜上所述，GX0328-6具有良好的生長特性，在高溫、高膽鹽及強(qiáng)酸環(huán)境下具有良好的耐受性及安全無致病性等特性。GX0328-6的分離鑒定可為控制病原菌的益生菌制劑的開發(fā)提供一個選擇，同時也為后期試驗(yàn)提供研究基礎(chǔ)。